Name: Localizzazione del Locus Coeruleus nel cervello del topo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 44 s
Description: Impara a localizzare il locus coeruleus nel cervello del topo per studiare espressione proteica e omeostasi dei metalli. Questo metodo consente analisi accurate di disturbi neurologici.

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Ringraziamo Abigael Muchenditsi per la manutenzione della Colonia del mouse. Impiego della fonte del fotone avanzate all'Argonne National Laboratory è stata sostenuta da US Department of Energy, Office of Science, ufficio di energia scienze di base, sotto il numero di contratto: DE-AC02-06CH11357. Ringraziamo Olga Antipova e Dr. Stefan Vogt per supporto utente e assistenza presso la fonte del fotone avanzate. Questo lavoro è stato finanziato dalla 2R01GM101502 di grant del National Institute of Health a SL.

Gli studi degli animali è stato approvato dalla Johns Hopkins University Animal Care e uso (ACUC) protocollo numero M017M385.
1. cervello affettare
<ol><li>Per immobilizzare, anestetizzare topi mediante l'applicazione di 3% isoflurane.<ol>
<li>Immergere un batuffolo di cotone con le gocce di isoflurane e inserirlo in un tubo del microcentrifuge da 15 mL. Posizionare il naso dell'animale nel tubo e consentirle di inalare l'isoflurano. Controllare la profondità dell'anestesia la mancanza di risposta a punta-pizzico.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Metti l'animale sul dorso e immobilizzare e da appuntare le estremità verso il basso con un pin di T pur avendo accesso al suo addome.</li>
	<li>Tagliate l'animale con forbici chirurgiche facendo un elemento di cattura dalla pelle addominale e attraverso la pelle nella regione del torace. Fissare la pelle utilizzando perni T. Quindi rompere la membrana peritoneale fino al torace. Esporre il cuore di cracking della cavità toracica e il diaframma di taglio.</li>
	<li>Tagliare l'atrio destro per consentire al sangue di fluire fuori l'animale. Inserire una siringa da 10 mL con un ago di calibro 25 nel ventricolo sinistro e irrorare con 10 mL di tampone fosfato salino (PBS). Nota: In questo modo la soluzione di fluire attraverso la circolazione sistemica e uscita attraverso l'atrio di destra.</li>
	<li>Rimuovere la siringa da 10 mL e inserire un ago di calibro 25 fissato alla siringa di 60 mL. Irrorare attraverso il ventricolo sinistro con 50 mL di ghiaccio freddo 4% paraformaldeide (PFA).<ol>
<li>Preparare soluzione di ghiaccio fredda 4% PFA diluendo la soluzione PFA 10% in H2O e agghiacciante la soluzione finale di PFA 4% a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>La testa del mouse di isolare e rimuovere il cervello dal cranio.<ol>
<li>Tagliare la pelle dal collo e poi tagliare verso gli occhi per esporre il cranio. Rompere il cranio dal collo al naso e poi da un bulbo a altro. Sbucciare il cranio fuori e asportare l'intero cervello.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare il cervello nel 4% PFA per 24 h a 4 ° C.</li>
	<li>Trasferire il cervello con il forcipe in una provetta conica 50 mL riempita con 25 mL di soluzione di saccarosio al 30%. Tiene a 4 ° C per 48-72 ore fino a quando il cervello scende fino al fondo del tubo.</li>
	<li>Tagliare il cervello con un'affettatrice di cervello di topo adulto coronale di matrice attraverso il mesencefalo (~ 3 mm posteriore di bregma). Mantenere la sezione del cervello che contiene il tronco cerebrale. Nota: Questo si tradurrà in due sezioni del cervello – uno contenente la maggior parte della corteccia (anteriore del taglio) e uno contenente il tronco cerebrale/cervelletto (posteriore del taglio). Utilizzare la sezione del tronco cerebrale per le fasi successive.</li>
