Name: Misurazione del metabolismo energetico in tessuto retinico Explanted usando lanalisi di flusso extracellulare (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Scopri come misurare il metabolismo energetico in tempo reale nel tessuto retinico espiantato di topo utilizzando l'analisi di flusso extracellulare. Questo metodo consente di valutare glicolisi e fosforilazione ossidativa per studiare le malattie oculari.

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Ringraziamo il Dr. Alexander Kolesnikov e Dr. Vladimir Kefalov per fornire Gnat1- / -topi, per utili feedback e consigli e per la lettura il manoscritto.
Questo lavoro è stato supportato da NIH EY025269 (RR), il centro di ricerca del diabete presso la Washington University - NIH DK020579 (JRM e RR), il Career Development Award dalla ricerca per prevenire la cecità (RR), la Fondazione di Horncrest (RR), il Career Development Award dal JDRF ( JRM), NIH DK101392 (CFS), DK020579 (CFS), DK056341 (CFS) e DK114233 (JRM).

Protocolli di seguirono l'associazione per la ricerca in visione e Oftalmologia istruzione per l'uso degli animali e sono stati approvati dall'Università di Washington.
1. animale preparazione
<ol><li>Tenere animali in custodia standard con 12 ore di buio per ciclo di 12 ore di luce. Begin esperimenti presso standardizzata volte per evitare effetti circadiani, in genere al mattino poco dopo si accenderanno le luci.</li>
</ol>2. soluzione preparazione
<ol><li>Preparare il supporto di base sciogliendo 8,4 mg di polvere media bidistillata H2O (ddH2O) e regolare il pH a 7.4 con HCl o NaOH, ad un volume finale di 1 L. filtro sterilizzare questa soluzione con un filtro di coltura del tessuto da 0,22 µm.<ol>
<li>Aggiungere 1 M del glucosio e del piruvato di sodio 100 mM ai media per ottenere le concentrazioni finali di glucosio di 5 mM e 1 mM piruvato.</li>
		<li>Posto un'aliquota di 50 mL di base media in bagnomaria a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare la soluzione di Lisi, per la quantificazione del tessuto alla fine dell'analisi del flusso, aggiungendo tris base a 10mm, polietilene glicole etere di tert-octylphenyl allo 0,2% (v/v) ed EDTA a 1 mM, tutte in ddH2Mix O. fino a quando tutti i componenti completamente dissolto e regolare pH a 8.0.</li>
	<li>Per il protocollo di sforzo mitocondriale, preparare un brodo di 11 µM di oligomycin, un inibitore di trifosfato di adenosina Synthase, disciolto in base media di indirizzare una concentrazione finale di 1 µM nel pozzo. Preparare un brodo di 11 µM del cianuro di carbonile - 4-(trifluoromethoxy) phenylhydrazone (FCCP), un agente disgiungente, disciolto in base media di indirizzare una concentrazione finale di 1 µM nel pozzo. Preparare un cocktail di inibitori della catena di trasporto degli elettroni, rotenone e antimycin A (RAA) aggiungendo rotenone 11 µM e antimycin A 22 µM, disciolto in base media di indirizzare una concentrazione finale di 1 µM rotenone e 2 µM antimycin A nel bene.</li>
	<li>Per il protocollo di glicolisi, preparare un brodo di 220 mM di glucosio disciolto in media base, a una concentrazione finale di 20 mM nel pozzo di destinazione. Anche preparare uno stock di 1,1 M di 2-deoxyglucose (2DG), un inibitore competitivo di glucosio e glicolitica antagonista, scioglierlo in base media. Questo sarà destinato a una concentrazione finale di 100 mM 2-DG nel pozzo.</li>
</ol>3. strumento taratura
<ol><li>Per calibrare la strumentazione per l'analisi di un flusso extracellulare, aggiungere 1 mL di soluzione di calibrazione in ciascun pozzetto della cartuccia sensore (in totale 24 pozzetti) e incubare a 37 ° C in un CO2-free incubatore durante la notte (o almeno 8 h).</li>
	<li>Caricare gli additivi per il protocollo di sforzo mitocondriale o la glicolisi in ciascuna porta iniettore, da A D, la cartuccia sensore, regolazione per variazioni di volume nel pozzo. Nota: Ad esempio, un dosaggio tipico includerebbe 45 µ l di un additivo alla prima porta iniettore, 49,5 µ l nella seconda, 54,5 µ l nel terzo e 60 µ l nell'ultimo, assumendo un volume iniziale di ben 450 µ l.</li>
	<li>Durante i primi esperimenti diversi, caricare i supporti base nel porto A misurare quanto tessuto movimento/manufatto si verifica dopo un'iniezione di Porto.</li>
	<li>Fate la piastra sensore caricato Incubare a 37 ° C in un incubatore non-CO2 per almeno 60 min.</li>
</ol>4. isolamento del tessuto retinico Mouse fresco
Nota: Questo passaggio è adattato dalla tecnica del Dr. Barry Winkler15.
<ol><li>Dopo aver somministrato l'anestesia profonda usando un cocktail di chetamina/xilazina standard, eutanasia topi di dislocazione cervicale.</li>
	<li>Utilizzare un paio di pinze curve medie per afferrare il globo posteriore al nervo ottico e applicare una leggera pressione in avanti per proptose l'occhio (Figura 1A).<ol>
<li>Con una lama di rasoio pulita, è necessario creare un'incisione di limbus a limbus attraverso la cornea utilizzando un pass singolo, deliberato della lama.</li>
		<li>Usando bene, forcipe angolato di McPherson-stile, pizzicare il globo posteriore per esprimere la lente e membrane ialoide anteriore fuori l'incisione corneale. Eliminare questi tessuti.</li>
		<li>Ripetere la manovra pizzicare con il forcipe per esprimere la retina neurale.</li>
		<li>Utilizzando le pinze come un cucchiaio per sollevare la retina, anziché cogliere il tessuto, trasferire la retina lontano l'incisione corneale e inserire direttamente in media caldo in un piatto di 3 cm o una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti cluster.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utilizzare due paia di pinze McPherson-stile fine, angolate per sezionare delicatamente rimanente vitreo dalla retina. Questo è fatto meglio afferrando il vitroso alla periferia della Coppa retinica e tirando verso il centro, con un finale disinsertion del corpo vitreo dal centro nel suo complesso. Utilizzando le pinze, rimuovere qualsiasi epitelio pigmentato retinico residuo dalla superficie dei fotorecettori della retina.<ol>
