Name: Fabbricazione di scaffold decellularizzati matrice della cartilagine-derivato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Scopri come creare scaffold decellularizzati da cartilagine nativa per la rigenerazione osteocondrale. Questo metodo preserva la matrice extracellulare e supporta la formazione di cartilagine in vitro e in vivo.

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Gli autori desidera ringraziare W. Boot per assistenza nella produzione di impalcature. K.E.M. curvatubi è supportato dall'Alexandre Suerman Stipendium da University Medical Center. R. Levato e J. Malda sono supportati dalla olandese Arthritis Foundation (concedere accordi CO-14-1-001 e LLP-12, rispettivamente).

Per questo protocollo, cartilagine ginocchio equina è stata ottenuta da cavalli che erano morto da altre cause di osteoartrite. Tessuto è stato ottenuto con il permesso dei proprietari, in linea con i regolamenti etici istituzionali.
Nota: Questo protocollo descrive la fabbricazione di impalcature da decellularizzati cartilagine equina, che può essere utilizzato per applicazioni come le piattaforme di coltura di tessuti in vitro o in vivo l'impianto nelle strategie di medicina rigenerativa. La procedura di trattamento enzimatico deve essere eseguita nell'ordine cronologico descritto.
1. raccolta di cartilagine articolare da donatore (cadaverico) giunti
<ol><li>Avanti del passo raccolto, preparare 1 L di cartilagine soluzione di lavaggio, consistente in sterile tampone fosfato salino (PBS), completato con penicillina 100 U/mL, 100 µ g/mL di streptomicina e 1% (v/v) amfotericina b.</li>
	<li>Indossare un camice da laboratorio e guanti durante l'intera procedura di raccolta, poiché il donatore può trasportare gli agenti patogeni.</li>
	<li>Ottenere un giunto intatto (cadaverico) per l'isolamento di cartilagine. Nota: A questo punto, la pelle intorno all'articolazione è ancora intatta. Cartilagine equina soffocare ottenuta da cavallo è stata usata in questo protocollo, ma possono essere utilizzati anche altri giunti da altre specie.</li>
	<li>Togliere la pelle che si trova intorno alla zona comune di interesse usando un bisturi e una pinzetta chirurgica. Inoltre, è possibile rimuovere eccessivo tessuto grasso e muscolo, se necessario, senza danneggiare il giunto sottostante. Facoltativamente, è possibile trasferire il cadavere preparato a una cappa di sicurezza biologica.</li>
	<li>Per eseguire un'artrotomia, vale a dire, una separazione del giunto, innanzitutto definire la posizione in cui l'articolazione si articola mediante l'esecuzione di estensione e flessione dell'articolazione.</li>
	<li>Rimuovere con attenzione più strati di grasso, muscoli e tendini con un bisturi e pinzette chirurgiche per aprire la zona comune.</li>
	<li>Fare un'incisione per raggiungere la cavità articolare. Nota: La cavità articolare è riempita di liquido sinoviale, che può gocciolare dalla cavità quando si esegue un'incisione corretta.</li>
	<li>Continuare ad aprire completamente il giunto di taglio attraverso i tendini che tengono insieme l'articolazione.</li>
