Name: Flusso Cytometric Detection neonata al seno cancro cellule staminali-come delle cellule dopo linversione di apoptosi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 21 s
Description: Scopri come isolare cellule di cancro al seno apoptotiche mediante FACS e analizzare la transizione verso cellule staminali tumorali con citometria a flusso. Questo metodo avanzato migliora la comprensione del comportamento cellulare post-apoptosi.

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Questo lavoro è stato supportato dalla innovativa tecnologia fondo di innovazione tecnologia Commissione: supporto finanziamenti dal laboratorio chiave dello stato di Istittuto (CUHK), al fondo di ricerca biomedica Lo Kwee-Seong e Lee Hysan Foundation. Y.X. è stato sostenuto da studentship post-laurea dal CUHK.

1. preparazione del seno cancro cellule staminali Non
<ol><li>Cultura MCF-7 e cellule MDA-MB-231 in 10 mL di medium di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 privo di rosso fenolo supplementato con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS) in un piatto di 100 mm. Cultura T47D in 10 mL di fenolo rosso privo RPMI 1640 supplementato con 2 mM L-Glutammina, 10% inattivati FBS e 1% v/v penicillina-streptomicina (PS) in un piatto di 100 mm. Cellule di coltura a 37 ° C in un'incubatrice di coltura cellulare di 5% CO295% aria. Nota: Rosso fenolo colpisce rilevamento basati sulla fluorescenza ma ha anche una potenziale influenza sulla crescita delle cellule di cancro al seno a causa dei suoi effetti estrogeno-simile31. Ad esempio, rosso fenolo potrebbe stimolare il ricevitore del progesterone e la crescita di cellule MCF-731. Potrebbe inoltre incentivare la crescita di cellule di T47D31.</li>
	<li>Lavare le cellule con 2 mL di fosfato tampone salino (PBS) due volte. Aggiungere 2 mL di tripsina-EDTA 0,05% a MCF-7 e MDA-MB-231 o 2 mL di 0,25% tripsina-EDTA a cellule T47D. Nota: La concentrazione di tripsina-EDTA necessari per la separazione delle cellule fra tipi di cellule di cancro al seno diversi variare mentre una concentrazione inappropriata può influenzare il pattern di espressione di alcuni marcatori di superficie cellulare come CD44 e CD2432.</li>
	<li>I piatti per 5 min a 37 ° C in atmosfera di 5% CO295% aria della coltura. Controllare frequentemente il distacco delle cellule sotto il microscopio di prevenire le cellule da sovra-digestione con tripsina-EDTA.</li>
	<li>Quando oltre il 90% cellule scollegare, aggiungere 5 mL di medium RPMI completate il piatto e pipetta sopra la superficie di strato delle cellule diverse volte.</li>
	<li>Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 300 x g e a 4 ° C per 5 min. Nota: Solitamente, circa 6 x 106 cellule possono essere ottenute da un piatto di 100 mm quando il confluency raggiunge il 70%.</li>
	<li>Eliminare il supernatante e risospendere il pellet in 106 cellule/100 μL di tampone di FACS (PBS contenente 0.5% di BSA e 0,1% di sodio azide) in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL.</li>
	<li>Dividere le celle in diversi tubi. Per cellule MCF-7, dividere le celle in 4 tubi: due per isotipo controlli, uno per singolo CD24 colorazione come controllo positivo CD24 e uno per la doppia colorazione.</li>
	<li>Per le cellule T47D, dividere le celle in 3 tubi: due per controlli di isotipo e uno per la doppia colorazione.</li>
	<li>Per le cellule MDA-MB-231, dividere le celle in 4 tubi: due per isotipo controlli, uno per CD44 singola colorazione come controllo positivo CD44 e uno per la doppia colorazione.</li>
	<li>Centrifugare le provette nuovamente a 300 x g e a 4 ° C per 5 min. eliminare il supernatante e quindi aggiungere blocco Fc diluito 01:50 nel buffer di FACS.</li>
	<li>Incubare i campioni in ghiaccio per 20 minuti al buio prima centrifugazione a 300 x g e 4 ° C per 5 min, scartare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere fluorocromo-coniugate di anticorpi monoclonali contro umano CD44 (PerCP-Cy 5.5) e CD24 (PE) a diluizioni 01:40 e 01:10 (nel buffer di FACS) in dual macchiatura gruppi. Per i controlli positivi, aggiungere CD44 (PerCP-Cy 5.5) per MDA-MB-231 e aggiungere CD24 (PE) alle cellule MCF-7 alla stessa concentrazione, rispettivamente. Nota: La combinazione di CD44 e C24 è stato comunemente utilizzata in seno CSC Studio26,27,28,29,30.</li>