<li>Tagliare una punta di pipetta P1000 con una lama di rasoio per creare un'apertura di ~ 4 mm per evitare inutili traumi il delicato tessuto retinico durante manovre di trasferimento.</li>
		<li>Trasferire il tessuto retinico isolato in media fresco utilizzando un taglio puntale P1000.</li>
		<li>Tagliare pugni di 1 mm della retina intorno al nervo ottico con una biopsia di 1mm punzone dotato di un pistone per sloggiare il tessuto nel caso in cui esso rimane incastrato nel foro (Figura 1B). Impostare i pugni della retina da parte nella media pulito tenuto su un blocco di 37 ° C o rilievo di riscaldamento.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. protocollo
<ol><li>Trasferire singoli punzoni di una micropiastra di cattura dell'isolotto 24 pozzetti utilizzando una tagliata punta P1000, aspirando 450 µ l di media con il tessuto.</li>
	<li>Bene, utilizzare forcipe dritto per manipolare delicatamente pugni nel centro della micropiastra. Tenere pugni orientati nella stessa direzione (ad es., lato della cellula del ganglio verso l'alto).<ol>
<li>Appoggiare la piastra di cattura su un rilievo di riscaldamento o riscaldamento insieme di blocchi a 37 ° C come questi passaggi vengono ripetuti per gli altri campioni. Nota: Per ogni esperimento, mettere da parte 3-4 pozzetti del bianco con 450 µ l di base media di servire come controlli negativi. Nel restante 20-21 pozzi, testare ogni replica biologica in triplice copia. Di conseguenza, ogni piastra a 24 pozzetti permetterà per la registrazione da 6-7 diversi animali o condizioni di trattamento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Evitando bolle d'aria, delicatamente posizione l'isolotto catturare inserti in mesh in ciascun pozzetto usando il forcipe e fissare gli inserti con uno stantuffo di metallo, o con un taglio puntale P1000 (Figura 1 C). Nota: Evitare eccessivo tessuto movimento durante questo passaggio di mantenere la posizione retinica punzone all'interno del centro della microchamber di campione. Bolle d'aria falsare gravemente letture OCR. Anche se il microchamber ha una profondità adeguata per ospitare la retina di topo tipico (Figura 1), occasionalmente lavorazione-difetti negli inserti mesh possono causare tessuti diventare eccessivamente compresso durante l'inserimento di schermo. Se questo accade, semplicemente prendere nota del tessuto schiacciato ed escludere che il campione dall'analisi finale.</li>
	<li>Incubare la piastra di tessuto in una di 37 ° C CO2-gratis incubatore per almeno 60 min.</li>
	<li>L'analizzatore di flusso extracellulare utilizzando Mix, attesa, misura del programma e ripetere i comandi. Ad esempio, un tipico esperimento con tessuto retinico può includere quanto segue: mescolare 2 minuti, attendere 2 minuti e misurare 5 minuti. Ripetere l'esperimento con questi tre passaggi tra 5 - 8 volte (cicli) per una registrazione di base e dopo l'iniezione di ogni composto in fase di test durante l'esecuzione.</li>
	<li>Premere il pulsante di avvio del programma sull'analizzatore flux extracellulare e seguire le istruzioni sullo schermo per inserire la cartuccia di sensore per la calibrazione.</li>
	<li>Al termine della calibrazione, seguire le istruzioni sullo schermo per sostituire la piastra di calibratore con la piastra che contiene i campioni della retina.</li>
	<li>Consentire al programma di eseguire, come programmato. Al completamento dell'esecuzione, seguire le istruzioni sullo schermo per espellere la piastra del tessuto. Mostra i risultati dell'esecuzione e archiviare il file di dati.</li>
	<li>Con un ago di calibro 20 piegato ed il forcipe, rimuovere tutti gli inserti in mesh dai pozzi, lasciando il punzone della retina.</li>
	<li>Attentamente i media dal tessuto di aspirare e lavare il tessuto due volte con 0,5 mL di soluzione tampone fosfato (PBS) e freddo. Aspirare il PBS dopo il lavaggio.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di tampone di lisi in ciascun pozzetto e dispensare su e giù per omogeneizzare il tessuto.</li>
	<li>Quantificare i livelli di input basati su totale DNA a doppia elica (dsDNA) o contenuto proteico totale. Nota: Di seguito si basa su un'analisi di dsDNA disponibile in commercio.</li>
	<li>Diluire i campioni lisati 1:1 con l'aggiunta di 100 µ l di tampone Tris-EDTA (TE) e trasferire 100 µ l del campione diluito ad una piastra ben 96.<ol>
<li>Aggiungere 100 µ l di tampone di rilevazione in ogni pozzetto. Dopo la miscelazione per 2-5 minuti, quantitate fluorescenza dopo eccitazione a 480 nm ed emissione a 520 nm, rispetto ad una curva standard.</li>
		<li>Normalizzare l'analisi di flusso extracellulare crudo al contenuto di DNA all'interno del pozzo. Nota: Nei risultati presentati qui, i campioni vengono normalizzati a 50 ng dsDNA - un importo tipico in un pugno di retinica di 1 mm. Di conseguenza, valori assoluti qui presentati può essere paragonati agli studi che presentano dati "a punzone retinica". Normalizzare i tracciati a uno standard interno, ad esempio la linea di base di esecuzione ad una concentrazione di glucosio di 5 mM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wong-Riley, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+the+visual+system%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+and+brain%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of the visual system.</a> Eye and brain. 2, 99-116 (2010).</li>
<li>Ames, A. 3rd, Li, Y. Y., Heher, E. C., Kimble, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+metabolism+of+rabbit+retina+as+related+to+function%3A+high+cost+of+Na%2B+transport%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Energy metabolism of rabbit retina as related to function: high cost of Na+ transport.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 12 (3), 840-853 (1992).</li>