	<li>Incorporare la sezione del tronco cerebrale con la superficie di taglio posizionata sul fondo di uno stampo di incorporamento, circondato da temperatura di taglio ottimale composto (ottobre); spostare il cervello incorporato in un congelatore a-80 ° C e congelare per almeno 12 h – fino al successivo utilizzo.</li>
	<li>Taglio al criostato: posto l'incorporamento di stampo contenente il cervello in OCT nel criostato; viene quindi incubato nel criostato per diverse ore regolare la temperatura del blocco del cervello a quello del criostato.</li>
	<li>Togliere lo stampo incorporamento per esporre il blocco di OCT contenente il cervello.</li>
	<li>Utilizzare lame di rasoio per rimuovere eccesso di OCT dalla superficie del blocco senza toccare il cervello.</li>
	<li>Montare il blocco di OCT il mandrino del criostato, esponendo la superficie di taglio del cervello verso la parte anteriore.</li>
	<li>Regolare la superficie di taglio del cervello in modo che è orientata in parallelo con le lamette del criostato.</li>
	<li>Tagliare il cervello partendo dal midollo, taglio 100 µm sezioni rostralmente.</li>
	<li>Tagliare rostralmente fino a quando il cervelletto e tronco cerebrale tagliato come una fetta di continua. Iniziare la raccolta di fette di spessore di 50 µm. Nota: Come uno Trim rostralmente dal midollo, il tronco cerebrale e del cervelletto taglierà come due sezioni separate. Nelle sezioni rostrale, tronco cerebrale e del cervelletto si fonderanno alla fine a livello del ventricoloth 4. Una volta i bordi laterali del ventricoloth 4 sono ben formati, allora il cervelletto e tronco cerebrale uscirà come una fetta di continua.<ol>
<li>Raccogliere la fetta di cervello OCT-circondato con una pinza e posizionarlo in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti riempito con PBS (Figura 2a). Il LC sarà più prominente quando il cervelletto e il collicolo inferiore si incontra tra loro ~-5.52 mm posteriore di bregma (Figura 1b). Nota: La parte più anteriore della LC scomparirà una volta che il cervelletto è stato completamente sezionato e non circonda il colliculus inferiore alle ~-5.34 mm posteriore di bregma (Figura 1C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. esame immuno-istochimico per dopamina β-idrossilasi o tirosina idrossilasi (Figura 2)
<ol><li>1 ° giorno<ol>
<li>Lavare le fette selezionate tre volte per 5 min in PBS.</li>
		<li>Permeabilize per 24 h in soluzione salina tamponata con fosfato 0,5% con detersivo (Socialdemokrati) a 4 ° C.<ol>
<li>Diluire 125 µ l di detergente in 25 mL di PBS.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>2 ° giorno<ol>
<li>Lavare le fette tre volte per 5 min in 0,5% Socialdemokrati.</li>
		<li>Aggiungere l'anticorpo primario, anti-DBH o anti-TH per 18 h a una diluizione di 1: 500 a 0,5% Socialdemokrati a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>3 ° giorno<ol>
<li>Lavare le fette tre volte per 10 min in 0,5% Socialdemokrati.</li>
		<li>Aggiungere l'anticorpo secondario desiderato (488 asino anti-coniglio per fluorescenza verde) ad una diluizione di 1: 1000 in 0,5% Socialdemokrati per 16 h.</li>
		<li>Avvolgere la piastra ben 24 in alluminio e posto a 4 ° C.</li>
		<li>Lavare le fette tre volte per 5 min in 0,5% Socialdemokrati.</li>
		<li>Lavare per 5 min in PBS.</li>
		<li>Trasferimento fette con un pennello in un contenitore di acqua.</li>
		<li>Montare fette che galleggia in acqua su vetrini caricati.</li>
		<li>Vetrino coprioggetti sezioni con mezzi di montaggio torvo (senza DAPI).</li>
