Name: Arricchire ed espandere cellule T antigene-specifiche rara con nanoparticelle magnetiche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Scopri la tecnica E plus E per arricchire ed espandere cellule T antigene-specifiche rare con nanoparticelle magnetiche. Questo metodo avanzato consente studi di immunologia di base e applicazioni terapeutiche personalizzate.

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J.W.H. grazie NIH cancro nanotecnologia Training Center presso il Johns Hopkins Institute per nanobiotecnologie, la National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1232825) e la Fondazione di archi per il supporto di borsa di studio. Questo lavoro è stato finanziato dal sostegno dei National Institutes of Health (P01-AI072677, R01-CA108835, R21-CA185819), TEDCO/Maryland Innovation Initiative e la Fondazione di Coulter (JPS).

<ol><li>Prasad, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((immunotherapy%3A+Tisagenlecleucel-the+first+approved+Car-t-cell+therapy%3A+implications+for+payers+and+policy+makers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Clinical+Oncology%22%5BJournal%5D)">immunotherapy: Tisagenlecleucel-the first approved Car-t-cell therapy: implications for payers and policy makers.</a> Nature Reviews Clinical Oncology. 15 (1), 11(2018).</li>
<li>Jenkins, M. K., Moon, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+naive+T+cell+precursor+frequency+and+recruitment+in+dictating+immune+response+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The role of naive T cell precursor frequency and recruitment in dictating immune response magnitude.</a> The Journal of Immunology. 188 (9), 4135-4140 (2012).</li>
<li>Rizzuto, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-antigen-specific+CD8%2B+T+cell+precursor+frequency+determines+the+quality+of+the+antitumor+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Self-antigen-specific CD8+ T cell precursor frequency determines the quality of the antitumor immune response.</a> Journal of Experimental Medicine. 206 (4), 849-866 (2009).</li>
<li>Newell, E. W., Davis, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+model+antigens%3A+high-dimensional+methods+for+the+analysis+of+antigen-specific+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Beyond model antigens: high-dimensional methods for the analysis of antigen-specific T cells.</a> Nature biotechnology. 32 (2), 149(2014).</li>
<li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+and+expansion+with+nanoscale+artificial+antigen+presenting+cells+for+adoptive+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Enrichment and expansion with nanoscale artificial antigen presenting cells for adoptive immunotherapy.</a> ACS nano. 9 (7), 6861-6871 (2015).</li>
<li>Kosmides, A. K., Necochea, K., Hickey, J. W., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+T+Cell+Targeting+Components+onto+Magnetically+Clustered+Nanoparticles+Boosts+Activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Separating T Cell Targeting Components onto Magnetically Clustered Nanoparticles Boosts Activation.</a> Nano Letters. , (2018).</li>
<li>Hickey, J. W., Vicente, F. P., Howard, G. P., Mao, H. Q., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologically+Inspired+Design+of+Nanoparticle+Artificial+Antigen-Presenting+Cells+for+Immunomodulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Biologically Inspired Design of Nanoparticle Artificial Antigen-Presenting Cells for Immunomodulation.</a> Nano Letters. 17 (11), (2017).</li>
<li>,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+magnetic+enrichment+of+antigen-specific+T+cells+by+engineering+particle+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Efficient magnetic enrichment of antigen-specific T cells by engineering particle properties.</a> Biomaterials. , (2018).</li>
<li>Oelke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+purification+of+CD8%2B+melan-A-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+for+adoptive+transfer+in+tumor+immunotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Generation and purification of CD8+ melan-A-specific cytotoxic T lymphocytes for adoptive transfer in tumor immunotherapy.</a> Clinical Cancer Research. 6 (5), 1997-2005 (2000).</li>