	<li>Per i gruppi di controllo di isotipo, aggiungere PerCP-Cy 5.5 Mouse IgG2b, κ presso un 01:40 diluizione come il controllo di isotipo per CD44 anticorpi e PE Mouse IgG2a, κ presso un 01:10 diluizione come il controllo di isotipo per CD24 anticorpi alle 106 cellule/100 μL. Nota: Isotype controlli per gli anticorpi di interesse sono raccomandati come controlli negativi33.</li>
	<li>Incubare i campioni (da passaggi 1.12 e 1.13) a 4 ° C al buio per 30 min. Centrifugare a 300 x g e 4 ° C per 5 min, scartare il surnatante.</li>
	<li>Lavare la pallina due volte con 500 μL di PBS e centrifugare a 300 x g e a 4 ° C per 5 min.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 0,5 mL di PBS e filtrare attraverso una rete di nylon di 40 µm prima di eseguire su un sorter fluorescenza-attivato delle cellule.</li>
	<li>Per scopi di gating e compensazione, macchia cellule MCF-7 con gli anticorpi anti-CD24 PE-coniugati e macchiare le cellule MDA-MB-231 con gli anticorpi anti-CD44 PerCP-Cy 5.5-coniugato come controlli positivi. Utilizzare le cellule colorate con isotipo controlli come controlli negativi (Figura 1).</li>
	<li>Raccogliere le cellule con CD44–/CD24+ marcatori in tubi di turno-fondo polistirolo 12x75 mm contenente 1 mL di mezzo di raccolta (privo di rosso fenolo RPMI 1640 supplementato con 20% inattivati FBS e 2% v/v PS). Centrifugare le provette a 300 x g e RT per 5 min e scartare il surnatante. Nota: CSC-come le cellule in cellule di cancro al seno sono definite come CD44+/CD24– cellule26,27,28,29,30e il seno non-staminali cellule tumorali sono definiti come CD44–/CD24+ cellule18 (Figura 1).</li>
	<li>Piastra di cellule di cancro non-staminali del seno ordinato nella piastra di coltura contenenti terreno collezione fresca per la ulteriore coltura a 37 ° C in 5% CO2 incubatrice della coltura cellulare.</li>
</ol>2. rilevamento e induzione apoptotica
<ol><li>Preparare 1 mM staurosporine12,34 in DMSO. Per il gruppo trattato di MCF-7, aggiungere 25 μL di 1mm staurosporine al medium completato delle cellule MCF-7 di rendere fino a 10 mL di volume finale (2,5 μM staurosporine) in una provetta conica da 15 mL. Pipetta per mescolare il contenuto in modo uniforme.</li>
	<li>Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule, lavare le cellule con 2 mL di PBS una volta. Quindi aggiungere i 10 mL di medium con 2,5 μM staurosporine alle cellule MCF-7 per 6 h di indurre apoptosi quando raggiunge la densità delle cellule confluency di 70%.</li>
	<li>Preparare 1 mM paclitaxel35,36 in DMSO. Per il gruppo trattato di T47D, aggiungere 12,5 μL di paclitaxel 1 mM al medium completato delle cellule T47D per rendere ad un volume finale di 10 mL (5 μM paclitaxel) in una provetta conica da 15 mL. Pipetta per mescolare il contenuto in modo uniforme.</li>
	<li>Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule e lavare le cellule con 2 mL di PBS una volta. Quindi aggiungere i 10 mL di medium con 5 μM paclitaxel alle cellule T47D per 10 h per indurre apoptosi quando raggiunge la densità delle cellule confluency di 70%. Nota: Il tempo di induzione e la concentrazione degli induttori che inducono apoptosi dovrebbe essere ottimizzati ogni volta che una nuova linea di cella viene utilizzata per la prima volta.</li>
	<li>Per il gruppo solvente-trattato di MCF-7, aggiungere 25 μL di sterile dimetilsolfossido (DMSO) al medium completato delle cellule MCF-7 per rendere ad un volume finale di 10 mL (cioè, 0,25% v/v DMSO) in una provetta conica da 15 mL. Pipetta per mescolare il contenuto in modo uniforme.</li>
	<li>Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule MCF-7 trattate solvente, lavare una volta con 2 mL di PBS. Quindi aggiungere i 10 mL di medium con 0,25% v/v DMSO per 6 h come il controllo solvente per STS.</li>
	<li>Per il gruppo di T47D solvente-trattati, aggiungere 5 μL di DMSO sterile al medium completato delle cellule T47D per portare a 10 mL di volume finale (cioè, 0.05% v/v DMSO) in una provetta conica da 15 mL. Pipetta per mescolare il contenuto in modo uniforme.</li>
	<li>Rimuovere il terreno di coltura dalle cellule T47D trattate solvente, lavare una volta con 2 mL di PBS. Quindi, aggiungere 10 mL di medium con 0.05% v/v DMSO per 10 h come il controllo solvente per il paclitaxel.</li>
	<li>Per osservare i cambiamenti morfologici delle cellule trattate, macchia le cellule con 50 nM Mitotracker Red CMXRos e 250 ng/mL Hoechst 33342 e incubare per un altro 20 min a 37 ° C in atmosfera di aria di 95% di 5% CO2. Osservare la morfologia delle cellule apoptotiche tipiche sotto un 60 x laser confocale scansione microscopio (Figura 2). Nota: Apoptosi tipica morfologia include restringimento delle cellule, blebbing membrana, mitocondri frammentazione e condensazione nucleare ma con membrana cellulare intatta12,13,14,15 ,18,37.</li>