		<li>Asciugare le sezioni di cervello montato per 30 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Fettine di cervello di immagine al microscopio confocale o fluorescente con impostazioni per rilevare il segnale dalla lunghezza d'onda fluoroforo anticorpo secondario appropriato.</li>
		<li>Regolare il microscopio per il piano focale della fetta del cervello e prendere una singola immagine a 10 ingrandimenti.</li>
		<li>Per individuare una possibile area di LC la fetta di cervello, usi il ventricoloth 4 per l'orientamento; il cervelletto è situato sopra il ventricolo, pons e tronco cerebrale si trovano sotto i30.</li>
		<li>Per individuare il LC, concentrarsi sui bordi laterali del ventricoloth 4; il LC proviene dai bordi del 4th ventricolo e punti verso il pons / regione del tronco cerebrale (fig. 2b, 2C).</li>
		<li>A seguito di imaging e localizzazione della LC in alcune fette di cervello, memorizzare diapositive contenenti fette di cervello a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. rilevazione della LC nelle fette del cervello
<ol><li>Per individuare la sezione del cervello che contiene il LC, affettare il cervello di topo, come descritto in precedenza e raccogliere le sezioni in PBS riempito 24 piatti ben, come mostrato nella Figura 2a.<ol>
<li>Inserire una sezione del cervello per pozzetto per consentire la corretta localizzazione del LC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Raccogliere un totale di 48 fette di cervello che sarà immunostained al cervello. Nota: Tutti i pozzetti dei due piatti mostrati nella Figura 2a contengono fettine di cervello da un animale.</li>
	<li>Immunostain ogni fetta di terzo e il quinto per DBH, o th Preferibilmente, eseguire esame immuno-istochimico di quelli fette di cervello che sono adiacenti a quelle che sono dosati ulteriore (tramite microscopia di fluorescenza di raggi x, XFM). Nota: Questa procedura consente per la localizzazione esatta della LC nelle fette finale del dosaggio (Figura 2a; etichettati con numeri tra i pozzetti).</li>
	<li>Regolare il numero di fette del cervello che sono immunostained a seconda dell'applicazione, ad esempio, se richiedono la posizione esatta del centro e del bordo di LC, o solo un'approssimazione.</li>
	<li>A seguito di esame immuno-istochimico, rilevare fettine di cervello contenente LC tramite un caratteristico pattern di espressione su entrambi i lati del ventricoloth 4 (Figura 2b, 2C). Ingrandimento del segnale DBH a cristalli liquidi di fettine di cervello consecutivi è mostrato in figura 2d, 2e; l'immagine ingrandita della LC che è macchiata per TH è indicata nella Figura 2f.
</li>
	<li>Utilizzare le sezioni adiacenti a quelli contenenti LC per ulteriori studi - in questo caso per XFM per quantificare i livelli del metallo (Figura 3).</li>
	<li>Per eseguire XFM, raccogliere fette sottili del cervello coronale di 10-30 µm (a seconda della configurazione) il film polimerico sottile con cui possono essere montati su supporti del campione e imaging presso il sincrotrone.</li>
	<li>Fettine di cervello di negozio che sono preparati in thin film polimerico per XFM a temperatura ambiente ed eseguire XFM.</li>
</ol>4. metallo Imaging a cristalli liquidi via XFM
<ol><li>Fetta di cervello di topo di esempio come descritto sopra, determinare LC e misurare i livelli di metallo tramite XFM da queste fette di cervello contenente la LC.</li>
	<li>Distribuzioni elementali, immagine su beamline 2-ID-E alla fonte di fotone avanzate (Argonne National Laboratory, IL Argonne).</li>
	<li>Registrare dati 'on the fly' come descritto in precedenza31.</li>
	<li>Determinare concentrazioni elementari nelle fette del cervello contenente la LC utilizzando il programma mappe32,33.</li>
</ol>