	<li>Ispezionare la cartilagine per eventuali danni macroscopici. Nota: Se la cartilagine articolare non ha un aspetto lucido e liscio o evidente formazione di vesciche, fessure o difetti sono presenti, eliminare la cartilagine.</li>
	<li>Utilizzare un bisturi sterile per rimuovere la cartilagine dall'osso subcondrale. Tagliare tutta la strada fino all'osso subcondrale anche rimuovere la zona profonda della cartilagine (Figura 1). Per impedire che la cartilagine seccarsi, regolarmente gocciolare cartilagine soluzione di lavaggio sulla cartilagine. Nota: In questo momento, non importa la dimensione delle fette della cartilagine.</li>
	<li>Raccogliere le fette di cartilagine in provette da 50 mL contenente precedentemente preparato della cartilagine (Figura 2A) di soluzione di lavaggio.</li>
	<li>Dopo aver raccolto la cartilagine da tutte le aree di interesse, snap congelare le fette di cartilagine in azoto liquido per 5 min.</li>
	<li>Trasferire le fettine di cartilagine in provette da 50 mL e lyophilize immediatamente le fette di cartilagine per 24 h in un congelamento essiccatore. Impostare il congelamento essiccatore a circa 0.090 mbar mentre il condensatore di ghiaccio è da-51 ° C (Figura 2B).</li>
	<li>Memorizzare le fette di cartilagine in un luogo asciutto a temperatura ambiente fino al successivo utilizzo. Nota: Fino al punto di formazione del patibolo, le soluzioni e la cartilagine non è necessario essere preparati e trattati in modo sterile.</li>
</ol>2. creazione di Decellularized particelle di cartilagine
<ol><li>Immergere le fette di cartilagine liofilizzato in azoto liquido.</li>
	<li>Macinare direttamente i campioni manualmente o mediante una fresatrice. Durante la molatura a mano le fette di cartilagine, utilizzare un mortaio e pestello e macinare le fette per circa 45 min fino a quando essi sono polverizzati (Figura 2 e 2D). Durante la molatura automaticamente, è possibile utilizzare una fresatrice alla sua velocità pre-impostati per pochi secondi fino a un minuto, fino a quando le fette di cartilagine snap-congelati sono polverizzate. Nota: Pre-raffreddare il mortaio o il macinacaffè della fresatrice con l'aggiunta di azoto liquido. Quando si utilizza una fresatrice, assicurarsi che tutte le particelle sono terra, e che le particelle non soggiorno nella parte inferiore del vano di macinazione.</li>
	<li>Passare al setaccio le particelle di cartilagine per sbarazzarsi di più grandi parti utilizzando un setaccio con maglie di dimensioni 0.71 mm.</li>
	<li>Memorizzare le particelle in un luogo asciutto a temperatura ambiente.</li>
</ol>3. enzimatica decellularizzati con tripsina 0.25%-EDTA
<ol><li>Preparare la soluzione di digestione, costituito da 0,25% tripsina con EDTA completato con penicillina 100 U/mL, 100 μg/mL di streptomicina e 1% (v/v) amfotericina B. Store la soluzione a 4 ° C. Nota: Trypin è una proteasi che degrada le proteine residenti nel tessuto della cartilagine. Questo passaggio enzimatico aprirà la struttura densa della cartilagine.</li>
	<li>Riempire le provette da 50 mL con le particelle di cartilagine polverizzato fino ad un volume di circa 7,5 mL per tubo.</li>
	<li>
Incubare le particelle di cartilagine con la soluzione preparata digestione a 37 ° C per 24 h in totale, durante l'aggiornamento la soluzione di digestione ogni 4 h.