</ol>3. isolamento di cellule apoptotiche e procedura di inversione di apoptosi
<ol><li>Macchia apoptotica induttore solvente trattati e MCF-7 o cellule T47D con tintura di Caspase-3/7 verde rilevazione 3 μM nella concentrazione delle cellule/ml al buio per 30 min a 37 ° C in atmosfera di 5% CO295% aria 10-6.</li>
	<li>Filtrare le cellule attraverso una rete di nylon di 40 µm prima di eseguire l'ordinatore per l'ordinamento.</li>
	<li>Per scopi di gating, primo cancello la popolazione principale (R1) ed escludere i detriti tracciando il grafico in punti con forward scatter e dispersione laterale (Figura 3).</li>
	<li>Utilizzare le cellule non trattate senza aggiungere il colorante di Caspase-3/7 verde rilevazione come controllo negativo al cancello della regione negativa (R2) (Figura 3A).</li>
	<li>Utilizzare le cellule trattate con staurosporine12,18,34 per 24 h e colorate con il colorante come controllo positivo al cancello della regione positiva (R3) (Figura 3B).</li>
	<li>Raccogliere le cellule positive (R3) dei gruppi trattati con induttore in tubi di turno-fondo polistirolo 12x75 mm contenente 1 mL di mezzo di raccolta (stesso come il mezzo di raccolta nel passaggio 1.18) (figure 3C-3D). Centrifugare le provette a 300 x g e RT per 5 min e scartare il surnatante.</li>
	<li>Raccogliere le cellule negative (R2) da gruppi trattati con solvente in provette di polistirene di turno-fondo 12 × 75 mm con 1 mL di mezzo di raccolta come al punto 3.6 (figure 3E-3F). Nota: Una piccola porzione di celle (ad esempio 10.000 cellule) possa essere raccolti ed eseguire nuovamente ordinatore per controllare il modello del marcatore di caspases attivi. Se oltre il 90% di cellule trattate con solvente ordinate sono mostrati nella regione caspase-negativi o oltre il 90% di cellule trattate con induttore ordinate sono mostrati nella regione caspase-positivi, queste cellule prelevate sono credute per essere relativamente puro (figure 3C-3F). In caso contrario, la regione di ordinamento e/o la sequenza deve essere reimpostata.</li>
	<li>Risospendere le cellule ordinate in mezzo collezione fresca e semi in piastre di coltura del tessuto 12-pozzetti e coltura a 37 ° C in un'atmosfera di 5% CO295% aria per 7 giorni per l'inversione di apoptosi.</li>
</ol>4. conferma dell'apoptosi in cellule di Caspase-attivata
<ol><li>Mix 10 mM HEPES, 140 mM NaCl e 2,5 mM CaCl2 per preparare annessina-associazione tampone (pH 7,4). Conservare il tampone a 4 ° C ed evitare il buffer per esporre alla luce.</li>
	<li>Preparare una soluzione di lavoro 100 µ g/mL di ioduro di propidio (PI) diluendo 5 µ l di 1 mg/mL soluzione di riserva di PI in 45 µ l di tampone di annessina-associazione. Conservare la soluzione a 4 ° C ed evitare la soluzione per esporre alla luce. Nota: PI è un potenziale mutageno e deve essere maneggiato con cura.</li>
	<li>Preparare le cellule induttore-trattate come nei passaggi 2.1 a 2.5.</li>
	<li>Raccogliere l'induttore-trattati MCF-7 o cellule T47D pipettando il mezzo sopra lo strato delle cellule 3-5x per staccare le cellule. Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL.</li>
	<li>Centrifugare a 300 x g e RT per 5 min, scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule con il mezzo completato presso la concentrazione cellulare di 106/ml in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL e macchiare le cellule con 3 della tintura di verde rilevazione di Caspase 3/7 μM al buio per 30 min a 37 ° C.</li>
	<li>Centrifugare a 300 x g e RT per 5 min. scartare i sovranatante.</li>
	<li>Lavare le cellule con 1 mL di PBS ghiacciata e centrifugare a 300 x g e 4 ° C per 5 min, eliminare i sovranatante.</li>
	<li>Risospendere le cellule in 100 μL di tampone di annessina-associazione con l'aggiungere 5 μL del coniugato Annessina V e 1 µ l di 100 µ g/mL PI soluzione di lavoro per ogni 100 µ l di sospensione cellulare e incubare le cellule per 15 min a temperatura ambiente. Nota: Annessina V e PI sono insieme comunemente usate per marcare le cellule apoptotiche in flusso cytometry38,39,40.</li>
	<li>Aggiungere 400 µ l di tampone di annessina-associazione, mix delicatamente. Mantenere i campioni sul ghiaccio prima di eseguire su un citometro a flusso.</li>
</ol>5. misurazione del seno CSC-come le cellule tramite flusso Cytometry