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Corretto orientamento del campione è un passo cruciale in questo protocollo. Perché stiamo usando caratteristiche anatomiche della superficie dorsale del cervello per individuare LC (confine tra cervelletto e collicolo inferiore), è importante che le sezioni vengano allineati correttamente. Questo richiede cura nella corretta impostazione del cervello nella matrice affettatrice del cervello del mouse. Si consiglia di tagliare ~ 500 μm più tessuto anteriore e posteriore a LC per evitare di perdere il nucleo. L'errore più ...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/58652/localization-of-the-locus-coeruleus-in-the-mouse-brain">Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain</a>.&#160; An author affiliation&#160;was updated.
The affiliation for Evan Maxey was updated from:
Department of Neuroscience, Johns Hopkins University
to:
X-ray science division, Advanced Photon Source, Argonne National Laboratory

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Erratum: Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

Locus coeruleus (LC) è una regione importante nel tronco cerebrale e un importante sito di produzione di noradrenalina (NE)1. Il LC Invia proiezioni in tutto il cervello2 la corteccia, l'ippocampo e il cervelletto3 e regola i principali processi fisiologici, tra cui ritmo circadiano4,5, attenzione e memoria6, sforzo7, processi cognitivi8e commozione9,10. Disfunzione di LC è stata implicata in patologie neurologiche e neuropsichiatriche11, compreso Parkinson malattia12,13,14, Alzheimer malattia14, depressione15 ,16,17, disturbo bipolare18,19e l'ansia20,21,22,23, 24. tenuto conto di questi ruoli, analisi di LC sono fondamentale per studiare la sua funzione e disfunzione.
Topi sono ampiamente utilizzati per lo studio di processi fisiologici e patofisiologici. A causa del loro di piccola dimensione, il mouse LC ha un diametro medio di ~ 300 μm, che porta a difficoltà a individuare la struttura. Durante il sezionamento del cervello, la LC può facilmente essere perso in sezioni coronali o sagittale. Disponibili studi che descrivono identificazione di LC in animali non offrono un protocollo passo-passo che un non-esperti possono seguire1,25. Così, per offrire una guida per la localizzazione di LC, descriviamo un protocollo che abbiamo sviluppato per individuare questa regione nel cervello del topo per diverse applicazioni (Figura 1, Figura 2, Figura 3). Il protocollo si applica attentamente controllato cervello rilevamento di sezionamento e immunohistochemical di DBH26,27, o in alternativa TH24, entrambi gli enzimi altamente arricchiti nell' LC28. LC è individuato da immunohistochemistry, fettine di cervello adiacente possono essere utilizzati per ulteriori studi, compreso analisi morfologiche e metaboliche, come pure gli studi di formazione immagine del metallo tramite fluorescenza a raggi x microscopia (XFM)29. Descriviamo XFM come esempio in questo protocollo (Figura 3).

<table><tbody><tr><td>Matrice per affettare il cervello di topo adulto</td><td>Zivic Instruments</td><td>BSMAS001-1</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-coniglio, Alexa Fluor 488 (fonte - asino)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini caricati</td><td>Genesee</td><td>29-107</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Microm GmbH</td><td>HM 505E</td><td></td></tr><tr><td>Lame da taglio per criostato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>MX35</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Mini, 9,5 cm</td><td>Antech Diagnostiche</td><td>503241</td><td></td></tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindole)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>dopamina &beta;-idrossilasi (DBH) anticorpo - produzione interna (fonte - coniglio)</td><td>B. Eipper</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo dopamina &beta;-idrossilasi (DBH) - disponibile in commercio (fonte - coniglio)</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>8586</td><td></td></tr><tr><td>tubi Falcon, 50ml</td><td>USA Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Forane (isofluorano)</td><td>Baxter</td><td>NDC 1019-360-60</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Micro Adson</td><td>Antech Diagnostcs</td><td>501245</td><td></td></tr><tr><td>Hardset mounting media</td> EM <td>sciences</td><td>17984-24</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Pascal</td><td>LSM 5</td><td></td></tr><tr><td>piastre multipozzetto, 24 pozzetti</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>930186</td><td></td></tr><tr><td>Composto per la temperatura di taglio ottimale (OCT)</td><td>VWR/ tissue tech</td><td>102094-106</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide (PFA)/ formalina 10%</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF98-4</td><td></td></tr><tr><td>Stampi per inclusione monouso Peel-A-Way</td><td>Polysciences Inc. </td><td>18646A</td><td></td></tr><tr><td>Pennello</td><td></td><td></td><td></td>a matita</tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Life Tech</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Lamette da barba</td><td>Amazon</td><td>ASIN: B000CMFJZ2</td><td></td></tr><tr><td>Spatole</td><td>Antech Diagnostcs</td><td>14374</td><td></td></tr><tr><td>T pins</td><td>Office Depot</td><td>344615</td><td></td></tr><tr><td>Il cervello del topo in coordinate stereotassiche, Paxinos e Franklin, 3a edizione</td><td>Amazon</td><td>ISBN: 978-0123694607</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100 (per preparare PBSD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7949-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo tirosina idrossilasi (TH) (fonte - coniglio)</td><td>EMD Millipore</td><td>AB152</td><td></td></tr><tr><td>Ultralene film sottile per XRF</td><td>SPEX Sample Prep</td><td>3525</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente a campo largo</td><td>Zeiss</td><td>Axio Zoom.V16</td><td></td></tr></tbody></table>