<li>Riccione, K., Suryadevara, C. M., Snyder, D., Cui, X., Sampson, J. H., Sanchez-Perez, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+CAR+T+cells+for+adoptive+therapy+in+the+context+of+glioblastoma+standard+of+care%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+visualized+experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Generation of CAR T cells for adoptive therapy in the context of glioblastoma standard of care.</a> Journal of visualized experiments: JoVE. (96), (2015).</li>
<li>Ho, W. Y., Nguyen, H. N., Wolfl, M., Kuball, J., Greenberg, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+methods+for+generating+CD8%2B+T-cell+clones+for+immunotherapy+from+the+naive+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+immunological+methods%22%5BJournal%5D)">In vitro methods for generating CD8+ T-cell clones for immunotherapy from the naive repertoire.</a> Journal of immunological methods. 310 (1-2), 40-52 (2006).</li>
<li>Rudolf, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+costimulation+of+human+CD8+T+cells+by+anti-4-1BB+and+anti-CD28+on+synthetic+artificial+antigen+presenting+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+immunology%2C+immunotherapy+%3A+CII%22%5BJournal%5D)">Potent costimulation of human CD8 T cells by anti-4-1BB and anti-CD28 on synthetic artificial antigen presenting cells.</a> Cancer immunology, immunotherapy : CII. 57 (2), 175-183 (2008).</li>
<li>Gulukota, K., Sidney, J., Sette, A., DeLisi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+complementary+methods+for+predicting+peptides+binding+major+histocompatibility+complex+molecules1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Two complementary methods for predicting peptides binding major histocompatibility complex molecules1.</a> Journal of molecular biology. 267 (5), 1258-1267 (1997).</li>
<li>Castle, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+the+mutanome+for+tumor+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Exploiting the mutanome for tumor vaccination.</a> Cancer research. 72 (5), 1081-1091 (2012).</li>
<li>Duan, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+and+bioinformatic+profiling+of+mutational+neoepitopes+reveals+new+rules+to+predict+anticancer+immunogenicity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Genomic and bioinformatic profiling of mutational neoepitopes reveals new rules to predict anticancer immunogenicity.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (11), 2231-2248 (2014).</li>
<li>Srivastava, P. K., Duan, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+antigenic+fingerprint+of+each+individual+cancer+for+immunotherapy+of+human+cancer%3A+genomics+shows+a+new+way+and+its+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Immunology%2C+Immunotherapy%22%5BJournal%5D)">Harnessing the antigenic fingerprint of each individual cancer for immunotherapy of human cancer: genomics shows a new way and its challenges.</a> Cancer Immunology, Immunotherapy. 62 (5), 967-974 (2013).</li>
<li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Predicting+immunogenic+tumour+mutations+by+combining+mass+spectrometry+and+exome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing.</a> Nature. 515 (7528), 572(2014).</li>
<li>Gros, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+neoantigen-specific+lymphocytes+in+the+peripheral+blood+of+melanoma+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of neoantigen-specific lymphocytes in the peripheral blood of melanoma patients.</a> Nature medicine. 22 (4), 433(2016).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano l'interesse finanziario concorrenti seguenti: sotto un accordo di licenza tra NexImmune e The Johns Hopkins University, Jonathan Schneck ha diritto a una quota di royalty ricevute dall'Università sulle vendite dei prodotti descritti in questo articolo. Fu anche dei fondatori di NexImmune e possiede partecipazioni in società. Egli serve come un membro del Consiglio di amministrazione e il comitato consultivo scientifico di NexImmune. I termini di tali disposizioni hanno stati esaminati e approvati dal The Johns Hopkins University secondo le proprie politiche di conflitto di interessi.

Abbiamo creato una tecnologia di isolamento di romanzo delle cellule di T antigene-specifiche basata su nanoparticelle artificiale antigene che presenta le cellule (aAPCs). AAPCs di nanoparticelle hanno peptide-caricato MHC sulla superficie che permette l'associazione di cellule T antigene-specifiche e attivazione al fianco di costimolazione attivazione. aAPCs sono anche paramagnetico e quindi può essere utilizzato per arricchire le cellule T antigene-specifiche rare usando un campo magnetico. Abbiamo ottimizzato e studi...