<li>Warburg, O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13298683">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123 (3191), 309-314 (1956).</li>
<li>Wubben, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoreceptor+metabolic+reprogramming+provides+survival+advantage+in+acute+stress+while+causing+chronic+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Photoreceptor metabolic reprogramming provides survival advantage in acute stress while causing chronic degeneration.</a> Scientific reports. 7 (1), 17863(2017).</li>
<li>Du, J., Linton, J. D., Hurley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+Metabolism+in+the+Intact+Retina+Using+Stable+Isotope+Tracers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Probing Metabolism in the Intact Retina Using Stable Isotope Tracers.</a> Methods in enzymology. 561, 149-170 (2015).</li>
<li>Felder, A. E., Wanek, J., Tan, M. R., Blair, N. P., Shahidi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+Combined+Retinal+Vascular+and+Tissue+Oxygen+Tension+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">A Method for Combined Retinal Vascular and Tissue Oxygen Tension Imaging.</a> Scientific reports. 7 (1), 10622(2017).</li>
<li>Hurley, J. B., Lindsay, K. J., Du, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose%2C+lactate%2C+and+shuttling+of+metabolites+in+vertebrate+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+neuroscience+research%22%5BJournal%5D)">Glucose, lactate, and shuttling of metabolites in vertebrate retinas.</a> Journal of neuroscience research. 93 (7), 1079-1092 (2015).</li>
<li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycolytic+and+oxidative+metabolism+in+relation+to+retinal+function%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+general+physiology%22%5BJournal%5D)">Glycolytic and oxidative metabolism in relation to retinal function.</a> The Journal of general physiology. 77 (6), 667-692 (1981).</li>
<li>Pelletier, M., Billingham, L. K., Ramaswamy, M., Siegel, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+flux+analysis+to+monitor+glycolytic+rates+and+mitochondrial+oxygen+consumption%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Extracellular flux analysis to monitor glycolytic rates and mitochondrial oxygen consumption.</a> Methods in enzymology. 542, 125-149 (2014).</li>
<li>Joyal, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinal+lipid+and+glucose+metabolism+dictates+angiogenesis+through+the+lipid+sensor+Ffar1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Retinal lipid and glucose metabolism dictates angiogenesis through the lipid sensor Ffar1.</a> Nature medicine. 22 (4), 439-445 (2016).</li>
<li>Kooragayala, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Oxygen+Consumption+in+Retina+Ex+Vivo+Demonstrates+Limited+Reserve+Capacity+of+Photoreceptor+Mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+ophthalmology+%26+visual+science%22%5BJournal%5D)">Quantification of Oxygen Consumption in Retina Ex Vivo Demonstrates Limited Reserve Capacity of Photoreceptor Mitochondria.</a> Investigative ophthalmology & visual science. 56 (13), 8428-8436 (2015).</li>
<li>Pearsall, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPARalpha+is+essential+for+retinal+lipid+metabolism+and+neuronal+survival%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+biology%22%5BJournal%5D)">PPARalpha is essential for retinal lipid metabolism and neuronal survival.</a> BMC biology. 15 (1), 113(2017).</li>
<li>Nicholls, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioenergetic+profile+experiment+using+C2C12+myoblast+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%22%5BJournal%5D)">Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells.</a> Journal of visualized experiments. (46), (2010).</li>
<li>Lobanova, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transducin+translocation+in+rods+is+triggered+by+saturation+of+the+GTPase-activating+complex%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+neuroscience%3A+the+official+journal+of+the+Society+for+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Transducin translocation in rods is triggered by saturation of the GTPase-activating complex.</a> The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 27 (5), 1151-1160 (2007).</li>
<li>Winkler, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+electroretinogram+of+the+isolated+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Vision+research%22%5BJournal%5D)">The electroretinogram of the isolated rat retina.</a> Vision research. 12 (6), 1183-1198 (1972).</li>
<li>Jastroch, M., Divakaruni, A. S., Mookerjee, S., Treberg, J. R., Brand, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+proton+and+electron+leaks%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+in+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial proton and electron leaks.</a> Essays in biochemistry. 47, 53-67 (2010).</li>
<li>Divakaruni, A. S., Paradyse, A., Ferrick, D. A., Murphy, A. N., Jastroch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+and+interpretation+of+microplate-based+oxygen+consumption+and+pH+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Analysis and interpretation of microplate-based oxygen consumption and pH data.</a> Methods in enzymology. 547, 309-354 (2014).</li>
<li>Du, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phototransduction+Influences+Metabolic+Flux+and+Nucleotide+Metabolism+in+Mouse+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+biological+chemistry%22%5BJournal%5D)">Phototransduction Influences Metabolic Flux and Nucleotide Metabolism in Mouse Retina.</a> The Journal of biological chemistry. 291 (9), 4698-4710 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