localizzazione del locus coeruleus nel cervello del topo

Localization of the Locus Coeruleus in the Mouse Brain

Locus coeruleus (LC) è un importante hub di norepinefrina producendo neuroni che modulano un numero di funzioni fisiologiche. Le anomalie strutturali o funzionali di LC parecchie regioni del cervello, compreso la corteccia, ippocampo e nel cervelletto di impatto e possono contribuire alla depressione, disturbo bipolare, ansia, così come la malattia di Parkinson e Alzheimer. Questi disturbi sono spesso associati con metallo disparità, ma il ruolo dei metalli in LC è solo parzialmente capito. Studi morfologici e funzionali di LC sono necessari per comprendere meglio le patologie umane e contributo dei metalli. I topi sono un modello sperimentale ampiamente usato, ma il mouse LC è piccolo (~0.3 mm di diametro) e difficile da individuare per un non-esperto. Qui, descriviamo un protocollo basato su immunohistochemistry passo-passo per localizzare la LC nel cervello del topo. Dopamina-β-idrossilasi (DBH) e in alternativa, tirosina idrossilasi (TH), entrambi gli enzimi altamente espressi in LC, sono usati come indicatori immunohistochemical nelle fette del cervello. Sezioni adiacenti alle sezioni contenenti LC possono essere utilizzati per ulteriori analisi, tra cui l'istologia per studi morfologici, test metabolici, così come formazione immagine di metallo da microscopia di fluorescenza di raggi x (XFM).

Cambiamenti nell'omeostasi del metallo (ad esempio Cu, Fe, Zn e Mn) sono spesso osservati in disordini neurologici, compreso i cambiamenti nel LC34,35. Così, determinazione dei livelli del metallo nel cervello è necessario per la comprensione dei meccanismi di malattia. Le sezioni di cervello generate utilizzando il protocollo descritto possono essere utilizzate per quantificare i livelli di Cu e altri metalli a cristalli liquidi ...

Locus coeruleus è un piccolo gruppo di neuroni coinvolti in una varietà di processi fisiologici. Qui, descriviamo un protocollo per la preparazione di sezioni di cervello di topo per lo studio di proteine e metalli in questo nucleo.

Localizzazione del Locus Coeruleus nel cervello del topo

The locus coeruleus (LC) is a major hub of norepinephrine producing neurons that modulate a number of physiological functions. Structural or functional ...

