Misurazione del metabolismo energetico in tessuto retinico Explanted usando l'analisi di flusso extracellulare

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave come come il metabolismo energetico nel tessuto retinale differisce tra campioni biologici o dopo l'esposizione ad agenti farmacologici. Il principale vantaggio di questa tecnica è che utilizza tessuto retinico organotipico espiantato per misurare i tassi sia di glicolisi che di fosforilazione ossidata e consente valutazioni di interventi in tempo reale in vitro. Per calibrare la strumentazione per un saggio di flusso extracellulare, aggiungere prima un millilitro di soluzione di calibrazione a ciascun pozzo della cartuccia del sensore a 24 pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore privo di Co2 durante la notte.

Additivi di carico per il protocollo di sollecitazione mitocondriale, o il protocollo di glicolisi in ogni porta dell'iniettore sulla cartuccia del sensore, regolando per le variazioni di volume nel pozzo. Supponendo un volume iniziale di 450 microlitri, un test tipico includerebbe 45 microlitri di un additivo nella prima porta dell'iniettore, 49,5 microlitri nel secondo, 54,5 microlitri nel terzo e 60 microlitri fino all'ultimo. Durante i primi esperimenti, caricare il supporto di base nella porta A per misurare la quantità di artefatto di movimento tissutale che si verifica dopo un'iniezione di porta.

Lasciare incubare la piastra del sensore caricata a 37 gradi Celsius in un incubatore non co2 per almeno 60 minuti. Inizia l'isolamento del tessuto retinale del topo fresco con un topo appena eutanasiato. Utilizzare un paio di forcep curve di medie dimensioni per afferrare il globo posteriore al nervo ottico e applicare delicatamente la pressione in avanti per proptosare l'occhio.

Con una lama di rasoio pulita, crea un'incisione da limbo a limbo attraverso la cornea usando un unico passaggio deliberato della lama. Usando forcep in stile McPherson angolato fine, pizzicare il globo posteriore per esprimere la lente e le membrane iloidi anteriori dall'incisione corneale. Ripeti la manovra di pizzicamento con le forcep per esprimere la retina neurale.

Quindi, usa le grana come un cucchiaio per sollevare la retina lontano dall'incisione corneale. Posizionare la retina direttamente nel mezzo caldo in un piatto di tre centimetri o in un piatto a grappolo di coltura di sei tessuti. Quindi, usa due paia di forcep di stile di McPherson angolate finemente per sezionare delicatamente il vitreo rimanente dalla retina.

Questo è meglio farlo afferrando il vitreo alla periferia della tazza retinica e tirando verso il centro, con un disinserimento finale del corpo vitreo dal centro nel suo complesso. Quindi, rimuovere qualsiasi epitelio residuo del pigmento retinico dalla superficie del recettore fotografico della retina. Tagliare una punta della pipetta P1000 con una lama di rasoio per creare un'apertura approssimativa di quattro millimetri per prevenire traumi indebiti al delicato tessuto retinico durante le manovre di trasferimento.

Quindi, utilizzare la punta della pipetta tagliata per trasferire il tessuto retinale isolato in mezzo fresco. Infine, utilizzare un punzone di biopsia di un millimetro dotato di uno stantuffo, per tagliare pugni di retina attorno al nervo ottico. Mettere da parte i punzoni retinali in mezzo pulito, tenuti su un blocco di 37 gradi Celsius o una pastiglia riscaldante.

Una volta raccolto il numero desiderato di punzoni, utilizzare la graziosa punta P1000 per aspirare un pugno individuale in 450 microlitri di mezzo e trasferirlo su una micro piastra di cattura degli occhielli da 24 pozzetti su una pastiglia termica o un blocco di calore Celsius di 37 gradi. Utilizzare forcette sottili e dritte per manipolare delicatamente i punzoni al centro della micro piastra. Mantenere i punzoni orientati nella stessa direzione.

Ad esempio, con il lato della cellula ganglio verso l'alto. Per ogni esperimento mettere da parte da tre a quattro pozzi vuoti con 450 microlitri di mezzo base per fungere da controlli negativi. Evitando bolle d'aria o movimenti eccessivi, posizionare delicatamente gli inserti in rete di cattura degli occhielli in ogni pozzo e fissare gli inserti con uno stantuffo metallico o con una punta di pipetta P1000 tagliata.

