Name: Spatiotemporally controllato traslocazione nucleare di ospiti in cellule viventi utilizzando colle molecolare in gabbia come tag fuse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Scopri la traslocazione nucleare indotta dalla luce in cellule viventi utilizzando tag di colla molecolare in gabbia. Questo metodo consente il targeting selettivo di farmaci al nucleo con applicazioni in terapia genica.

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Riconosciamo il centro per l'integrazione di NanoBio, l'Università di Tokyo. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzione per giovani scienziati (B) (26810046) per K.O. e parzialmente supportato da sovvenzione per ricerca promosso appositamente (25000005) con T.A. R.M. grazie Research Fellowships di Japan Society per la promozione della scienza (JSPS ) per giovani ricercatori e il programma per scuole laureate leader (GPLLI).

1. preparazione degli ospiti con gabbiacolla-R Tag
<ol><li>Preparare la soluzione di colla-NBD Caged.<ol>
<li>Sintetizzare Cagedcolla-NBD (Figura 1) seguendo le procedure precedentemente descritte20.</li>
		<li>Preparare una soluzione stock di Cagedcolla-NBD (10 mM) a secco dimetilsolfossido (DMSO). Nota: Conservare la soluzione magazzino buio. La soluzione può essere diluita con amplificatori acquosi o terreni di coltura delle cellule al momento di utilizzo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare la soluzione di colla-QD Caged.<ol>
<li>Sintetizzare Cagedcolla-dibenzocylooctyne (Cagedcolla-DBCO) (Figura 1) seguendo le procedure precedentemente descritte20.</li>
		<li>Preparare una soluzione stock di Cagedcolla-DBCO (10 mM) in DMSO asciutto.</li>
		<li>Per la preparazione di colla Caged-QD, innanzitutto preparare azide-funzionalizzate QD (Azide-QD; Figura 3). Aggiungere 100 µ l di una soluzione di dimetil formammide (DMF, 125 µM) di azide-PEG4-NHS estere (Figura 3) a 400 µ l di un DMF (500 nM) soluzione di punti quantici (QD) rivestito con ammina-funzionalizzate PEG (ammina-QD; Figura 3). Mescolare il composto per 1 h a temperatura ambiente.</li>
		<li>Dializzare la soluzione risultante per 24 h contro 800 mL di DMF utilizzando una membrana di cellulosa rigenerata con 3.500 peso molecolare cut-off (MWCO).</li>
		<li>Diluire la soluzione madre di Cagedcolla-DBCO a 50 µM con DMF. Aggiungere 200 µ l della soluzione alla soluzione post-dialisi (Figura 3) e mescolare il composto per 3 ore a temperatura ambiente.</li>
		<li>Dializzare la soluzione risultante per 24 h contro 800 mL di DMF utilizzando una membrana di cellulosa rigenerata (25.000 MWCO).</li>
		<li>Diluire la soluzione risultante a 200 nM con DMF.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig3.jpg"> Figura 3: illustrazione schematica della preparazione della colla Caged-QD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
2. preparazione del campione di cellule di Hep3B per osservazioni al microscopio
<ol><li>Mantenere le cellule di Hep3B il carcinoma epatocellulare umano in medium essenziale minimo di Eagle (EMEM) contenente 10% siero bovino fetale (FBS) a 37 ° C inferiore al 5% di CO2.</li>
	<li>Le cellule del seme il giorno prima dell'esperimento. Seme 5.0 × 103 Hep3B cellule per pozzetto di un substrato di vetro 8-camerato in EMEM (10% FBS, 200 µ l) e incubare il campione di cellule a 37 ° C inferiore al 5% di CO2 per 24 h.</li>
	<li>Rimuovere il terreno di coltura e sciacquare il campione di cellule con 100 µ l di soluzione salina tampone di fosfato di Dulbecco (D-PBS) due volte.</li>
</ol>3. osservazione della traslocazione nucleare di piccole molecole ospiti attivati dalla luce UV
<ol><li>Fornire il campione di cellule (preparato in passaggio 2.3) con 200 µ l di FBS-libero EMEM contenente Cagedcolla-NBD (10 µM) ed incubare il campione di cellule risultante a 37 ° C inferiore al 5% di CO2 per 3 h. Nota: Incubazione del campione delle cellule in EMEM FBS-libero per più di 4 h provoca danni gravi delle cellule.</li>
	<li>Rimuovere il terreno di coltura e sciacquare il campione di cellule con 100 µ l di D-PBS due volte.</li>
	<li>Per la visualizzazione degli endosomi, fornire il campione di cellule con 200 µ l di EMEM (10% FBS) contenente un colorante rosso fluorescente (ad es., LysoTracker rosso, 100 nM) e incubare il campione di cellule risultante a 37 ° C inferiore al 5% di CO2 per 20 minuti rimuovere la cultura medio e sciacquare il campione di cellule con 100 µ l di D-PBS due volte. Fornire il campione di cellule con 200 µ l di EMEM (10% FBS).</li>