La disfunzione del locus coeruleus è stata implicata in disturbi neurologici e neuropsichiatrici, tra cui il morbo di Parkinson, il morbo di Alzheimer, la depressione, il disturbo bipolare e l'ansia. Dati questi ruoli, l'analisi del locus coeruleus è fondamentale per studiarne la funzione e la disfunzione. Durante la sezione cerebrale del topo, il locus coeruleus può essere facilmente perso in sezioni coronali o sagittali a causa delle sue piccole dimensioni.Pertanto, per offrire una guida per la localizzazione del locus coeruleus, descriviamo un protocollo che abbiamo sviluppato per localizzare questa regione nel cervello del topo per diverse applicazioni. Iniziare posizionando il cervello appena isolato di un topo anestetizzato e poi perfuso nel 4%PFA in un tubo da 50 millilitri. Incubare il cervello per 24 ore a quattro gradi Celsius.Utilizzare le forcep per trasferire il cervello in un tubo conico da 50 millilitri riempito con 25 millilitri di soluzione di saccarosio al 30%. Incubarlo a quattro gradi Celsius per 48-72 ore fino a quando il cervello affonda sul fondo del tubo. Per incorporare la sezione del tronco encefalico, posizionare la sua superficie di taglio sul fondo di uno stampo di incorporamento e aggiungere un composto di temperatura di taglio ottimale per circondare il tronco encefalico.Congelare il cervello incorporato in un congelatore meno 80 gradi Celsius per almeno 12 ore fino a un ulteriore utilizzo. Posizionare lo stampo con il cervello nel criostato e incubarlo per diverse ore per regolare la sua temperatura a quella del criostato. Per esporre il blocco oct contenente il cervello, utilizzare una lama di rasoio per tagliare i quattro bordi dello stampo fino al fondo, quindi rimuovere lo stampo di incorporamento da esso.Utilizzare lamette da barba per rimuovere l'eccesso di OCT dalla superficie del blocco, assicurandosi di non toccare il cervello. Quindi montare il blocco OCT sul mandrino del criostato, esponendo la superficie tagliata del cervello verso la parte anteriore. Per regolare il cervello, orientare la superficie di taglio parallela alle lamette del criostato.Orientare correttamente il campione è un passo cruciale in questo protocollo. Poiché stiamo usando caratteristiche anatomiche della superficie dorsale del cervello per localizzare l'LC, come il confine tra cervelletto e collicolo inferiore, è importante che le sezioni siano allineate correttamente. Ciò richiede attenzione nell'impostare correttamente il cervello nella matrice dell'affettatrice cerebrale del mouse.Tagliare il cervello a partire dal midollo, tagliando le sezioni di 100 micrometri rostralmente. Una volta che il cervelletto e il tronco encefalico iniziano a tagliare come una fetta continua a livello del quarto ventricolo, inizia a raccogliere fette con uno spessore di 50 micrometri. Utilizzare le forcep per raccogliere ogni fetta cerebrale e posizionarla in un pozzo di una piastra di 24 po 'piena di PBS.Il locus coeruleus sarà più evidente in una fetta dove il cervelletto e il collicolo inferiore si incontrano a circa 5,52 millimetri posteriori di bregma. Il primo giorno, lavare le fette cerebrali nella piastra di 24 pozzi tre volte per cinque minuti ciascuna in PBS. Quindi aggiungere lo 0,5%PBS con detersivo e permeabilizzarli a quattro gradi Celsius per 24 ore.Il giorno seguente, lavare le fette tre volte per cinque minuti ciascuna con 0,5%PBSD. Quindi aggiungere l'anticorpo primario a una diluizione da uno a 500 nello 0,5% di PBSD e incubare a quattro gradi Celsius per 18 ore. Il terzo giorno, lavare le fette tre volte per 10 minuti ciascuna con 0,5%PBSD, quindi aggiungere l'anticorpo secondario con una diluizione da uno a 1000 nello 0,5%PBSD.Avvolgere la piastra con un foglio di alluminio e incubare a quattro gradi Celsius per 16 ore. Dopo l'incubazione, lavare le fette tre volte per cinque minuti ciascuna con 0,5%PBSD, quindi per cinque minuti in PBS. Coprire le sezioni utilizzando un supporto di montaggio rigido senza DAPI.Coprire con una copertura in vetro e asciugare per 30 minuti a temperatura ambiente. Quindi utilizzare un microscopio confocale con impostazioni per rilevare il segnale dalla lunghezza d'onda di fluorescenza appropriata alle fette cerebrali dell'immagine. Dopo aver regolato il microscopio sul piano focale della fetta cerebrale, utilizzare 10 volte l'ingrandimento per scattare una singola immagine.Utilizzare il quarto ventricolo situato sotto il cervelletto e sopra pons e tronco encefalico per localizzare una possibile regione LC nella fetta cerebrale. Focus sui bordi laterali del quarto ventricolo e l'LC si posizionerà partendo dai bordi del quarto ventricolo e puntando verso la regione del tronco encefalico del pons. La distribuzione intracellulare della dopamina beta-idrossilasi, una proteina espressa nella LC, è stata valutata utilizzando questo protocollo al fine di studiare la morfologia LC e la densità neuronale.Un'altra proteina espressa nella LC, l'idrossilasi tirosina, ha anche mostrato un forte segnale fluorescente verde nelle fette cerebrali contenenti l'LC.I cambiamenti nell'omeostasi metallica sono spesso osservati nei disturbi neurologici, compresi i cambiamenti nel LC.In questo esempio, quando una fetta cerebrale tagliata attraverso l'LC è stata misurata per fosfato, potassio, zinco e rame, solo il rame ha mostrato un aumento specifico del segnale. Si consiglia di tagliare circa 500 micron in più di tessuto anteriore e posteriore a LC per evitare di perdere il nucleo e tagliare più sezioni del necessario, soprattutto se si esegue per la prima volta questo protocollo. Un attento studio delle immagini dell'atlante cerebrale prima della colorazione è molto utile.Una volta che l'LC si trova per immunoistochimica, le fette cerebrali adiacenti possono essere utilizzate per ulteriori studi, tra cui l'analisi morfologica e metabolica, così come studi di imaging metallico tramite microscopia a fluorescenza a raggi X. Le sezioni cerebrali generate utilizzando il protocollo descritto possono essere utilizzate per quantificare i livelli di rame e altri metalli nella LC e confrontarli con i livelli nelle regioni al di fuori della LC, che è necessario per la comprensione del meccanismo della malattia. Ulteriori possibili applicazioni di questo protocollo includono il rilevamento dell'abbondanza e della distribuzione intracellulare della dopamina beta-idrossilasi, tirosina idrossilasi, e altre proteine espresse nella LC individualmente, o nei test di co-colorazione, studi sulla morfologia LC e sulla densità neuronale.