<ol><li>La MCF-7 invertita in entrambi i gruppi induttore o solvente-trattati con tripsina-EDTA 0,05% della raccolta. Raccogliere cellule T47D in entrambi i gruppi trattati di induttore o solvente o con 0,25% tripsina-EDTA come nei passaggi 1.2 a 1.5.</li>
	<li>Macchia le celle con fluorocromo-coniugate di anticorpi monoclonali contro umano CD44 (PerCP-Cy 5.5) e CD24 (PE) come descritto al punto 1.12. Nel frattempo, preparare i controlli di isotipo come descritto al punto 1.13.</li>
	<li>Eseguire le cellule su un citometro a flusso e rilevare la percentuale di cellule con CD44+/CD24– marcatori.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Questo protocollo descrive un modo diretto e chiaro per rilevare il passaggio di cellule staminali non cancro al seno in seno CSC-come le cellule come conseguenza di inversione di apoptosi. Conferma delle proprietà CSC di queste cellule invertite potrebbe essere assistito tramite in vitro mammosphere formazione dosaggio ed in vivo dello xenotrapianto trapianto in topi immunodeficienti18,24,26 ,<sup ...

Cancro è stato delle cause principali di morte, causando il pesante fardello di paesi in tutto il mondo1. Cancro al seno truppa alta sia in termini di incidenza e mortalità in pazienti femminili tra tutti i tipi di cancro1. A causa dell'eterogeneità di cancro, una combinazione di farmaci è solitamente utilizzata in chemioterapia per raggiungere cancro delle cellule morte2,3,4. Tuttavia, poiché le droghe chemioterapeutiche comuni spesso target DNA5,6, proteina sintesi7,8 e/o microtubule dynamics9, cellule in rapida crescita sono interessati più mentre cellule quiescenti come cancro cellule staminali (CSC) s sono solitamente meno colpiti10. CSC sono, pertanto, più probabilità di sopravvivere dopo il trattamento, che poi conduce a farmacoresistenza e cancro recidiva10,11. Quindi, eliminazione delle CSCs è diventata un tema importante per il trattamento del cancro e lo studio dell'origine delle CSCs è necessario.
Sono stati effettuati ulteriori studi sul fenomeno dell'inversione di apoptosi nella decade recente12,13,14,15,16,17,18 , 19. prima della nascita di questo concetto, è stato ampiamente accettato che le cellule irreversibilmente subirà apoptosi dopo l'attivazione delle caspasi. Caspasi sono una famiglia di enzimi proteine che giocano un ruolo chiave nelle fasi di iniziazione e l'esecuzione dell'apoptosi, tra cui la formazione del complesso apoptotico e la fenditura di substrati a valle20. L'attivazione delle caspasi boia come caspasi 3 o caspasi 7 è stato considerato come il "punto di non ritorno" per apoptosi21. Tuttavia, i ricercatori hanno recentemente osservato che l'apoptosi inversione si verifica sia in vitro e in vivo, , durante il quale le cellule possono recuperare dall'apoptosi anche dopo l'attivazione di caspasi12,13,14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19. Inoltre, caratteristiche aggressive come maggiore resistenza alla originale induttore apoptotico e maggiore invasività vengono rilevati nel cancro invertito cellule15. Quindi, è stato proposto che la percentuale di CSC-come le cellule sarebbe superiore alla popolazione invertita rispetto alle cellule non trattate, contribuendo alla fine alle funzionalità più maligna dopo apoptosi inversione18.
In precedenza, molti sforzi sono stato apportati traccia l'inversione di apoptosi in vitro e ancora più importante, in vivo, che notevolmente aiutare a confermare l'universalità di questo processo16,17,19. Tuttavia, uno studio sistematico sulle conseguenze delle cellule invertite è carente a causa dell'isolamento insoddisfacente delle cellule che hanno effettivamente subito inversione di apoptosi. C'è la necessità di acquisire le cellule apoptotiche puro e recuperarli per ulteriore studio. Così, usiamo il marcatore tradizionalmente ben accettato di attivazione delle caspasi boia come l'indicatore del "punto di non ritorno"21 per apoptosi e utilizzare fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) per discriminare caspase-attivata cellule colorate con la tintura di Caspase-3/7 verde rilevazione. La tintura è covalentemente ad una sequenza di amminoacido breve, DEVD, che può essere riconosciuto e spaccati di caspases attivi 3/7. Il clivaggio aiuta a rilasciare il colorante, che sarà traslocano dal cytosol al nucleo dove si lega al DNA ed emette fluorescenza forte. Questa procedura evita di utilizzare una popolazione delle cellule di massa in cui alcune cellule possono non aver subito l'apoptosi.