OCR ed ECAR prontamente sono misurati in tessuto retinico explanted utilizzando un bioanalyzer utilizzando le tecniche descritte. Questo metodo parte da quelle degli altri gruppi in diversi passaggi critici. Tessuto retinico è isolati attraverso una grande incisione cornea senza enucleando il globo, come originariamente descritto da Winkler15. Questo metodo di isolamento retinica consente un rapido trasferimento dall'occhio vivente nella piastra di cattura del tessuto (spesso entro 5 minuti). Tess...

La retina è tra i tessuti più esigente di energia nel sistema nervoso centrale1. Come la maggior parte dei tessuti, che genera l'adenosina trifosfato (ATP) tramite la glicolisi nel citosol o tramite fosforilazione ossidativa nei mitocondri. La convenienza energetica di fosforilazione ossidativa sopra glicolisi per produrre ATP da una molecola di glucosio è chiara: 36 molecole di ATP generato dal ex vs 2 molecole di ATP generata da quest'ultimo. Di conseguenza, neuroni retinici dipendono principalmente dalla respirazione mitocondriale per l'approvvigionamento energetico e questo si riflette dalla loro alta densità di mitocondri2. Ancora, la retina anche dipende fortemente dalle macchine glicolitica anche quando l'ossigeno è abbondante. Questo processo di glicolisi aerobica è stata originariamente descritta in cellule tumorali di Otto Warburg3, che una volta ha notato che la retina era il solo post-mitotico tessuto capace di questa forma di metabolismo4. Da tali osservazioni iniziali, molti tessuti post-mitotici sono stati descritti per impegnarsi in vari gradi di glicolisi oltre alla fosforilazione ossidativa per soddisfare le loro richieste di ATP.
Fototrasduzione, pigmento visivo, riciclaggio, biosintesi di segmenti esterni del fotoricettore ed attività sinaptica sono tutti i processi di energia esigente nei fotorecettori, la sottoclasse predominante di un neurone nella retina. Ma la necessità di trasportare attivamente gli ioni contro loro elettrico e gradienti di concentrazione è di gran lunga il processo più energico che richiede in neuroni1. Fotorecettori sono neuroni peculiari nel senso che essi sono depolarizzate in assenza di stimolazione (cioè, al buio), considerando che uno stimolo luminoso innesca la chiusura del canale e successive hyperpolarization. Di conseguenza, al buio, la retina consuma grandi quantità di ATP per mantenere sua depolarizzazione o "corrente di buio", come viene comunemente chiamato. Dal punto di vista adattativo, una sfida importante nella fornitura di queste vaste quantità di ATP è la necessità di organismi mantenere la chiarezza visiva attraverso l'asse ottico. L'architettura retinica invertito visto in creature moderni è la soluzione dominante, come mantiene la fitta rete capillare fornitura fotorecettori lontano dal percorso della luce. Ma questa meraviglia di Bioingegneria naturale mette la retina a un precipizio in termini di riserva metabolica. Anche i piccoli insulti alla retina potenzialmente possono compromettere il delicato equilibrio di energia offerta alla domanda, e la disfunzione visiva o cecità frank può seguire rapidamente.
Date le richieste energetiche uniche della retina neurale, accoppiato con la sua limitazione stretto di rifornimento vascolare, misura accurata del consumo di ATP in retina e i suoi cambiamenti durante la malattia potrebbe avere profonde implicazioni nella comprensione e nel trattamento condizioni accecante come retinite pigmentosa e retinopatia diabetica. Tradizionalmente, queste misure richiedono attrezzature costose, personalizzati con maggior parte degli studi emergenti da una manciata di laboratori interamente dedicati alle misure di attività metabolica2,5,6, 7,8. Le tecniche includono singoli saggi per specifici metaboliti, gli studi di tracciante usando radio-marcato precursori, consumo di ossigeno registrazione utilizzando elettrodi di Clark e metabolomica profilatura9.
Con gli avanzamenti nella tecnologia ad alta velocità e una maggiore disponibilità di dispositivi commerciali, tecniche per registrare metabolismo retinico sono sempre più accessibile e conveniente. Il metodo qui descritto misura entrambi fosforilazione ossidativa e la glicolisi in retina utilizzando espiantati tessuto e un flusso extracellulare reperibile analizzatore9,10,11,12. Questo analizzatore registra separatamente tasso di consumo di ossigeno (OCR) e il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR), che servono come indicatori indiretti di fosforilazione ossidativa e la glicolisi, rispettivamente13. Queste misure sono fatte da una sonda immersa all'interno di un microchamber creato sopra il tessuto di interesse. Questo adattamento dei metodi precedentemente pubblicati utilizza una piastra di acquisizione originariamente progettata per gli isolotti di Langerhans per registrare l'attività metabolica in piccole, circolare sezioni della retina di topo. Esposizioni multiple farmacologiche possono essere consegnate al tessuto nel corso di una singola registrazione perché il sistema contiene ben 4 porte di iniezione per ogni campione. Utilizzando questo sistema con distinti protocolli ottimizzati per registrazioni ECAR e OCR, le risposte delle retine di selvaggio-tipo possono essere paragonate a retine carente transducina (Gnat1- / -), delle cause di cecità notturna congenita stazionaria in gli esseri umani14.