	<li>Per traslocazione nucleare di Cagedcolla-NBD, esporre il campione di cellule ai raggi UV per 2 min tramite una fibra ottica utilizzando una sorgente di luce allo xeno 100-W dotata di filtro passa-banda 365 nm. Per un esempio di cella di riferimento senza esposizione ai raggi UV, conservare il campione di cellule buio. Nota: Il coperchio dei substrati di vetro può essere tolto per efficiente esposizione ai raggi UV. Lunga esposizione ai raggi UV può causare citotossicità per le cellule.</li>
	<li>Per la visualizzazione dei nuclei, aggiungere 1 µ l di Hoechst 33342 (1 mg/mL) al terreno di coltura e incubare il campione di cellule risultante a 37 ° C inferiore al 5% di CO2 per 10 min.</li>
	<li>Sottoporre il campione di cellule per microscopia a scansione laser confocale e registrare le micrografie eccitazione a 488 nm (λobs = 500-530 nm), 543 nm (λobs = 565-620 nm) e 710 nm (due-fotone; Λ OBS = 390-465 nm) per NBD, colorante rosso fluorescente e Hoechst 33342, rispettivamente.</li>
</ol>4. osservazione della traslocazione nucleare di piccole molecole ospiti attivati dalla luce di due fotoni NIR
<ol><li>Fornire il campione di cellule (preparato in passaggio 2.3) con 200 µ l di FBS-libero EMEM contenente Cagedcolla-NBD (10 µM) ed incubare il campione di cellule risultante a 37 ° C inferiore al 5% di CO2 per 3 h.</li>
	<li>Rimuovere il terreno di coltura e sciacquare il campione di cellule con 100 µ l di D-PBS due volte. Fornire il campione di cellule con 200 µ l di EMEM (10% FBS).</li>
	<li>Sottoporre il campione di cellule per microscopia a scansione laser confocale e registrare le micrografie eccitazione a 488 nm (λobs = 500-530 nm).</li>
	<li>Per traslocazione nucleare di Cagedcolla-NBD, irradiare la regione inclusa la cella di interesse con un laser di eccitazione del due-fotone (710 nm), installato come fonte luminosa del microscopio, per 2 min (30 s × 4). Osservare la traslocazione come descritto al punto 4.3.</li>
</ol>5. osservazione della traslocazione nucleare di ospiti macromolecolari attivati dalla luce UV
<ol><li>Fornire il campione di cellule (preparato in passaggio 2.3) con 200 µ l di FBS-libero EMEM contenente Cagedcolla-QD (10 nM) e incubare il campione di cellule risultante a 37 ° C inferiore al 5% di CO2 per 3 h.</li>
	<li>Rimuovere il terreno di coltura e sciacquare il campione di cellule con 100 µ l di D-PBS due volte. Fornire il campione di cellule con 200 µ l di EMEM (10% FBS).</li>
	<li>Per traslocazione nucleare di Cagedcolla-QD, esporre il campione di cellule ai raggi UV per 2 min tramite una fibra ottica utilizzando una sorgente di luce allo xeno 100-W dotata di filtro passa-banda 365 nm. Per un esempio di cella di riferimento senza esposizione ai raggi UV, conservare il campione di cellule buio.</li>
	<li>Per la visualizzazione dei nuclei, aggiungere 1 µ l di Hoechst 33342 (1 mg/mL) al terreno di coltura e incubare il campione di cellule risultante a 37 ° C inferiore al 5% di CO2 per 10 min.</li>
	<li>Sottoporre il campione di cellule per microscopia a scansione laser confocale e registrare le micrografie eccitazione a 405 nm (λobs = 430-520 nm) e 488 nm (λobs = 625-680 nm) per Hoechst 33342 e QD, rispettivamente.</li>
</ol>6. cellule
<ol><li>Mantenere le cellule di Hep3B il carcinoma epatocellulare umano in EMEM (10% FBS) a 37 ° C inferiore al 5% di CO2.</li>
	<li>Le cellule del seme il giorno prima dell'esperimento. Cellule di3 Hep3B seme 5.0 × 10 per pozzetto di una piastra a 96 pozzetti cultura in EMEM (10% FBS, 200 µ l) e incubare il campione di cellule a 37 ° C inferiore al 5% di CO2 per 24 h.</li>
	<li>Rimuovere il terreno di coltura e sciacquare il campione di cellule con 100 µ l di D-PBS due volte.</li>
	<li>Fornire il campione di cellule con 200 µ l di FBS-libero EMEM contenente Cagedcolla-NBD (0.1-100 µM) e incubare il campione di cellule risultante a 37 ° C inferiore al 5% di CO2 per 3 h.</li>
	<li>Esporre il campione di cellule a luce UV per 2 min tramite una fibra ottica utilizzando una sorgente di luce allo xeno 100-W dotata di filtro passa-banda 365 nm. Per un esempio di cella analoga senza esposizione ai raggi UV, conservare il campione di cellule buio.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di reagente di cella contando Kit-8 (10 µ l) al terreno di coltura e incubare il campione di cellule risultante a 37 ° C inferiore al 5% di CO2 per 2 h.</li>
	<li>Sottoporre il campione di cellule a spettroscopia di assorbimento (λ = 450 nm) utilizzando un lettore di micropiastre.</li>
</ol>