CSC o cellule d'inizio del tumore sono state identificate in molti tumori solidi, utilizzando un singolo o una combinazione di diversi marker(s) superficiale e molto pochi numeri di queste cellule sono sufficienti a formare tumori in topi immunodeficienti22,23, 24,25,26,27. Una combinazione di CD44 e CD24 è stato comunemente utilizzata negli studi di seno CSC e CD44+/CD24– cellule sono state definite come il seno di CSCs26,27,28,29 , 30. recentemente, abbiamo effettuato una serie di esperimenti per confermare il rapporto proposto tra apoptosi inversione e CSCs e dimostrare che cellule di carcinoma mammario invertita acquisito capacità aumentata di formazione del tumore in vitro e in vivo con un elevata percentuale di cellule con CSC marcatori18. Anche se non potremmo escludere la possibilità che al seno CSCs sopravvivono meglio e così arricchirsi dopo inversione di apoptosi, cosa importante, quando isoliamo le cellule tumorali staminali non e soggetto a inversione di apoptosi, CSC emergerà nell'originariamente non-staminali popolazione delle cellule di cancro, suggerendo che non-staminali cancro cellule possono contribuire all'aumento della percentuale di CSCs durante l'inversione di apoptosi.
Questo articolo si propone di dimostrare la transizione da cellule staminali non cancro al seno alle cellule simil-CSC del seno dopo l'inversione di apoptosi e di rilevare questa transizione tramite flusso cytometry. Le cellule staminali non cancro al seno sono inizialmente preparate isolando CD44–/CD24+ cancro cellule di FACS al seno. Quindi, apoptosi sono indotta e confermata da cambiamenti morfologici sotto il microscopio. In seguito, le cellule apoptotiche positivamente etichettati da tintura verde rilevazione di Caspase 3/7 sono isolate da FACS e ulteriormente coltivate in assenza di induttori apoptotici per l'inversione di apoptosi. Le cellule invertite sono poi tinto con marcatori di CSC dopo 7 giorni di recupero per l'analisi cytometric di flusso. Cellule con CD44+/CD24 marcatori– ri-appaiono nella popolazione invertita, suggerendo che la transizione dalle cellule tumorali staminali non a CSC-come le cellule si è verificato durante l'apoptosi inversione.
Inversione di apoptosi è stata osservata nel cancro più linee cellulari come pure le cellule primarie normali trattati con stimoli apoptotici diversi in vitro12,13. Questo processo è stato rintracciato anche in Drosophila modello in vivo16,17,19. Molte informazioni per quanto riguarda il meccanismo di fondo di ricaduta del cancro nei modelli differenti del cancro malattia e l'origine delle CSCs possono essere ottenuti attraverso l'uso della tecnica come descritto in questo manoscritto.

<table><tbody><tr><td>MCF-7</td><td>Collezione di colture di tipo americano (ATCC)</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>Collezione di colture di tipo americano (ATCC)</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>T47D</td><td>Collezione di colture di tipo americano (ATCC)</td><td>HTB-133</td><td></td></tr><tr><td><forte>Reagente</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0,05% tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>0,25% tripsina-EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 680 annessina V coniugato</td><td>Invitrogen</td><td>A35109</td><td></td></tr><tr><td>siero bovino albumina</td><td>USB</td><td>9048-46-8</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &middot; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C-5080</td><td></td></tr><tr><td>CellEvent caspasi-3/7 colorante fluorescente verde</td><td>Invitrogen</td><td>C10423</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsolfossido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Blocco Fc</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-059-901</td><td></td></tr><tr><td>siero fetale bovino</td><td>Invitrogen</td><td>16000044</td> HEPES <td>inattivato a caldo</td></tr><tr><td></td><td>USB</td><td>16926</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Invitrogen</td><td>25030081</td><td></td></tr><tr><td>Mitotracker Rosso CMXRos</td> Anticorpi monoclonali <td>Invitrogen</td><td>M7512</td><td></td></tr><tr><td>contro l'umano CD24</td><td>BD Biosciences</td><td>555428</td><td>PE Clone:ML5 Lotto:5049759 RRID:AB_395822</td></tr><tr><td>anticorpi monoclonali contro l'umano CD44</td><td>BD Biosciences</td><td>560531</td><td>PERCP-CY5.5 Clone:G44-26 Lotto:7230770 RRID:AB_1727485</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>paclitaxel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7402</td><td></td></tr><tr><td>PE Topo IgG2a, &kappa; Controllo dell'isotipo</td><td>BD Biosciences</td><td>554648</td><td>clone:G155-178 (RUO) RRID:AB_395491</td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 IgG2b di topo, &kappa; Controllo degli isotipi</td><td>BD Biosciences</td><td>558304</td><td>Clone:27-35 RRID:AB_647257</td></tr><tr><td>soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21600010</td><td></td></tr><tr><td>ioduro di propidio</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute 1640 medio</td><td>Invitrogen</td><td>11835055</td><td></td></tr><tr><td>azzarde di sodio</td> privo di rosso fenolo <td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>staurosporina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4400</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 mm piatto di coltura</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>piastre per coltura tissutale a 12 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150628</td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 40 &mu; m rete in nylon</td><td>BD Biosciences</td><td>08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>FACSuite software bundle v1.0</td><td>BD Biosciences</td><td>651360</td><td></td></tr><tr><td>FACSVerse</td><td>BD Biosciences</td><td>651155</td><td></td></tr><tr><td>FluoView FV1000 microscopio confocale</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td>60X obiettivo</td></tr><tr><td>FV10-ASW Software visualizzatore Ver.4.2b</td><td>Olympus-round-bottom</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>polystyrene 12 &volte; Tubi da 75 mm</td><td>BD Biosciences</td><td>352003</td><td></td></tr><tr><td>Selezionatrice S3e</td><td>Bio-Rad</td><td>1451006</td><td></td></tr></tbody></table>

flusso cytometric detection neonata al seno cancro cellule staminali-come delle cellule dopo l'inversione di apoptosi

Flow Cytometric Detection of Newly-formed Breast Cancer Stem Cell-like Cells After Apoptosis Reversal

Recidiva del tumore lungo è stato studiato dagli oncologi, mentre i meccanismi di fondo rimangono poco chiari. Recentemente, abbiamo e altri trovato che un fenomeno denominato apoptosi inversione porta ad aumento tumorigenicità in vari modelli di cellulari sotto diversi stimoli. Gli studi precedenti si sono concentrati sul monitoraggio di questo processo in vitro e in vivo; Tuttavia, l'isolamento di cellule vero invertite ha ancora da conseguire, che limita la nostra comprensione sulle conseguenze dell'inversione di apoptosi. Qui, approfittiamo di una tintura di Caspase-3/7 verde rilevazione alle cellule di etichetta con caspasi attivate dopo induzione apoptotica. Cellule con segnali positivi sono ulteriormente separate per fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) per il recupero. L'esame morfologico sotto microscopia confocale aiuta a verificare lo stato di apoptotic prima FACS. Un aumento di carcinogenicità spesso può essere attribuito all'elevazione della percentuale di cellule staminali tumorali (CSC)-come le cellule. Inoltre, data l'eterogeneità di cancro al seno, identificare l'origine di queste cellule di CSC-come sarebbe fondamentale per il trattamento del cancro. Così, prepariamo le cellule staminali non cancro al seno prima di innescare l'apoptosi, isolare cellule caspase-attivata ed eseguire la procedura di inversione di apoptosi. Analisi di citometria a flusso rivela che i CSC-come le cellule del seno ri-appaiono nel gruppo invertito, che indica i CSC-come le cellule del seno sono transitate da cellule staminali non cancro al seno durante l'inversione di apoptosi. Questo protocollo prevede in sintesi, l'isolamento delle cellule di cancro al seno apoptotica e rilevamento delle modifiche in percentuale di CSC in cellule invertite tramite flusso cytometry.

Al fine di osservare il passaggio dal seno non-staminali cellule di cancro al seno CSC-come le cellule, una prima cernita di CD44–/CD24+ cellule di cancro al seno sono stati necessari. Per la linea cellulare MCF-7, che ha circa 0,15% cellule con marcatori di CSC nella popolazione originale (Figura 1), questo passaggio ha aiutato esclude la possibilità di arricchimento di CSC durante l'inversione di apoptosi. Al contrario, se non ci fosse...

Qui, presentiamo un protocollo per isolare cellule di carcinoma mammario apoptotica ordinando di fluorescenza-attivato delle cellule e ulteriormente rilevare la transizione delle cellule staminali non cancro al seno al seno cancro cellule staminali-come le cellule dopo inversione di apoptosi mediante citometria a flusso.

Flusso Cytometric Detection neonata al seno cancro cellule staminali-come delle cellule dopo l'inversione di apoptosi

Cancer recurrence has long been studied by oncologists while the underlying mechanisms remain unclear. Recently, we and others found that a phenomenon ...