Sebbene la micro camera abbia una profondità adeguata per adattarsi alla tipica retina del mouse, occasionalmente i difetti della macchina negli inserti in rete fanno sì che i tessuti si compressino estroppo durante l'inserimento dello schermo. Se ciò accade, basta prendere nota di questo tessuto schiacciato ed escludere quel campione dall'analisi finale. Incubare la piastra tissutale in un incubatore privo di anidride carbonica di 37 gradi Celsius per almeno 60 minuti.

Programmare l'analizzatore di flusso cellulare aggiuntivo utilizzando comandi mix, weight, measure e repeat. Ad esempio, un tipico esperimento con il tessuto retinale può includere quanto segue. Mescolare due minuti, attendere due minuti e misurare cinque minuti.

Ripetere l'esperimento con questi tre passaggi da cinque a otto volte per la registrazione della linea di base e dopo l'iniezione di ogni composto in fase di test. Premere il pulsante di avvio del programma sull'analizzatore di flusso extracellulare e seguire le istruzioni visualizzate per inserire la cartuccia del sensore per la calibrazione. Al termine della calibrazione, seguire le istruzioni sullo schermo per sostituire la piastra di calibrant con la piastra contenente i campioni retinali, quindi consentire al programma di funzionare come programmato.

Al termine della corsa, seguire le istruzioni sullo schermo per espellere la piastra tissutale. Visualizzare i risultati dell'esecuzione e archiviare il file di dati. Con un ago piegato calibro 20 e pini, rimuovere tutti gli inserti in rete dai pozzi, lasciandosi alle spalle il punzone retinale.

Aspirare con cura il mezzo dal tessuto e lavare il tessuto due volte con 0,5 millilitri di soluzione salina tamponata di fosfato freddo. Dopo aver aspirato il secondo lavaggio PBS, aggiungere 100 microlitri di tampone dilisi ad ogni lavaggio e pipettare su e giù per omogeneizzare il tessuto. Infine, quantificare i livelli di input in base al contenuto totale di DNA a doppio filamento diluindo i campioni lisciviati uno a uno, con 100 microlitri di tampone Tris-EDTA, e trasferendo 100 microlitri del campione diluito su una piastra di 96 pozzi.

Quindi, aggiungere 100 microlitri di buffer di rilevamento a ciascun pozzo e mescolare per due o cinque minuti. Infine, quantificare la florescenza dopo l'eccitazione a 480 nanometri ed emissione a 520 nanometri confrontandola con una curva standard. Normalizzare il flusso extracellulare grezzo tracciando il contenuto di DNA all'interno del pozzo.

Alla linea di base, in presenza di glucosio di cinque milli muller e in presenza di piruvato di muller da 10 milli, non vi è alcuna differenza significativa nei tassi di eflux acido, misurati dal tasso di acidificazione extracellulare. Tra tessuti retinali di animali di tipo wile, o topi knock out che mancano dei macchinari per chiudere i canali ionici ciclici gated nucleotidici in risposta a stimoli leggeri. Modelli simili sono visti dopo l'aggiunta di 20 milli muller glucosio e l'inibitore glicolitico 2DG.

Questi dati possono essere trasformati matematicamente per rappresentare cambiamenti frazionari dalla linea di base, un formato che può consentire un migliore confronto tra diversi interventi sperimentali. Anche il tasso assoluto di consumo di ossigeno al basale è equivalente tra controllo e tessuto retinale mutante. L'aggiunta di glucosio 20 milli muller aumenta la respirazione mitocondriale, ma nessuna variazione osservata tra i gruppi in termini di quantificazione assoluta o in termini di variazione rispetto al basale.

L'aggiunta di un milli muller FCCP, un agente di disaccoppiamento, per dimostrare le massime velocità respiratorie mitocondriali non aumenta significativamente l'OCR al di sopra del livello visto con alto glucosio nel controllo e tessuto retinale mutante. Tuttavia, i segnali di entrambi i topi cadono drasticamente dopo l'aggiunta del cocktail RAA. In conclusione, dimostriamo una tecnica per quantificare i tassi di fosforilazione ossidata e glicolisi negli espianto organotipici della retina di topo.

Con un efficiente isolamento del tessuto retinale, la tecnica produce misurazioni affidabili e reproudcable. È possibile valutare gli effetti in tempo reale delle esposizioni, come gli agenti di disaccoppiamento. Oltre a questa procedura, altri metodi, come l'RTPCR quantitativo e l'western blotting, possono essere eseguiti sul tessuto in eccedenza isolato nella fase di dissezione per ottenere informazioni parallele rilevanti per gli studi sul metabolismo retinale.