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Abbiamo descritto un protocollo per la perfusione transcardiac di topi, rimozione e sezionamento del cervello, così come colorazione immunoperossidasi, incorporando resina, ultrasottili e sezionamento delle sezioni cervello. Al termine di queste procedure, il materiale immunostained è pronto per l'esame con microscopia elettronica a trasmissione.

Preparazione del tessuto cerebrale del mouse per la microscopia Immunoelectron

Fonte: Xavier, A. L. R., et al. Impianto di cannule nella Cisterna Magna dei Roditori. J. Vis. Exp. (2018)Questo video mostra la procedura per l'impianto di una cannula nella cisterna magna di un topo anestetizzato. La tecnica consiste nel guidare una cannula montata su ago attraverso la dura madre nella cisterna magna triangolare invertita e fissarla per una somministrazione mirata nel liquido cerebrospinale.

Impianto di cannula nella Cisterna Magna in un modello murino

Questo video dimostra la registrazione in vivo del potenziale di campo locale (LFP) da aree M2 bilaterali del cervello del topo. Un topo anestetizzato viene fissato e preparato per la procedura. Per registrare gli LFP, inserire i microelettrodi nelle coordinate target delle aree M2 bilaterali, che sono responsabili di movimenti motori complessi.

Registrazione del potenziale di campo locale da entrambi gli emisferi del cervello del topo

Questo protocollo delinea l'uso dell'immunoistochimica per identificare le regioni del locus coeruleus nelle sezioni del cervello del topo. Prendendo di mira la dopamina β-idrossilasi con anticorpi marcati con fluoroforo verde, i neuroni produttori di noradrenalina vengono visualizzati al microscopio come fluorescenza verde.