Con l'ascesa di molte immunoterapie, c'è la necessità di essere in grado di caratterizzare e controllare le risposte immunitarie. In particolare, la risposta immunitaria adattativa è di interesse a causa della specificità e la durata delle cellule. Recentemente, le terapie con cellule T-antigene-recettore chimerico sono state approvate per la terapia del cancro; Tuttavia, l'antigene-recettori sono basati fuori il comune cellula antigene di superficie CD19, invece gli antigeni specifici per il cancro1. Di là della specificità, immunoterapie possono anche soffrire la mancanza di controllo e limitata comprensione della risposta immunitaria dinamica all'interno di cancro o autoimmunità.
Una delle sfide di studiare risposte antigene-specifiche è la loro frequenza estremamente bassa, ad es., cellule T antigene-specifiche sono 1 di ogni 104 106 T cellule2,3. Così, per indagare quali T sono presenti cellule o blocca, le cellule hanno bisogno di essere arricchito e ampliato, o loro segnale bisogno di essere amplificato. È costoso e difficile da mantenere le cellule di alimentatore utilizzando le attuali tecniche che si concentrano sull'espansione delle cellule antigene-specifiche. Le attuali tecniche che si concentrano su amplificando il segnale di T antigene-specifiche cellule, come l'enzima-collegata immunospot (ELISPOT) dosaggio, limitare il riutilizzo di tali cellule di T4. Infine, a causa della bassa sensibilità, spesso queste due tecniche devono essere combinati per enumerazione antigene-specifici.
Per risolvere questi problemi, abbiamo sviluppato l'antigene artificiale basata su nanoparticelle magnetiche presentazione cella (aAPC)5,6,7,8. Il aAPC possono essere funzionalizzati con un complesso antigene-specifico peptide segnale caricato istocompatibilità (pMHC) - e molecole costimolatorie -ad es., un anticorpo anti-CD28-ad entrambi arricchire cellule T antigene-specifiche e poi successivamente stimolare la loro espansione (Figura 1). Le particelle possono essere così un prodotto redditizio standard che possa essere sia personalizzato per soddisfare antigene-specifiche stimolazioni ancora standardizzato attraverso esperimenti e pazienti. Eseguendo l'arricchimento e l'espansione elaborare risultati in centinaia di migliaia-fold espansione di cellule CD8 + T antigene-specifiche e può provocare frequenze fino al 60% dopo appena una settimana, che permette la caratterizzazione o l'uso terapeutico di grandi numero di celle. Qui, descriviamo come fare aAPCs di nanoparticelle, alcune considerazioni di progettazione critici nella scelta delle proprietà delle nanoparticelle ed illustrano alcuni risultati tipici da utilizzando queste particelle in isolamento ed espansione raro antigene-specifiche cellule T CD8 +.