Gli isolamenti di popolazioni autentiche di cellule di inversione apoptotica sono stati un problema in precedenza, il che limita notevolmente la nostra comprensione delle conseguenze dell'inversione dell'apoptosi. Questo protocollo ci permette di generare popolazioni più pure di cellule di inversione apoptotica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che i materiali e le attrezzature utilizzati sono ampiamente disponibili in diverse istituzioni.Questa tecnica è facilmente applicabile per isolare una popolazione più pura di cellule che hanno subito l'inversione dell'apoptosi. Come riportato in precedenza, le cellule normali possono anche subire l'inversione dell'apoptosi, che oltre alle cellule tumorali del seno, possono essere avviate diverse cellule chemio, così come le cellule normali, e possono essere utilizzati i vari stimoli apoptotici. Poiché la cella di inversione ha attraversato l'apoptosi e lo smistamento rapido, il tasso di recupero è solitamente basso.Un numero di cella iniziale più grande è ricombinante per aumentare la resa finale. Per iniziare, impostazioni cultura MCF-7, MDA-MB-231, Per iniziare, impostazioni cultura MCF-7, MDA-MB-231 e celle T47D, secondo il protocollo di testo. Successivamente, lavare le celle con PBS due volte, quindi aggiungere due millilitri dello 0,05% di tripside-EDTA dello 0,05% di tripside-EDTA all'MCF-7, e celle MDA-MB-231, alle celle MCF-7, MDA-MB-231, e due millilitri dello 0,25% di tripside-EDTA e due millilitri dello 0,25% di tripsiderina-EDTA alle celle T47D.alle cellule T47D. Coltura delle cellule per cinque minuti a 37 gradi Celsius, in un incubatore di coltura cellulare al 5% di anidride carbonica. Mentre le cellule incubano, controllare il distacco delle cellule con un microscopio per prevenire la sovragestione mediante tripside-EDTA.Quando più del 90% delle celle si stacca, aggiungere cinque millilitri di mezzo RPMI completato al piatto e pipettarlo più volte sulla superficie dello strato cellulare. Quindi, trasferire le cellule in tubi conici da 15 millilitri e centrifuga. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo i pellet con tampone FACS in tubi di micro-centrifuga da 1,5 millilitri.Quindi, dividere le cellule in diversi tubi. Centrifuga i tubi ancora una volta e scarta il supernatante. Aggiungere quindi il blocco Fc diluito ai campioni.Incubare i campioni sul ghiaccio al buio per 20 minuti, prima di centrifugare nuovamente i campioni. Dopo questo, scartare il supernatante. Successivamente, aggiungere anticorpi monoclonali coniugati al fluorocromo contro cd44 umano, e CD24, contro CD44 umano, e CD24, in uno a 40, e da una a 10 diluizioni, rispettivamente, ai gruppi a doppia colorazione.Per i controlli positivi, aggiungere anticorpi CD44 Per i controlli positivi, aggiungere anticorpi CD44 alle cellule MDA-MB-231, alle cellule MDA-MB-231 e anticorpi CD24 alle cellule MCF-7 e anticorpi CD24 alle cellule MCF-7 in una o 40 e da una a 10 diluizioni, rispettivamente. Aggiungere PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b Kappa, Add PerCP-Cy5.5 Mouse IgG2b Kappa, diluito con un rapporto uno-40 alle cellule come controllo isotopico per gli anticorpi CD44. Quindi, aggiungere PE Mouse IgG2a Kappa, Quindi, aggiungere PE Mouse IgG2a Kappa, diluito con un rapporto uno a 10 alle cellule come controllo isotopico per gli anticorpi CD24.Incubare i campioni a quattro gradi Celsius al buio per 30 minuti. Quindi, centrifugare i campioni a 300 g Then, centrifugare i campioni a 300 g e quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e lavare il pellet due volte in 500 micro litri di PBS.Quindi, ripetere la centrifugazione come descritto in precedenza. Sospendere di nuovo il pellet su 0,5 millilitri di PBS e filtrare le sospensioni attraverso una rete di nylon da 40 micrometri. Quindi, eseguire la sospensione attraverso uno smistatore di celle attivato dalla fluorescenza.Raccogliere le celle con marcatori positivi CD44 negativi e CD24 in tubi a fondo tondo contenenti un millilitro di mezzo di raccolta. Quindi, centrifuga i tubi e scarta il supernatante. Successivamente, placcare le cellule tumorali non staminali del seno ordinate in un piatto di coltura contenente un mezzo di raccolta fresco per un'ulteriore coltura.In primo luogo, utilizzare una staurosporina millimolare in DMSO, Per preparare 2,5 micromolari staurosporina in mezzo, secondo il protocollo di testo. Quindi, rimuovere il supporto di coltura dalle celle. Lavare le cellule con due millilitri di PBS una volta, dopo questo, aggiungere 10 millilitri del mezzo di staurosporina alle cellule MSF-7 per sei ore, per indurre l'apoptosi, quando le cellule sono confluenti al 70%.Quindi, preparare un paclitaxel millimolare in DMSO. Quindi, aggiungere 12,5 micro litri Quindi, aggiungere 12,5 micro litri del paclitaxel