	<ol>
<li>In primo luogo, aggiungere 30 mL di soluzione di digestione per ogni provetta da 50 mL contenente particelle di cartilagine.</li>
		<li>Quindi, risospendere le particelle utilizzando un vortice o una pipetta in modo che tutte le particelle sono esposti a soluzione enzimatica.</li>
		<li>Incubare i campioni per 4 h a 37 ° C su un rullo.</li>
		<li>Per aggiornare la soluzione di digestione, centrifugare le provette per 20 min a 3113 x g per provocare la sedimentazione delle particelle di cartilagine. Scartare il surnatante. Nota: Il surnatante diventerà più chiaro con ogni periodo di incubazione di tripsina.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 3.3.1–3.3.4 fino a quando le particelle sono state incubate con la soluzione di digestione per 6 cicli di 4 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo l'ultimo ciclo, rimuovere il supernatante dopo centrifugazione e lavare le particelle in 30 mL di soluzione di lavaggio due volte della cartilagine. Centrifugare le particelle per 20 min a 3113 x g tra ciascuno dei lavaggi.</li>
</ol>4. enzimatica decellularizzati con nucleasi trattamento
<ol><li>Preparare un 10 mM Tris-HCl soluzione a pH 7.5 in acqua deionizzata.</li>
	<li>Aggiungere 50 desossiribonucleasi U/mL e 1 ribonucleasi U/mL al buffer di Tris-HCl, per ottenere la soluzione di nucleasi. Nota: Questo passaggio viene eseguito per degradare specificamente desossiribonucleasi e ribonucleasi.</li>
	<li>Per rimuovere la cartilagine soluzione dalle particelle della cartilagine (punto 3.4) di lavaggio, centrifuga per 20 min a 3.113 x ge rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 30 mL di soluzione di nucleasi le particelle di cartilagine e mescolare le particelle attraverso la soluzione, assicurandosi che tutte le particelle sono esposti alla soluzione di nucleasi.</li>
	<li>Incubare i campioni su un rullo per 4 h a 37 ° C.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di nucleasi mediante centrifugazione le particelle di cartilagine per 20 min a 3.113 x g e scartare il surnatante.</li>
	<li>Lavare i campioni con l'aggiunta di 30 mL di 10 mM Tris-HCl soluzione senza la desossiribonucleasi e ribonucleasi alle particelle di cartilagine. Risospendere le particelle e lasciare i campioni su un rullo per 20 h a temperatura ambiente.</li>
</ol>5. detergente decellularizzazione
<ol><li>Rendere la soluzione detergente sciogliendo 1% (v/v) octoxynol-1 in PBS.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di Tris-HCl dalle particelle di cartilagine di centrifugazione per 20 min a 3.113 x g e scartare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 30 mL di soluzione detergente preparata 1% per le particelle di cartilagine. Risospendere le particelle di cartilagine delicatamente per evitare la formazione di schiuma della soluzione. Nota: Questo passaggio si rompe le membrane cellulari.</li>
	<li>Incubare i campioni su un rullo per 24 h a temperatura ambiente su un rullo.</li>
	<li>Rimuovere la soluzione detergente mediante centrifugazione per 20 min a 3.113 x g e scartare il surnatante.</li>
	<li>
Per rimuovere tutti i resti delle soluzioni decellularizzazione, lavare le particelle di cartilagine in 6 cicli di 8 h in 30 mL di soluzione di lavaggio della cartilagine. Eseguire lavaggio su un rullo a temperatura ambiente.
	<ol>
<li>Per modificare il lavaggio successivo, centrifugare la sospensione per 20 min a 3.113 x g, scartare il surnatante e aggiungere cartilagine fresca soluzione di lavaggio.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lasciare l'ultimo lavaggio nei tubi e memorizzare le particelle di cartilagine decellularizzati a-80 ° C.</li>
</ol>6. creazione di ponteggi dalle particelle decellularizzate
<ol><li>Se le particelle sono state conservate a-80 ° C, scongelare i tubi chiusi che contengono le particelle di cartilagine in acqua calda prima di creare i ponteggi.</li>
	<li>Trasferire le particelle di cartilagine con un piccolo mestolo in uno stampo cilindrico, ad esempio, un flaconcino di plastica con un diametro di 8 mm e un'altezza di 2 cm.</li>
	<li>Quando si posizionano le particelle di cartilagine nello stampo plastica, premere le bolle d'aria-fuori per evitare di cavità sul patibolo e riempire lo stampo fino al bordo. Nota: Sarà più difficile prendere i ponteggi fuori uno stampo di metallo dopo la formazione dell'impalcatura, che può portare a crepe nell'impalcatura.</li>
	<li>Congelare gli stampi con particelle di cartilagine per 10 min a-20 ° C.</li>
	<li>Lyophilize i ponteggi di cartilagine all'interno di loro stampi per 24 h in un congelamento essiccatore.</li>
	<li>Dopo liofilizzazione, prendere l'impalcatura fuori dallo stampo (Figura 3) e loro legame incrociato con ultravioletto (UV) luce a distanza di 30 cm e 365 nm durante la notte.</li>
	<li>Per poter utilizzare i ponteggi per la coltura cellulare in vitro o in vivo dell'impianto, sterilizzare le impalcature con, ad esempio, di etilene ossido (EtO). Nota: La Sterilizzazione EtO è eseguita da una parte esterna.</li>
</ol>7. caratterizzazione delle impalcature decellularizzate con colorazioni istologiche
Nota: Per garantire la completa decellularizzazione e di visualizzare il carattere naturale rimanente della cartilagine, eseguire stainings istologici diversi prima di utilizzare i ponteggi in qualsiasi esperimento, compresi ematossilina ed eosina (H & E) colorazione per garantire decellularizzazione, Safranina-O macchiatura per visualizzare presenza residua di GAG, collagene di tipo I immunohistochemistry per distinguere tra il contenuto di collagene e collagene tipo II immunohistochemistry per distinguere tra il contenuto di collagene.