<table><tbody><tr><td>DimerX I: Proteina di fusione umana dimerica ricombinante solubile HLA-A2:Ig</td><td>BD Biosciences</td><td>551263</td><td></td></tr><tr><td>DimerX I: Dimero ricombinante solubile di topo H-2D[b]:Ig</td><td>BD Biosciences</td><td>551323</td><td></td></tr><tr><td>DimerX I: Proteina di fusione dimerica ricombinante solubile H-2K[b]:Ig BD</td><td>Biosciences</td><td>550750</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 20 MWCO 50 000</td><td>GE Life Sciences</td><td>28932362</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 2 MWCO 50 000</td><td>GE Life Sciences</td><td>28932257</td><td></td></tr><tr><td>Microglobulina Beta 2 umana purificata</td><td>Bio-Rad</td><td>PHP135</td><td></td></tr><tr><td>nanomag-D-spio, NH2, nanoparticelle da 100 nm</td><td>Micromod</td><td>79-01-102</td><td></td></tr><tr><td>Super Mag NHS Activated Beads, 0,2 e micro; m</td><td>Oceano Nanotech</td><td>SN0200&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Microsfere anti-biotina UltraPure</td><td>Miltenyi</td><td>130-105-637</td><td></td></tr><tr><td>EZ-Link NHS-Biotina</td><td>ThermoFisher</td><td>20217</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-SMCC Crosslinker&nbsp;</td><td>ProteoChem</td><td>c1109-100mg</td><td></td></tr><tr><td>2-Iminotiolano cloridrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6256 Sigma&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti Micropiastra a mezza area, polistirene nero</td><td>Corning</td><td>3875</td><td></td></tr><tr><td>FITC Rat Anti-Mouse Ig, &lambda; 1, &lambda; 2, & &lambda; 3 Catena leggera&nbsp; Clonare &nbsp; R26-46&nbsp; &nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>553434</td><td></td></tr><tr><td>FITC Topo Anti-Armeno e Criceto Siriano IgG&nbsp; Clonare &nbsp; G192-1</td><td>BD Bioscienze</td><td>554026</td><td></td></tr><tr><td>B6. Topi Cg-Thy1a/Cy Tg(TcraTcrb)8Rest/J (PMEL transgenico)</td> Jackson <td>Laboratory</td><td>005023</td><td></td></tr><tr><td>Topi C57BL/6J (B6 wildtype)</td> Jackson <td>Laboratory</td><td>000664</td><td></td></tr><tr><td>Kit di isolamento delle cellule T CD8a+, Colonne</td><td>Miltenyi</td><td>130-104-075</td><td></td></tr><tr><td>MS Miltenyi</td><td></td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>Colonne LS</td><td>Miltenyi</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina-Ficoeritrin, SAv-PE</td><td>Biolegend</td><td>405203</td><td></td></tr><tr><td>magneti a disco N52 da 0,75 pollici.</td><td>K& J Magnetics</td><td>DX8C-N52</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-topo CD8a Anticorpo, clone 53-6.7</td><td>Biolegend</td><td>100711</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit di colorazione per cellule morte verdi fissabili, per eccitazione a 488 nm.</td><td>ThermoFisher</td><td>L-34969</td><td></td></tr></tbody></table>

arricchire ed espandere cellule t antigene-specifiche rara con nanoparticelle magnetiche

Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles

Abbiamo sviluppato uno strumento per arricchire ed espandere cellule T antigene-specifiche. Ciò può essere utile in casi come A) rilevare l'esistenza di cellule T antigene-specifiche, B) sonda la dinamica delle risposte antigene-specifiche, C) capire come risposte antigene-specifiche influenzano lo stato di malattia come autoimmunità, D) demistificare eterogenei risposte per le cellule T antigene-specifiche, o E) utilizzano cellule antigene-specifiche per la terapia. Lo strumento si basa su una particella magnetica che abbiamo coniugato antigene-specifiche e segnali co-stimolatori delle cellule T, e che definiamo come artificiale antigene che presenta le cellule (aAPCs). Di conseguenza, poiché la tecnologia è semplice da produrre, si può facilmente essere adottata da altri laboratori; così, il nostro scopo qui è di descrivere dettagliatamente la fabbricazione e l'uso successivo della aAPCs. Spieghiamo come collegare segnali co-stimolatori e antigene-specifici per il aAPCs, come utilizzarli per arricchire di cellule T antigene-specifiche e come espandere le cellule T antigene-specifiche. Inoltre, evidenzieremo progettazione considerazioni basate su informazioni sperimentali e biologici della nostra esperienza con la caratterizzazione di cellule T antigene-specifiche.

Per completare un arricchimento di successo e l'espansione di cellule T antigene-specifiche, il peptide-caricato MHC-Ig e molecole costimolatorie devono essere correttamente collegati alla particella aAPC. Basato sui 3 metodi di attacco delle particelle, forniamo alcuni dati rappresentativi per un risultato di successo coniugazione procedura (Figura 5a). Infatti, se la densità di ligando è troppo bassa, quindi non ci sarà un'efficace stimolazione delle cellul...

Cellule T antigene-specifiche sono difficili da caratterizzare o utilizzare in terapie grazie alla loro frequenza estremamente bassa. Qui, forniamo un protocollo per sviluppare una particella magnetica che si può associare a cellule T antigene-specifiche per arricchire queste cellule e quindi di espanderli diversi moltiplicati per la caratterizzazione e la terapia.