Immunoistochimica per l'identificazione della regione del locus coeruleus nelle sezioni cerebrali di topo

Questo video dimostra la colorazione immunoistochimica delle fibre colinergiche nel nucleo basale della regione di Meynert delle sezioni cerebrali di topo. Le sezioni vengono bloccate e trattate con anticorpi primari contro la colina acetiltransferasi, seguiti da anticorpi secondari biotinilati. Vengono aggiunti complessi avidina-biotina-perossidasi, che si legano agli anticorpi secondari, seguiti dal substrato cromogenico. Le sezioni vengono quindi disidratate e montate prima di essere...

Colorazione immunoistochimica delle fibre nervose nel nucleo basale di Meyner del cervello di topo

Qui descriviamo una procedura per tessuto di compensazione, l'etichettatura fluorescente e su larga scala di formazione immagine del tessuto di cervello di topo che, quindi, permette la visualizzazione dell'organizzazione tridimensionale dei tipi delle cellule nella neocorteccia.

Formazione immagine tridimensionale su larga scala di organizzazione cellulare nella neocorteccia Mouse

Presentiamo la registrazione elettrofisiologica in vivo del potenziale di campo locale (LFP) nella corteccia motoria secondaria bilaterale (M2) dei topi, che può essere applicata per valutare la lateralizzazione dell'emisfero. Lo studio ha rivelato livelli alterati di sincronizzazione tra l'M2 sinistro e destro nei topi APP/PS1 rispetto ai controlli WT.

Valutazione della lateralizzazione dell'emisfero con la registrazione del potenziale sul campo locale bilaterale nella corteccia motoria secondaria dei topi

Per verificare se gli effetti trigeminisuli sulle prestazioni cognitive comportano l'attività del locus coeruleus, vengono presentati due protocolli che mirano a valutare le possibili correlazioni tra le prestazioni e i cambiamenti delle dimensioni delle pupille relative ai compiti indotti dalla masticazione. Questi protocolli possono essere applicati a condizioni in cui si sospetta il contributo di locus coeruleus.

Valutazione dei cambiamenti legati agli pupili in Arousal mediato da Locus Coeruleus, suscitato dalla stimolazione trigeminale

Con la manipolazione optogenetica di specifiche popolazioni neuronali o regioni cerebrali, il comportamento può essere modificato con alta risoluzione temporale e spaziale in animali in movimento libero. Utilizzando diversi strumenti optogenetici in combinazione con fibre ottiche cronicamente impiantate, è possibile eseguire una varietà di modulazioni neuronali e test comportamentali.

Manipolazione optogenetica dell'attività neuronale per modulare il comportamento nei topi in movimento libero

La chirurgia stereotassica per colpire i siti cerebrali nei topi comporta comunemente l'accesso attraverso le ossa del cranio ed è guidata da punti di riferimento del cranio. Qui delineiamo un approccio stereotassico alternativo per colpire il tronco cerebrale caudale e il midollo spinale cervicale superiore attraverso la cisterna magna che si basa sulla visualizzazione diretta dei punti di riferimento del tronco cerebrale.

Approccio chirurgico stereotassico per microiniettare il tronco encefalico caudale e il midollo spinale cervicale superiore tramite la Cisterna Magna nei topi

Questo protocollo descrive in dettaglio la procedura per l'imaging delle risposte del calcio nel collicolo superiore (SC) dei topi svegli, compreso l'imaging dell'attività di un singolo neurone con microscopia a due fotoni, lasciando intatta la corteccia nei topi wild-type, e l'imaging dell'intero SC con microscopia ad ampio campo nei topi mutanti a corteccia parziale.

Imaging del calcio nel collicolo superiore del topo

Impara a localizzare il locus coeruleus nel cervello del topo per studiare espressione proteica e omeostasi dei metalli. Questo metodo consente analisi accurate di disturbi neurologici.

Localizzazione del Locus Coeruleus nel cervello del topo

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