<table><tbody><tr><td>Seahorse XF24 Analizzatore di flusso extracellulare</td><td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Seahorse XF24 Islet Capture FluxPak (include: micropiastra per la cattura delle isole, cartuccia del sensore e soluzione di calibrazione)</td><td>Agilent, Santa Clara, CA</td><td>101174-100</td><td>Include micropiastra per la cattura delle isole, cartuccia del sensore e soluzione di calibrazione</td></tr><tr><td>RPMI 1640 Media (terreno in polvere)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>R1383</td><td>RPMI 1640 Terreni con L-Glutammina e senza glucosio o bicarbonato di sodio</td></tr><tr><td>D-Glucosio</td><td>Millipore-Sigma</td><td>G8270</td><td>1M D-Glucosio filtrato, per la preparazione di terreni</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Corning</td><td>25000CI</td><td>100 mM piruvato di sodio</td></tr><tr><td>Antimicina-A</td><td>Millipore-Sigma</td><td>A8674</td><td>Componente del protocollo di stress mitocondriale</td></tr><tr><td>FCCP</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C2920</td><td>Componente del protocollo di stress mitocondriale</td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Millipore-Sigma</td><td>R8875</td><td>Componente del protocollo di stress mitocondriale</td></tr><tr><td>2-desossiglucosio</td><td>Millipore-Sigma</td><td>D6134</td><td>Componente del protocollo di glicolisi</td></tr><tr><td>Punzoni per biopsia cutanea da 1 mm con stantuffo</td><td>Integra-Miltex</td><td>33-31AA-P/25</td><td>Strumento per l'espianto di tessuto retinico</td></tr><tr><td>Dumont Mini-Pinze Dritte</td><td>Strumenti per la scienza fine</td><td>11200-10</td><td>Strumento per l'espiantazione del tessuto retinico</td></tr><tr><td>Dumont Medical #5/45 Pinze - Angolato a 45 gradi</td><td>Fine Science Tools</td><td>11253-25</td><td>Strumento per l'espiantazione del tessuto retinico</td></tr><tr><td>Dumont #7 Pinze - Curved</td><td>Fine Science Tools</td><td>11271-30</td><td>Strumento per l'espiantazione del tessuto retinico</td></tr><tr><td>Quant-iT Picogreen dsDNA Assay</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Kit Fisher Scientific P7589 Saggio di normalizzazione del caricoBase Trizma (Tris base)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T6066</td><td>Componente del tampone di lisi</td></tr><tr><td>Triton X-100 (polietilenglicole terz-ottilfenil etere)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>X100</td><td>Componente del tampone di lisi</td></tr><tr><td>0,5M EDTA pH 8,0</td><td>Ambion</td><td>AM9262</td><td>Componente del tampone di lisi</td></tr><tr><td>C57BL/6J topi&nbsp;</td><td>Laboratori Jackson</td>&<td>nbsp; Ceppo 000664</td><td>Animali</td></tr><tr><td>Gnat1-/- e Gnat1+/+&nbsp;</td><td>Vladimir Kefalov, PhD; Animali della Scuola di Medicina dell'Università di Washington</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione del metabolismo energetico in tessuto retinico explanted usando l'analisi di flusso extracellulare

Measurement of Energy Metabolism in Explanted Retinal Tissue Using Extracellular Flux Analysis