Arricchire ed espandere cellule T antigene-specifiche rara con nanoparticelle magnetiche

We have developed a tool to both enrich and expand antigen-specific T cells. This can be helpful in cases such as to A) detect the existence of ...

Quindi il principale vantaggio della nostra nuova tecnica, l'abbiamo chiamata E più E, che sta per arricchimento più espansione, è che possiamo arricchire ed espandere queste cellule, cellule rare specifiche dell'antigene, contemporaneamente. Questo ci permette di sviluppare un numero sufficiente di cellule che saremo in grado di utilizzare per indagare il loro ruolo in diversi contesti e in diversi contesti clinici o anche per perrci di sviluppare ora un gran numero di cellule che possiamo utilizzare per l'immunoterapia in un modo che prima non potevamo. Il metodo che abbiamo sviluppato, questo E più E, può aiutare a rispondere a domande chiave nell'immunologia di base sulla presenza di neoepitopi.Cosa sono i neoepitopi? Queste sono le epitopi personalizzate che sappiamo essere ora molto importanti in termini di immunoterapia oncologica e anche di dinamiche specifiche dell'antigene e di come questi fattori influenzano gli stati delle malattie e per una terapia cellulare efficace. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso l'immunoterapia, poiché la cellula artificiale che presenta l'antigene della nanoparticella potrebbe essere un prodotto preconfezionato che è facilmente su misura per le risposte immunitarie dei singoli pazienti.Per generare cellule antigene artificiali nanoparticelle, rimescolare le particelle liofilizzate in un millilitro di tampone di resuspensione e vortice vigorosamente la sospensione per almeno 15 minuti fino a quando non sono visibili aggregati. Particelle non sufficientemente vortici e rimorsizzate prima della reazione con le proteine si tradurranno in particelle aggregate più grandi che non sono in grado di essere dissociate. Posizionare le particelle magnetiche su un supporto magnetico per rimuovere il supernatante e rimescolarle con 0,5 millilitri di tampone di resuspensione fresco.Trasferire la sospensione delle particelle su una fiala di scintillazione di vetro per il vortice fino a quando non sono visibili aggregati e aggiungere 0,1 milligrammi di segnali stimolanti totali per un milligrammo di particelle rimorsi. Dopo il vortice, lasciare che la sospensione reagisca per 2,5 ore a temperatura ambiente con miscelazione in un rotatore, seguita dall'aggiunta di 0,1 millilitri di tampone di tempra per un'ulteriore incubazione di 30 minuti a temperatura ambiente con miscelazione. Al termine della seconda reazione, posizionare il flaconcino a scintillazione sul supporto magnetico e lavare le particelle in un millilitro di tampone di resuspensione quattro volte, rimuovendo il tampone quando diventa chiaro dopo ogni lavaggio e sostituendolo con un fresco tampone di resopensione per il successivo lavaggio sul magnete.Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare la soluzione e rimuovere le particelle dal supporto magnetico, quindi conservare le particelle in un millilitro di tampone di resuspensione fresco a quattro gradi Celsius per un massimo di sei mesi. Per isolare le cellule CD8+T specifiche dell'antigene, macerare le milza e i linfonodi dai topi 6J neri di tipo selvaggio C57 attraverso un filtro cellulare sterile da 70 micrometri con frequenti risciacqui PBS e utilizzare un kit di isolamento cellulare CD8+T senza contatto secondo le istruzioni del produttore per eliminare le cellule non CD8+T. Dopo il conteggio, raccogliere le cellule CD8+T isolate mediante centrifugazione e rimosogliere il pellet in 100 microlitri di PBS integrati con albumina siere bovina allo 0,5% e EDTA bimolare, quindi incubare le cellule con le cellule di presentazione dell'antigene artificiale della nanoparticella in modo che ci siano una volta 10 all'11 ° MHC-ig caricato peptidico per uno per 10 alla sesta cellule CD8 +T isolate in un sterile , tubo a fondo rotondo in polistirolo da cinque millilitri per un'ora a quattro gradi Celsius con