<ol><li>Miller, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+gene+therapy+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human gene therapy comes of age.</a> Nature. 357, 455-460 (1992).</li>
<li>Roth, J. A., Cristiano, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+Therapy+for+Cancer%3A+What+Have+We+Done+and+Where+Are+We+Going%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Gene Therapy for Cancer: What Have We Done and Where Are We Going.</a> Journal of the National Cancer Institute. 89, 21-39 (1997).</li>
<li>Verma, I. M., Weitzman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GENE+THERAPY%3A+Twenty-First+Century+Medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">GENE THERAPY: Twenty-First Century Medicine.</a> Annual Review of Biochemistry. 74, 711-738 (2005).</li>
<li>Ragin, A. D., Morgan, R. A., Chmielewski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Import+Mediated+by+Nuclear+Localization+Signal+Peptide+Sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular Import Mediated by Nuclear Localization Signal Peptide Sequences.</a> Chemistry & Biology. 9, 943-948 (2002).</li>
<li>Martin, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+protein+targeting+to+the+nucleolus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Principles of protein targeting to the nucleolus.</a> Nucleus. 6, 314-325 (2015).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+nuclear+targeting+ability+of+nuclear+localization+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Drug+Targeting%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the nuclear targeting ability of nuclear localization signals.</a> Journal of Drug Targeting. 24, 927-933 (2016).</li>
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<li>Okuro, K., Kinbara, K., Tsumoto, K., Ishii, N., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Glues+Carrying+Multiple+Guanidinium+Ion+Pendants+via+an+Oligoether+Spacer%3A+Stabilization+of+Microtubules+against+Depolymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Molecular Glues Carrying Multiple Guanidinium Ion Pendants via an Oligoether Spacer: Stabilization of Microtubules against Depolymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 131, 1626-1627 (2009).</li>
<li>Okuro, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesion+Effects+of+a+Guanidinium+Ion+Appended+Dendritic+%26%2334%3BMolecular+Glue%26%2334%3B+on+the+ATP-Driven+Sliding+Motion+of+Actomyosin%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%2C+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Adhesion Effects of a Guanidinium Ion Appended Dendritic &#34;Molecular Glue&#34; on the ATP-Driven Sliding Motion of Actomyosin.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 48, 3030-3033 (2010).</li>
<li>Uchida, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoclickable+Dendritic+Molecular+Glue%3A+Noncovalent-to-Covalent+Photochemical+Transformation+of+Protein+Hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Photoclickable Dendritic Molecular Glue: Noncovalent-to-Covalent Photochemical Transformation of Protein Hybrids.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 4684-4687 (2013).</li>
<li>Garzoni, M., Okuro, K., Ishii, N., Aida, T., Pavan, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+Shape+Effects+of+Molecular+Glue+on+Supramolecular+Tubulin+Assemblies%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Structure and Shape Effects of Molecular Glue on Supramolecular Tubulin Assemblies.</a> ACS Nano. 8, 904-914 (2014).</li>
<li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+glues+for+manipulating+enzymes%3A+trypsin+inhibition+by+benzamidine-conjugated+molecular+glues%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Molecular glues for manipulating enzymes: trypsin inhibition by benzamidine-conjugated molecular glues.</a> Chemical Science. 6, 2802-2805 (2015).</li>