Alta acuità visione è un processo fortemente che consumano energia, e la retina ha sviluppato diversi adattamenti unici per soddisfare proprio queste esigenze pur mantenendo la trasparenza dell'asse visivo. Perturbazioni di questo delicato equilibrio causano malattie accecante, quali la retinopatia diabetica. Di conseguenza, la comprensione dei cambiamenti di metabolismo energetico nella retina durante la malattia è indispensabile per lo sviluppo di terapie razionali per varie cause di perdita di vison. Il recente avvento di analizzatori di flusso extracellulare commercialmente disponibile ha reso più accessibile lo studio del metabolismo energetico della retina. Questo protocollo descrive l'uso di un tal analizzatore per misurare contributi all'approvvigionamento energetico della retina attraverso le braccia due principio - fosforilazione ossidativa e la glicolisi - quantificando le variazioni dei tassi di consumo di ossigeno (OCR) ed extracellulari tariffe di acidificazione (ECAR) come proxy per queste vie. Questa tecnica viene eseguita prontamente in tessuto retinico explanted, facilitando la valutazione delle risposte agli agenti farmacologici multipli in un singolo esperimento. Metaboliche firme in retine da animali carenti asta del fotoricettore segnalazione sono confrontate ai comandi di selvaggio-tipo utilizzando questo metodo. Una limitazione importante in questa tecnica è la mancanza di capacità di discriminare tra l'utilizzazione di energia luce-adattato e scuro-adattato, una considerazione importante fisiologica in tessuto retinico.

Utilizzando le tecniche descritte (riassunte nella Figura 1), retiniche espianti da topi di 8 settimana-vecchio wild type (WT) sono stati confrontati per età e background-abbinato transducina topi (Gnat1- / -). Perché Gnat1- / - animali mancano la macchina per chiudere ciclico del nucleotide gated scanalature dello ione in risposta a stimoli luminosi, loro fotoricettori dell'asta rimangono depolarizzate anche i...

Questa tecnica viene descritto la registrazione in tempo reale del consumo di ossigeno e tassi di acidificazione extracellulare nei tessuti retinici explanted del mouse utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare.

Misurazione del metabolismo energetico in tessuto retinico Explanted usando l'analisi di flusso extracellulare