millimolare 1 millimolare al mezzo completato delle cellule T47D per creare un volume finale di 10 millilitri in un tubo conico da 15 millilitri. Rimuovere il mezzo di coltura dalle cellule e lavare le cellule con 2 millilitri di PBS.Quindi, aggiungere il mezzo paclitaxel alle cellule per 10 ore per indurre l'apoptosi per 10 ore per indurre l'apoptosi quando le cellule raggiungono il 70% di confluenza. Successivamente, rimuovere il supporto dal gruppo MCF-7 trattato con solvente e lavarlo con due millilitri di PBS. Quindi, aggiungere 10 millilitri dello 0,25% di mezzo DMSO Quindi, aggiungere 10 millilitri dello 0,25% di mezzo DMSO per sei ore come controllo del solvente per la staurosporina.Rimuovere il mezzo di coltura dal gruppo T47D trattato con solvente e lavare le cellule con due millilitri di PBS. Quindi, aggiungere 10 millilitri dello 0,05% di mezzo DMSO Quindi, aggiungere 10 millilitri dello 0,05% di mezzo DMSO per 10 ore come controllo del solvente per il paclitaxel. Successivamente, macchiare la cellula e incubarli per 20 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al cinque%.Utilizzare un microscopio a scansione laser confocale 60 volte per osservare i cambiamenti morfologici delle cellule trattate. Macchiare sia l'induttore apoptotico che le cellule MCF-7 e T47D trattate con solvente e le cellule MCF-7 e T47D trattate con solvente al buio per 30 minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore di anidride carbonica al cinque%. Utilizzando lo smistatore di celle attivato dalla fluorescenza, raccogliere le cellule positive dai gruppi trattati dall'induttore in tubi inferiori rotondi contenenti un millilitro di mezzo di raccolta.Quindi, centrifuga i tubi come descritto in precedenza e scarta il supernatante. Raccogliere le cellule negative dai gruppi trattati con solvente in tubi a fondo tondo con un millilitro di mezzo di raccolta. Centrifugare i tubi e scartare il supernatante.Successivamente, sospendere di nuovo le celle ordinate in un nuovo supporto di raccolta. Seminare le cellule in piastre di coltura tissutale a 12 pozzi e culturerle per sette giorni per l'inversione dell'apoptosi. Raccogliere l'MCF-7 invertito sia in gruppi induttori che trattati con solvente con 0,05% di tripside-EDTA.con lo 0,05% di tripside-EDTA. Quindi, raccogliere le cellule T47D in entrambi gli induttori Quindi, raccogliere le cellule T47D in gruppi sia induttori che trattati con solvente con 0,25% di tripside-EDTA. Macchiare le cellule con anticorpi monoclonali coniugati al fluorocromo contro CD44 e CD24 umani.Durante la macchia delle celle, preparare i controlli isotipo come illustrato in precedenza. Infine, eseguire le celle su un citometro di flusso e rilevare la percentuale di celle con marcatori positivi CD44 e CD24 negativi. In questo protocollo è stata osservata la transizione dalle cellule tumorali non staminali al seno alle cellule simili al CSC mammario.L'isolamento delle cellule tumorali non staminali è stato effettuato per la prima volta nelle cellule MCF-7. I tipici cambiamenti morfologici sono stati osservati dopo l'aggiunta di induttori apoptotici e le cellule recuperate dall'apoptosi con morfologia simile dopo il ritiro del farmaco. Le cellule attivate dal caspace sono state etichettate e smistate in base alla loro intensità di fluorescenza più elevata rispetto alle cellule senza attivazione dello spazio.Durante il processo di induzione apoptotica, il solvente è stato utilizzato per escludere la possibilità che la procedura dei fatti, o il solvente stesso, fosse la causa della transizione. Le cellule attivate da Caspace nei gruppi di trattamento apoptotico-induttore sono state trovate come nexin cinque positive e PI negative, suggerendo che fossero cellule apoptotiche. Le cellule apoptotiche sono state raccolte e coltivate per il recupero, rispetto ai gruppi trattati con solventi, l'analisi citometrica del flusso ha mostrato che c'erano cellule che apparivano nel quadrante positivo CD44 e CD24 negativo nella popolazione invertita originariamente non stem di cellule tumorali.Il gaging è importante nell'analisi del flusso e nello smistamento delle celle, che nei laboratori dovrebbe essere preparato un controllo sufficiente. Poiché questa procedura di inversione dell'apoptosi in vitro isola le cellule tumorali apoptotiche pure, esperimenti come le risorse di tumorigenesi in vivo possono essere condotti per comprendere le conseguenze del reale inverso delle cellule. Questa tecnica fa luce sulla causa della ricaduta del cancro, quindi può essere studiata per prevenire potenzialmente il ri-verificarsi nei pazienti oncologici.Ricorda di proteggerti correttamente quando conduci esperimenti di coltura cellulare secondo le normative di livello biosafe del tuo istituto.

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