<li>Okuro, K., Sasaki, M., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Boronic+Acid-Appended+Molecular+Glues+for+ATP-Responsive+Activity+Modulation+of+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Boronic Acid-Appended Molecular Glues for ATP-Responsive Activity Modulation of Enzymes.</a> Journal of the American Chemical Society. 138, 5527-5530 (2016).</li>
<li>Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adhesive+Photoswitch%3A+Selective+Photochemical+Modulation+of+Enzymes+under+Physiological+Conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Adhesive Photoswitch: Selective Photochemical Modulation of Enzymes under Physiological Conditions.</a> Journal of the American Chemical Society. 139, 10072-10078 (2017).</li>
<li>Hashim, P. K., Okuro, K., Sasaki, S., Hoashi, Y., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductively+Cleavable+Nanocaplets+for+siRNA+Delivery+by+Template-Assisted+Oxidative+Polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Reductively Cleavable Nanocaplets for siRNA Delivery by Template-Assisted Oxidative Polymerization.</a> Journal of the American Chemical Society. 137, 15608-15611 (2015).</li>
<li>Hatano, J., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinduced+Bioorthogonal+1%2C3-Dipolar+Poly-cycloaddition+Promoted+by+Oxyanionic+Substrates+for+Spatiotemporal+Operation+of+Molecular+Glues%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%2C+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Photoinduced Bioorthogonal 1,3-Dipolar Poly-cycloaddition Promoted by Oxyanionic Substrates for Spatiotemporal Operation of Molecular Glues.</a> Angewandte Chemie, International Edition. 55, 193-198 (2016).</li>
<li>Arisaka, A., Mogaki, R., Okuro, K., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caged+Molecular+Glues+as+Photoactivatable+Tags+for+Nuclear+Translocation+of+Guests+in+Living+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags for Nuclear Translocation of Guests in Living Cells.</a> Journal of the American Chemical Society. 140, 2687-2692 (2018).</li>
<li>Suzuki, Y., Okuro, K., Takeuchi, T., Aida, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friction-Mediated+Dynamic+Disordering+of+Phospholipid+Membrane+by+Mechanical+Motions+of+Photoresponsive+Molecular+Glue%3A+Activation+of+Ion+Permeation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Friction-Mediated Dynamic Disordering of Phospholipid Membrane by Mechanical Motions of Photoresponsive Molecular Glue: Activation of Ion Permeation.</a> Journal of the American Chemical Society. 134, 15273-15276 (2012).</li>
<li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-water-content+mouldable+hydrogels+by+mixing+clay+and+a+dendritic+molecular+binder%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">High-water-content mouldable hydrogels by mixing clay and a dendritic molecular binder.</a> Nature. 463, 339-343 (2010).</li>
<li>Tamesue, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+versus+Dendritic+Molecular+Binders+for+Hydrogel+Network+Formation+with+Clay+Nanosheets%3A+Studies+with+ABA+Triblock+Copolyethers+Carrying+Guanidinium+Ion+Pendants%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Linear versus Dendritic Molecular Binders for Hydrogel Network Formation with Clay Nanosheets: Studies with ABA Triblock Copolyethers Carrying Guanidinium Ion Pendants.</a> Journal of the American Chemical Society. 135, 15650-15655 (2013).</li>
<li>Mohr, D., Frey, S., Fischer, T., Güttler, T., Görlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterisation+of+the+passive+permeability+barrier+of+nuclear+pore+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Characterisation of the passive permeability barrier of nuclear pore complexes.</a> EMBO Journal. 28, 2541-2553 (2009).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Le indagini precedenti di luce-attivato traslocazione delle proteine nel nucleo delle cellule sono stati raggiunti utilizzando in gabbia NLS7,8,9. Come accennato in precedenza, questi metodi richiedono tecniche aggiuntive per incorporare le proteine NLS-etichettate nel citoplasma. Al contrario, nostro tag colla-R Cagedconsente non solo la traslocazione nucleare indotta da foto, ma anche l'assorbimento cellulare degli ...