High acuity vision is a heavily energy-consuming process, and the retina has developed several unique adaptations to precisely meet such demands while ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave come come il metabolismo energetico nel tessuto retinale differisce tra campioni biologici o dopo l'esposizione ad agenti farmacologici. Il principale vantaggio di questa tecnica è che utilizza tessuto retinico organotipico espiantato per misurare i tassi sia di glicolisi che di fosforilazione ossidata e consente valutazioni di interventi in tempo reale in vitro. Per calibrare la strumentazione per un saggio di flusso extracellulare, aggiungere prima un millilitro di soluzione di calibrazione a ciascun pozzo della cartuccia del sensore a 24 pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore privo di Co2 durante la notte.Additivi di carico per il protocollo di sollecitazione mitocondriale, o il protocollo di glicolisi in ogni porta dell'iniettore sulla cartuccia del sensore, regolando per le variazioni di volume nel pozzo. Supponendo un volume iniziale di 450 microlitri, un test tipico includerebbe 45 microlitri di un additivo nella prima porta dell'iniettore, 49,5 microlitri nel secondo, 54,5 microlitri nel terzo e 60 microlitri fino all'ultimo. Durante i primi esperimenti, caricare il supporto di base nella porta A per misurare la quantità di artefatto di movimento tissutale che si verifica dopo un'iniezione di porta.Lasciare incubare la piastra del sensore caricata a 37 gradi Celsius in un incubatore non co2 per almeno 60 minuti. Inizia l'isolamento del tessuto retinale del topo fresco con un topo appena eutanasiato. Utilizzare un paio di forcep curve di medie dimensioni per afferrare il globo posteriore al nervo ottico e applicare delicatamente la pressione in avanti per proptosare l'occhio.Con una lama di rasoio pulita, crea un'incisione da limbo a limbo attraverso la cornea usando un unico passaggio deliberato della lama. Usando forcep in stile McPherson angolato fine, pizzicare il globo posteriore per esprimere la lente e le membrane iloidi anteriori dall'incisione corneale. Ripeti la manovra di pizzicamento con le forcep per esprimere la retina neurale.Quindi, usa le grana come un cucchiaio per sollevare la retina lontano dall'incisione corneale. Posizionare la retina direttamente nel mezzo caldo in un piatto di tre centimetri o in un piatto a grappolo di coltura di sei tessuti. Quindi, usa due paia di forcep di stile di McPherson angolate finemente per sezionare delicatamente il vitreo rimanente dalla retina.Questo è meglio farlo afferrando il vitreo alla periferia della tazza retinica e tirando verso il centro, con un disinserimento finale del corpo vitreo dal centro nel suo complesso. Quindi, rimuovere qualsiasi epitelio residuo del pigmento retinico dalla superficie del recettore fotografico della retina. Tagliare una punta della pipetta P1000 con una lama di rasoio per creare un'apertura approssimativa di quattro millimetri per prevenire traumi indebiti al delicato tessuto retinico durante le manovre di trasferimento.Quindi, utilizzare la punta della pipetta tagliata per trasferire il tessuto retinale isolato in mezzo fresco. Infine, utilizzare un punzone di biopsia di un millimetro dotato di uno stantuffo, per tagliare pugni di retina attorno al nervo ottico. Mettere da parte i punzoni retinali in mezzo pulito, tenuti su un blocco di 37 gradi Celsius o una pastiglia riscaldante.Una volta raccolto il numero desiderato di punzoni, utilizzare la graziosa punta P1000 per aspirare un pugno individuale in 450 microlitri di mezzo e trasferirlo su una micro piastra di cattura degli occhielli da 24 pozzetti su una pastiglia termica o un blocco di calore Celsius di 37 gradi. Utilizzare forcette sottili e dritte per manipolare delicatamente i punzoni al centro della micro piastra. Mantenere i punzoni orientati nella stessa direzione.Ad esempio, con il lato della cellula ganglio verso l'alto. Per ogni esperimento mettere da parte da tre a quattro pozzi vuoti con 450 microlitri di mezzo base per fungere da controlli negativi. Evitando bolle d'aria o movimenti eccessivi, posizionare delicatamente gli inserti in rete di cattura degli occhielli in ogni pozzo e fissare gli inserti con uno stantuffo metallico o con una punta di pipetta P1000 tagliata.Sebbene la micro camera abbia una profondità adeguata per adattarsi alla tipica retina del mouse, occasionalmente i difetti della macchina negli inserti in rete fanno sì che i tessuti si compressino estroppo durante l'inserimento dello schermo. Se ciò accade, basta prendere nota di questo tessuto schiacciato ed escludere quel campione dall'analisi finale. Incubare la piastra tissutale in un incubatore privo di anidride carbonica di 37 gradi Celsius per almeno 60 minuti.Programmare l'analizzatore di flusso cellulare aggiuntivo utilizzando comandi mix, weight, measure e repeat. Ad esempio, un tipico esperimento con il tessuto retinale può includere quanto segue. Mescolare due minuti, attendere due minuti e misurare cinque minuti.Ripetere l'esperimento con questi tre passaggi da cinque a otto volte per la registrazione della linea di base e dopo l'iniezione di ogni composto in fase di test. Premere il pulsante di avvio del programma sull'analizzatore di flusso extracellulare e seguire le istruzioni visualizzate per inserire la cartuccia del sensore per la calibrazione. Al termine della calibrazione, seguire le istruzioni sullo schermo per sostituire la piastra di calibrant con la piastra contenente i campioni retinali, quindi consentire al programma di funzionare come programmato.Al termine della corsa, seguire le istruzioni sullo schermo per espellere la piastra tissutale. Visualizzare i risultati dell'esecuzione e archiviare il file di dati. Con un ago piegato calibro 20 e pini, rimuovere tutti gli inserti in rete dai pozzi, lasciandosi alle spalle il punzone retinale.Aspirare con cura il mezzo dal tessuto e lavare il tessuto due volte con 0,5 millilitri di soluzione salina tamponata di fosfato freddo. Dopo aver aspirato il secondo lavaggio PBS, aggiungere 100 microlitri di tampone dilisi ad ogni lavaggio e pipettare su e giù per omogeneizzare il tessuto. Infine, quantificare i livelli di input in base al contenuto totale di DNA a doppio filamento diluindo i campioni lisciviati uno a uno, con 100 microlitri di tampone Tris-EDTA, e trasferendo 100 microlitri del campione diluito su una piastra di 96 pozzi.Quindi, aggiungere 100 microlitri di buffer di rilevamento a ciascun pozzo e mescolare per due o cinque minuti. Infine, quantificare la florescenza dopo l'eccitazione a 480 nanometri ed emissione a 520 nanometri confrontandola con una curva standard. Normalizzare il flusso extracellulare grezzo tracciando il contenuto di DNA all'interno del pozzo.Alla linea di base, in presenza di glucosio di cinque milli muller e in presenza di piruvato di muller da 10 milli, non vi è alcuna differenza significativa nei tassi di eflux acido, misurati dal tasso di acidificazione extracellulare. Tra tessuti retinali di animali di tipo wile, o topi knock out che mancano dei macchinari per chiudere i canali ionici ciclici gated nucleotidici in risposta a stimoli leggeri. Modelli simili sono visti dopo l'aggiunta di 20 milli muller glucosio e l'inibitore glicolitico 2DG.Questi dati possono essere trasformati matematicamente per rappresentare cambiamenti frazionari dalla linea di base, un formato che può consentire un migliore confronto tra diversi interventi sperimentali. Anche il tasso assoluto di consumo di ossigeno al basale è equivalente tra controllo e tessuto retinale mutante. L'aggiunta di glucosio 20 milli muller aumenta la respirazione mitocondriale, ma nessuna variazione osservata tra i gruppi in termini di quantificazione assoluta o in termini di variazione rispetto al basale.L'aggiunta di un milli muller FCCP, un agente di disaccoppiamento, per dimostrare le massime velocità respiratorie mitocondriali non aumenta significativamente l'OCR al di sopra del livello visto con alto glucosio nel controllo e tessuto retinale mutante. Tuttavia, i segnali di entrambi i topi cadono drasticamente dopo l'aggiunta del cocktail RAA. In conclusione, dimostriamo una tecnica per quantificare i tassi di fosforilazione ossidata e glicolisi negli espianto organotipici della retina di topo.Con un efficiente isolamento del tessuto retinale, la tecnica produce misurazioni affidabili e reproudcable. È possibile valutare gli effetti in tempo reale delle esposizioni, come gli agenti di disaccoppiamento. Oltre a questa procedura, altri metodi, come l'RTPCR quantitativo e l'western blotting, possono essere eseguiti sul tessuto in eccedenza isolato nella fase di dissezione per ottenere informazioni parallele rilevanti per gli studi sul metabolismo retinale.