<ol><li>Tagliare i ponteggi a fettine di circa 3 mm con un bisturi. Nota: Se i ponteggi sono tagliati in dimensioni più grandi o più piccole, le durate dei cicli di disidratazione devono essere adattati.</li>
	<li>Incorporare i ponteggi in un calo del 4% (p/v) alginato e indurre il cross-linking aggiungendo un simile volume di formalina tamponata non 3,7% che contiene 20 mM CaCl2. Nota: Incorporamento di alginato rende le fette di impalcature e più rigido rispetto alla procedura di lavaggio prima dell'inclusione in paraffina. Nel caso che i ponteggi sono cellula-seminato o in vivo impiantato, alginato incorporamento non è necessario, come la composizione di impalcature sarà abbastanza resistente a causa di incorporazione di ECM da parte delle cellule.</li>
	<li>Disidratare i campioni da inserendoli in una serie di etanolo graduato, a partire con un'ora cicli del 70%, 96%, etanolo 96%, 100% e 100%, seguiti da due cicli di 1h di xilene e termina con due cicli di 1h di paraffina a 60 ° C.</li>
	<li>Dopo la disidratazione, paraffina-incorporare i campioni in uno stampo e raffreddare i campioni.</li>
	<li>Tagliare i campioni con un microtomo a fette spesse di 5 μm.</li>
	<li>Prima della colorazione, reidratare i campioni ponendoli in una serie di etanolo graduato restituito. Iniziare con due lavaggi di xilene per 5 min, seguita da 2 lavaggi di etanolo 100%, 95% e 70% per 3 min a lavaggio. Infine, lavare i campioni 3 volte in acqua per 2 min. Nota: In caso di utilizzo di alginato per processare i campioni per inclusione a paraffina, assicuratevi di lavare via l'alginato con acido citrico 10 mM prima della reidratazione delle sezioni di paraffina.</li>
	<li>Macchiare i campioni con ematossilina ed eosina, Safranina-O, collagene I ed il collagene II come precedente descritto11.</li>
</ol>8. caratterizzazione delle impalcature decellularizzate con analisi Quantitative
<ol><li>Ottenere il digest di papaina delle impalcature come descritto in precedenza11.</li>
	<li>Eseguire un test con un kit di quantificazione del DNA fluorescenza-basata per misurare il contenuto di DNA double-strand di impalcature per garantire completa decellularizzati. Seguire il protocollo fornito dal produttore. Esprimere la quantità di DNA per peso a secco dell'impalcatura.</li>
	<li>Eseguire un'analisi di metilmetilene blu per quantificare il resto delle gag all'interno il patibolo, come descritto in precedenza11. Esprimere la quantità in GAG al DNA.</li>
</ol>9. semina la chiodatura decellularizzati
<ol><li>Tagliare scaffold sterilizzati dal passaggio 6.7 in 3mm fette spesse.</li>
	<li>Trasferire le impalcature in pozzetti separati di una piastra a 6 pozzetti.</li>
	<li>Reidratare impalcature con mezzo di coltura cellulare di pipettaggio 1 mL di terreno in cima al patibolo e lasciare in ammollo per 30 min. utilizzare chondrocyte o medio di espansione delle cellule staminali mesenchimali (MSC). Nota: Utilizzare lo stesso mezzo per reidratazione dell'impalcatura per quanto riguarda la coltura delle cellule delle cellule che verrà effettuato il seeding. Medio di espansione di condrociti è costituito da supporti di Dulbecco modificati (DMEM) con 10% inattivati siero bovino fetale (FBS), 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina e 10 ng/mL del fibroblasto (FGF-2) fattore di crescita-2. Medio di espansione di MSC è costituito da minimo essenziale medio alfa (a-MEM) con 10% calore-inattivati FBS, 0,2 mM 2-fosfato dell'acido L-ascorbico, 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina e 10 ng/mL FGF-2.</li>