Il nucleo delle cellule, che porta le informazioni genetiche, è uno degli organelli più importanti come obiettivo subcellulare della droga consegna, dalla modulazione della replica di gene ed espressione è efficace per il trattamento di varie malattie tra cui il cancro e genetica disordini di1,2,3. Per consegna nucleare delle droghe, coniugazione di peptide tag come localizzazione nucleare (NLS) di segnali4,5,6 è stato ampiamente studiato. Tuttavia, al fine di ridurre gli effetti collaterali indesiderati, controllo spazio-temporale della traslocazione nucleare è necessario.
In precedenza, ha attivato luce traslocazione delle proteine nel nucleo delle cellule è stato raggiunto utilizzando in gabbia NLS7,8,9. NLS migra nel nucleo cellulare legandosi a proteine di trasporto citoplasmico6. Nei metodi segnalati, proteine ospite NLS in gabbia del cuscinetto sono direttamente incorporati nel citoplasma di microiniezione8 o espresso nelle celle di destinazione utilizzando un codice genetico espansione tecnica9. Pertanto, un metodo che si può raggiungere sia l'assorbimento cellulare e traslocazione nucleare foto-indotta è vantaggioso per applicazioni pratiche.
Qui, descriviamo la traslocazione nucleare attivato luce di ospiti in cellule viventi utilizzando tag dendritiche colla molecolare in gabbia (Cagedcolla-R, Figura 1). Solubile in acqua molecolare Colle10,11,12,13,14,15,16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 cuscinetto più pendenti Gu+ sono stati sviluppati in precedenza, cui aderiscono strettamente al proteine11,12,13,14,15, 16,17, acidi nucleici18,19,20, fosfolipide membrane21e argilla nanosheets22,23 attraverso la Formazione di ponti più sale tra loro pendenti Gu+ e oxyanionic gruppi sugli obiettivi. I pendenti di Gu+ di Cagedcolla-R sono protetti da un gruppo di photocleavable anionici, nitroveratryloxycarbonyl butirrato-sostituiti (BANVOC). Gli ospiti con etichettati Cagedcolla-R sono presi in vita le cellule tramite endocitosi e soggiorno in endosomi (Figura 2). Al momento photoirradiation, i gruppi NVOC BAdi Cagedcolla-R sono staccati per produrre una uncaged molecolare colla (Uncagedcolla-R) che trasportano più pendenti Gu+ , che poi facilita la migrazione dell'ospite con tag nel citoplasma seguito dal nucleo della cellula (Figura 2). Il tag di colla-R Cagedpuò essere uncaged da esposizione a UV o due-fotone vicino infrarosso (NIR) luce senza serio fototossicità. Dimostriamo la consegna nucleare spatiotemporally controllata di ospiti macromolecolari, nonché ospiti della piccolo-molecola con CagedTag colla-R, utilizzando punti quantici (QD) ed un colorante fluorescente (nitrobenzoxadiazole; NBD), rispettivamente, come esempi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig1.jpg"> Figura 1: Strutture schematiche di Cagedcolla-R. I pendenti di ioni (Gu+) guanidinium 9 Cagedcolla-r sono protetti da un gruppo di nitroveratryloxycarbonyl butirrato-sostituiti (BANVOC). I gruppi NVOC BAsono spaccati da irradiazione con UV o luce di due fotoni NIR. Il nucleo focale della colla Caged-R è funzionalizzato con nitrobenzoxadiazole (NBD) o dibenzocylooctyne (DBCO). Ristampato con il permesso di riferimento20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58631/58631fig2.jpg"> Figura 2: Illustrazione schematica della traslocazione nucleare attivato luce degli ospiti coniugato con un tag di Cagedcolla-R. L'ospite / coniugato colla-RCagedè ripreso in vita le cellule tramite endocitosi. Su photoirradiation, il tag di colla-R Cagedè uncaged cedere un tag colla-R Uncaged, che può facilitare la fuga endosomal dell'ospite con tag. Successivamente, l'ospite con tag migra nel nucleo cellulare. Ristampato con il permesso di riferimento20. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58631/58631fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Azide-PEG4-NHS estere</td><td>Fare clic sugli strumenti chimici</td><td>AZ103</td><td></td></tr><tr><td>Q-dot 655 ITK</td><td>Invitrogen</td><td>Q21521MP</td><td></td></tr><tr><td>Membrana in cellulosa rigenerata (MWCO 3.500)</td><td>NIPPON Genetics</td><td>TOR-3K</td><td></td></tr><tr><td>Membrana in cellulosa rigenerata (MWCO 25.000)</td><td>Harvard Apparatus</td><td>7425-RC25K</td><td></td></tr><tr><td>Hep3B Cells</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td></td></tr><tr><td>Substrato in vetro a 8 camere</td><td>Nunc</td><td>155411JP</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di coltura a 96 pozzetti</td><td>Nunc</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>Terreno essenziale minimo dell'aquila (EMEM)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10370-021</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30406.02</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco (D-PBS)</td><td>Wako Pure Chemical Industrie</td><td>045-29795</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Red</td><td>Lonza Walkersville</td><td>PA-3015</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Dojindo</td><td>H342</td><td></td></tr><tr><td>Kit di conteggio delle cellule-8</td><td>Dojindo</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a scansione laser confocale</td><td>Carl-Zeiss</td><td>LSM 510</td><td>Dotato di laser di eccitazione a due fotoni (laser Mai Tai, Spectra-Physics)</td></tr><tr><td>Laser confocale microscopio a scansione</td><td>Leica</td><td>TCS SP8</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente luminosa allo xeno</td><td>Asahi Spectra</td><td>LAX-102</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre</td><td>Molecular Devices</td><td>SpectraMax Paradigm</td><td></td></tr></tbody></table>