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Biologia

Questo protocollo fornisce un approccio biochimico per misurare il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e il tasso di consumo di ossigeno (OCR) delle cellule leucemiche primarie con saggio del flusso extracellulare. La valutazione del profilo metabolico di queste cellule aiuta a caratterizzare le loro richieste, portando a una terapia personalizzata.

Saggio del flusso extracellulare: un metodo per misurare il profilo metabolico delle cellule

Questo video dimostra il metodo per analizzare il metabolismo energetico nelle cellule NK umane attivate utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare. Diversi inibitori dei complessi della catena di trasporto degli elettroni influenzano la sintesi di ATP, che viene misurata attraverso il tasso di consumo di ossigeno o OCR, fornendo informazioni sul metabolismo cellulare e sulla bioenergetica.

Monitoraggio in tempo reale del metabolismo energetico nelle cellule NK umane utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare

La riprogrammazione metabolica è una caratteristica e un prerequisito per la polarizzazione dei macrofagi M1 e M2. Questo manoscritto descrive un test per la misurazione dei parametri fondamentali della glicolisi e della funzione mitocondriale nei macrofagi derivati dal midollo osseo di topo. Questo strumento può essere applicato per studiare come particolari fattori influenzano il metabolismo e il fenotipo del macrofago.

Caratterizzazione metabolica di Polarized M1 e M2 macrofagi derivate dal midollo osseo Utilizzando analisi in tempo reale extracellulare Flux

Questo protocollo fornisce un approccio conveniente per isolare e caratterizzare del mouse primario cellule tubolari renali che possono successivamente essere sub-coltivate per valutare funzioni biologiche renale ex vivo, tra cui bioenergetiche mitocondriali.

Isolamento, caratterizzazione e Throughput elevato flusso extracellulare analisi di cellule epiteliali tubolari renali primari del Mouse

Qui è descritto un protocollo dettagliato per l'esecuzione del test dello stress mitocondriale e del test della velocità glicolitica in campioni di tessuto retinico ex vivo utilizzando un bioanalizzatore commerciale.

Determinazione della respirazione mitocondriale e della glicolisi in campioni di tessuto retinico Ex Vivo

Il metodo qui presentato riassume i protocolli ottimizzati per la valutazione della bioenergetica cellulare nelle cellule staminali ematopoietiche non aderenti del topo e nelle cellule progenitrici primitive (HSPC) utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare per misurare il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) e il tasso di consumo di ossigeno (OCR) degli HSPC in tempo reale.

Valutazione della bioenergetica cellulare in cellule staminali ematopoietiche di topo e progenitrici primitive utilizzando l'analizzatore di flusso extracellulare

Questi protocolli aiuteranno gli utenti a sondare il metabolismo energetico mitocondriale negli sferoidi derivati dalla linea cellulare del cancro 3D utilizzando l'analisi del flusso extracellulare di Cavalluccio marino.

Esplorazione del metabolismo energetico mitocondriale di singoli sferoidi microtessuati 3D utilizzando l'analisi del flusso extracellulare

Lo stato metabolico delle cellule epiteliali pigmentate retiniche umane (H-RPE) riflette la loro salute e funzione. Qui viene presentato un protocollo ottimizzato per esaminare il flusso metabolico in tempo reale di H-RPE utilizzando respirometria ad alta risoluzione.

Analisi in tempo reale della bioenergetica in cellule epiteliali pigmentate primarie della retina umana mediante respirometria ad alta risoluzione

Qui, descriviamo in dettaglio i metodi per estrarre i macrofagi dal midollo osseo, dalla milza e dal cuore infartuato e successivamente valutare il flusso metabolico nelle cellule vive.

Analisi del flusso metabolico ex vivo nei macrofagi splenici e cardiaci e nei monociti del midollo osseo

Questo protocollo descrive un modo conveniente per eseguire un test di sforzo per la glicolisi al fine di quantificare la riprogrammazione metabolica nella microglia primaria del topo. Dopo l'isolamento e la stimolazione infiammatoria, il tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) viene misurato utilizzando reagenti appena preparati e regolati per il pH, seguiti dalla normalizzazione proteica per consentire una valutazione accurata e riproducibile degli spostamenti glicolitici.

Indagine della glicolisi nella microglia primaria tramite test di flusso extracellulare

In questo articolo descriviamo un protocollo dettagliato per quantificare il tasso di consumo di ossigeno e il  tasso di acidificazione extracellulare dei ventricoli adulti ex vivo per caratterizzare la loro capacità metabolica ossidativa e glicolitica.

Valutazione dell'attività metabolica dei ventricoli interi rigeneranti del pesce zebra ex vivo utilizzando un saggio extracellulare di flusso

Scopri come misurare il metabolismo energetico in tempo reale nel tessuto retinico espiantato di topo utilizzando l'analisi di flusso extracellulare. Questo metodo consente di valutare glicolisi e fosforilazione ossidativa per studiare le malattie oculari.

Misurazione del metabolismo energetico in tessuto retinico Explanted usando l'analisi di flusso extracellulare

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