miscelazione continua.Al termine dell'incubazione, lavare la sospensione cellulare della nanoparticella tre volte sul supporto magnetico come dimostrato, riutilizzando le cellule artificiali che presentano l'antigene e le cellule CD8+T arricchite in 500 microlitri di mezzo fresco e integrato con fattore di crescita cellulare 1%T dopo l'ultimo lavaggio. Per il massimo recupero cellulare, è fondamentale lasciare le particelle e le cellule sulla colonna magnetica per almeno due minuti e aspirare attentamente il buffer senza interrompere le particelle e le cellule soggette al campo magnetico. Dopo il conteggio, sementi 2,5 volte 10 alla quinta cellule CD8+T arricchite e miscela di particelle magnetiche per 160 microlitri di mezzo integrato più 1%TCGF in una piastra con fondo a U da 96 po '.Il terzo giorno, nutrire le cellule con 80 microlitri di mezzo integrato con un fattore di crescita cellulare del 2%T per pozzo e riportare la piastra all'incubatore di coltura cellulare per altri quattro giorni. Il settimo giorno, raccogliere le cellule stimolate in un tubo a fondo rotondo da cinque millilitri per contare e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Rimescolare il pellet in 0,5 millilitri di PBS integrato con lo 0,05% di azide di sodio e il siero bovino fettale al 2% per il conteggio e aliquota da cinque volte 10 alla quarta o cinque volte 10 alla quinta colonna in nuovi tubi a fondo rotondo da cinque millilitri per la colorazione specifica dell'antigene.Etichettare i tubi appropriati con MHC-ig biotinilato e CD8a anti-mouse per un'ora a quattro gradi Celsius, seguito da un lavaggio di centrifuga in PBS fresco per rimuovere qualsiasi immunoglobulina biotinilata in eccesso, quindi macchiare i campioni con un anticorpo secondario coniugato con streptavidina appropriato e un ceppo di cellule morte fissibile vivo-morto appropriato per 15 minuti a quattro gradi Celsius e leggere le cellule su un citometro a flusso per determinare la specificità e il numero delle cellule CD8+T specifiche dell'antigene secondo protocolli standard. Qui è stata ottenuta una coniugazione proteica di successo utilizzando tre diversi metodi di attaccamento proteico alle particelle. Se la densità del ligando aAPC è troppo bassa, non ci sarà una stimolazione efficace delle cellule CD8+T specifiche dell'antigene.Il controllo di qualità del dimero biotinilato può essere completato su cellule CD8+T transgeniche per verificare la colorazione. Ad esempio, questi risultati rappresentativi dimostrano una colorazione positiva con celle CD8+T specifiche di gp100 con celle CD8+T b6 non specifiche dell'antigene come controllo di sfondo. Inoltre, la conoscenza della colorazione di fondo del dimero biotinilato è critica, in quanto qualsiasi percentuale inferiore a questa colorazione nei tubi macchiati di affini dovrebbe essere considerata un risultato negativo.Dopo sette giorni di arricchimento ed espansione, da due per 10 a quattro e due volte 10 alla quinta cella specifica dell'antigene e da cinque a 50%CD8+T ci si può aspettare da un originale cinque per 10 alla sesta popolazione iniziale di cellule CD8+T endogene. La stessa metodologia può essere utilizzata per isolare e stimolare cellule CD8+T specifiche dell'antigene umano con aumenti simili delle percentuali e del numero di cellule CD8+T specifiche dell'antigene osservate dopo una sola settimana di espansione dopo l'arricchimento. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di eseguire i controlli di qualità dei reagenti appropriati come descritto.Seguendo questa procedura, altri metodi come la citometria a flusso per la colorazione intracellulare delle citochine o l'espressione proteica superficiale possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive sulla funzionalità o sul fenotipo delle cellule. Questa tecnica apre la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia di base per esplorare l'ampiezza, la profondità e la dinamica delle risposte specifiche dell'antigene in altri campi biomedici come il cancro, le malattie infettive o la ricerca autoimmunità.