spatiotemporally controllato traslocazione nucleare di ospiti in cellule viventi utilizzando colle molecolare in gabbia come tag fuse

Spatiotemporally Controlled Nuclear Translocation of Guests in Living Cells Using Caged Molecular Glues as Photoactivatable Tags

Il nucleo cellulare è uno degli organelli più importanti come obiettivo subcellulare della droga consegna, dalla modulazione della replica di gene ed espressione è efficace per il trattamento di varie malattie. Qui, dimostriamo che la traslocazione nucleare attivato luce degli ospiti usando in gabbia Tag colla molecolare (Cagedcolla-R), cui più pendenti di guanidinium ione (Gu+) sono protetti da un gruppo di photocleavable anionici (butirrato-sostituiti nitroveratryloxycarbonyl; BA NVOC). Gli ospiti con etichettati Cagedcolla-R sono presi in vita le cellule tramite endocitosi e rimangono in endosomi. Tuttavia, al momento photoirradiation, Cagedcolla-R è convertito in uncaged molecolare colla (Uncagedcolla-R) che trasportano più pendenti Gu+ , che facilita la fuga endosomal e conseguente traslocazione nucleare degli ospiti. Questo metodo è promettente per il nucleare-targeting selettivo sito drug delivery, poiché gli ospiti con tag possono migrare nel citoplasma seguito da nucleo cellulare solo quando photoirradiated. In gabbia Tag: colla-R in grado di fornire macromolecolari ospiti come punti quantici (QD) così come gli ospiti della piccolo-molecola. In gabbia Tag: colla-R può essere uncaged con non solo luce UV, ma anche luce di due fotoni vicino infrarosso (NIR), che possa penetrare in profondità nel tessuto.

Prima photoirradiation, Hep3B cellule incubate con Cagedcolla-NBD ha esibito l'emissione di fluorescenza punctate dal loro interno (λext = 488 nm; Figure 4A e 4C, verde). Un Micrografo analogo è stato ottenuto al momento di eccitazione a 543 nm per colorante rosso fluorescente (figure 4B e 4C, rosso), che indica che il Cagedcolla-NBD localizzata negli endosomi. D...

Questo protocollo descrive la traslocazione nucleare attivato luce di ospiti in cellule viventi utilizzando tag colla molecolare in gabbia. Questo metodo è promettente per il nucleare-targeting selettivo sito drug delivery.

Spatiotemporally controllato traslocazione nucleare di ospiti in cellule viventi utilizzando colle molecolare in gabbia come tag fuse