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Qui si descrive un metodo per l'attivazione ed espandere cellule NKT dal bulk popolazioni di cellule T usando cellule presentanti antigene artificiali (AAPC). L'uso di CD1d basata AAPC fornisce un metodo standard per la generazione di numeri elevati di cellule NKT funzionali.

Antigen Presenting artificiale cellulare (AAPC) Attivazione mediata ed espansione delle cellule Natural Killer T

Questo protocollo descrive l'uso del peptide: MHC tetrameri e microsfere magnetiche per isolare popolazioni bassa frequenza di epitopo-specifiche cellule T e analizzarli mediante citometria a flusso. Questo metodo consente lo studio diretto delle popolazioni di cellule T endogene di interesse...

Peptide: MHC Tetramero basata Arricchimento di epitopi specifici per cellule T

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Arricchimento delle cellule T: una tecnica per isolare le cellule T da una popolazione di cellule miste mediante separazione magnetica

Questo video descrive un protocollo per isolare le cellule T CD8+ specifiche per l'antigene raro utilizzando cellule artificiali presentanti l'antigene (aAPC) basate su nanoparticelle magnetiche funzionalizzate con MHC-Ig caricate con peptidi antigenici e anticorpi anti-CD28. L'interazione delle aAPC con le cellule T CD8+ che esprimono specificamente i recettori delle cellule T antigeniche bersaglio per i peptidi, seguita dalla loro espansione in vitro, provoca l'arricchimento e l'espansione di...

Arricchimento ed espansione basati su nanoparticelle di cellule T CD8+ antigene-specifiche

Qui, descriviamo un protocollo per la sintesi di nanoparticelle magneto-plasmonica con un forte momento magnetico e un forte vicino infrarosso (NIR) assorbanza. Il protocollo include anche anticorpi coniugazione alle nanoparticelle attraverso la porzione Fc per varie applicazioni biomediche che richiedono il targeting molecolare specifico.

Sintesi di Immunotargeted magneto-plasmonica nanocluster

Qui presentiamo un protocollo adattato che può essere utilizzato per generare un gran numero di cellule T natural killer invarianti murine dalla milza di topo. Il protocollo delinea un approccio attraverso il quale le cellule spleniche iNKT possono essere arricchite, isolate ed espanse in vitro utilizzando un numero limitato di animali e reagenti.

Un metodo ottimizzato per l&#39;isolamento ed espansione invariante Natural Killer cellule T da Spleen mouse

Viene presentato un protocollo per la sintesi e la cationizzazione della magnetoferritina drogata con cobalto, nonché un metodo per magnetizzare rapidamente le cellule staminali con magnetoferritina cationizzata.

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Un metodo semplice ma efficace che si avvale di nanoparticelle magnetiche per rilevare e arricchire le cellule B antigene-reattiva per l'analisi funzionale e fenotipica è descritto.

Rilevamento e l&#39;arricchimento di Rare antigene-specifiche cellule B per l&#39;analisi del fenotipo e funzione

Descriviamo un protocollo rapido e robusto per arricchire le cellule T natural killer invarianti (iNKT) dalla milza di topo ed espanderle in vitro a numeri adatti per studi in vitro e in vivo.

Purificazione ed espansione di cellule T Natural Killer invarianti di topo per studi in vitro e in vivo

Forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e l'identificazione di rare popolazioni di cellule T antigene-specifiche nei polmoni di topo attraverso l'arricchimento di cellule T basato su biglie magnetiche e i tetrameri peptide:complesso maggiore di istocompatibilità (MHC).

Identificazione di rare cellule T antigene-specifiche da polmoni di topo con tetrameri del complesso peptide:istocompatibilità maggiore

Scopri la tecnica E plus E per arricchire ed espandere cellule T antigene-specifiche rare con nanoparticelle magnetiche. Questo metodo avanzato consente studi di immunologia di base e applicazioni terapeutiche personalizzate.

Arricchire ed espandere cellule T antigene-specifiche rara con nanoparticelle magnetiche

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