The cell nucleus is one of the most important organelles as a subcellular drug-delivery target, since modulation of gene replication and expression is ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nell'area del parto dei farmaci, ad esempio come fornire un farmaco a uno specifico cellulare-granulare. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la traslocazione nucleare del gas può essere indotta dalla luce. A dimostrare la procedura saranno Rina Mogaki e Akio Arisaka i laureati del mio gruppo.Per iniziare a preparare la colla molecolare a gabbia legata a punti quantici sintetizzando la colla molecolare in gabbia legata alla dibenzociclottadina come descritto più dettagliatamente altrove. Preparare una soluzione di stock di 10 millimolare della colla molecolare in gabbia legata alla dibenzociclottadina in DMSO secco. Quindi preparare la colla molecolare in gabbia collegata a punti quantici facendo prima punti quantici funzionalizzati aseye.A tal fine aggiungere 100 microlitri di estere PEG4 NHS aseye micromolare in DMF a 400 microlitri di una soluzione DMF contenente 500 nanomolari di punti quantici rivestiti con piolo funzionalizzato all'ammina. Mescolare la miscela per un'ora a temperatura ambiente. Posizionare la soluzione risultante in una membrana di cellulosa rigenerata e dializzarla per 24 ore contro 800 ml di

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SNAP-tag e CLIP-tag sistemi di etichettatura attivare la proteina specifica, attacco covalente di molecole, tra cui coloranti fluorescenti, ad una proteina di interesse in cellule vive. Una volta clonato ed espresso, la proteina tag può essere utilizzato con una varietà di supporti per numerose applicazioni a valle senza dover clonare di nuovo.

Etichettatura fluorescente di COS-7 Esprimendo SNAP-tag proteine ​​di fusione per l&#39;imaging cellulare dal vivo

Microscopia singola molecola approch fornito intuizioni romanzo in trasporto nucleare.

Singola molecola Imaging dei trasporti nucleari

Un metodo per spazio-temporale controllo delle attività di piccola GTPasi dalla luce viene descritta. Questo metodo si basa sulla rapamicina indotta FKBP-FRB eterodimerizzazione e foto-gabbie sistemi. Ottimizzazione di irradiazione di luce permette l'attivazione spazio-temporalmente controllato delle piccole GTPasi a livello subcellulare.

Manipolazione spazio-temporale di attività GTPasi Piccolo a livello subcellulare e su scala temporale di secondi nelle cellule viventi

Fotoattivati ​​microscopia localizzazione (PALM) in combinazione con inseguimento singola molecola permette l'osservazione diretta e la quantificazione delle interazioni proteina-DNA in cellule di Escherichia coli vive.

Visualizzare le interazioni proteina-DNA in cellule vive batteriche Uso fotoattivati ​​singola molecola di monitoraggio

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Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

Questo protocollo descrive un metodo basato su formazione immagine per attivare i linfociti T usando fuse peptide-MHC, consentendo un controllo preciso spazio-temporale dell'attivazione delle cellule T.

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Un'analisi di fluorescenza facile è presentata per valutare l'efficienza di amino-acil-tRNA-sintetasi/tRNA coppie conglobando amino acidi non canonico (ncAAs) proteine espresse nelle cellule di mammifero. L'applicazione di ncAAs per studiare i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) è descritto, tra cui la mappatura foto-reticolazione di associazione siti e bioorthogonal GPCR etichettatura su cellule vive.

Ottimizzando la costituzione genetica di chimico sonde in GPCR per foto-reticolazione Mapping e chimica di Bioorthogonal in cellule di mammiferi dal vivo

Descriviamo come tecniche di micro - e photomanipulation come FRAP e fotoattivazione permettono la determinazione dei parametri di motilità e la dinamica spazio-temporale delle proteine all'interno di migrazione delle cellule. Letture sperimentali includono subcellulare dinamiche e fatturato dei regolatori della motilità o del citoscheletro di actina sottostante.

Tecniche di micromanipolazione che consente analisi delle dinamiche morfogenetiche e fatturato dei regolatori del citoscheletro

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Rilevamento di localizzazione sottocellulare della proteina di verde fluorescenza della proteina Tagging e 4', 6-Diamidino-2-phenylindole macchiatura in Caenorhabditis elegans

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Combinazione di attuatore di forza magnetica 3D e imaging a fluorescenza multifunzionale per studiare la meccanobiologia del nucleo

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Utilizzo degli strumenti di optogenetica LEXY e LINuS e dell'analisi automatizzata delle immagini per quantificare le dinamiche di trasporto nucleocitoplasmatico nelle cellule vive

Scopri la traslocazione nucleare indotta dalla luce in cellule viventi utilizzando tag di colla molecolare in gabbia. Questo metodo consente il targeting selettivo di farmaci al nucleo con applicazioni in terapia genica.

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Spatiotemporally controllato traslocazione nucleare di ospiti in cellule viventi utilizzando colle molecolare in gabbia come tag fuse

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