	<li>Preparare 3 x 106 cellule in 100 μL di mezzo, che è il volume richiesto per ogni ponteggio con un diametro di 8 mm e un'altezza di 3 mm. Nota: Più tipi di cellule appartenenti a specie diverse possono essere utilizzati per la semina. Quando si utilizza condrociti o cellule stromali mesenchimali, isolare le celle come descritto in precedenza11. Quando si utilizza condrociti, assicurarsi che essi sono stati espansi non passato il passaggio P1 al fine di ridurre al minimo il numero dei chondrocytes dedifferentiated. Quando si utilizza cellule stromali mesenchimali, essi devono essere testati sulla loro capacità per differenziazione multi-lignaggio, come descritto in precedenza14.</li>
	<li>Pipettare 50 μL di sospensione cellulare in cima al patibolo pre-impregnato di preparato e incubare il patibolo per 1h a 37 ° C.</li>
	<li>Attentamente girare il patibolo testa in giù, dispensare il restante 50 µ l di sospensione cellulare su questo lato dell'impalcatura e incubare per 1h a 37 ° C.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, aggiungere 3 mL di mezzo di pozzetti e cultura i ponteggi cella-seminato a 37 ° C. Gestire la piastra di coltura con delicatezza per evitare il distacco delle cellule.</li>
	<li>I ponteggi della cultura per il periodo di tempo necessario per l'esperimento e cambiare il mezzo di 2 – 3 volte a settimana. Pipettare lentamente e quanto lontano dal patibolo come possibile.</li>
	<li>Dopo la coltura dell'impalcatura delle cellule seminate, tagliare i ponteggi a metà ed elaborarli per istologia e analisi biochimiche.</li>
</ol>

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<li>Malda, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+depth-dependent+characteristics+of+equine+and+human+osteochondral+tissue+from+the+medial+and+lateral+femoral+condyles%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+and+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Comparative study of depth-dependent characteristics of equine and human osteochondral tissue from the medial and lateral femoral condyles.</a> Osteoarthritis and Cartilage. 20 (10), 1147-1151 (2012).</li>
<li>Londono, R., Badylak, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biologic+scaffolds+for+regenerative+medicine%3A+mechanisms+of+in+vivo+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+biomedical+engineering%22%5BJournal%5D)">Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling.</a> Annals of biomedical engineering. 43 (3), 577-592 (2015).</li>
<li>Gilbert, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+for+tissue+and+organ+decellularization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+cellular+biochemistry%22%5BJournal%5D)">Strategies for tissue and organ decellularization.</a> Journal of cellular biochemistry. 113 (7), 2217-2222 (2012).</li>
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Gli autori dichiarano di non avere nessun concorrenti interessi finanziari.

La ECM della cartilagine articolare è molto denso e abbastanza resistente a diversi trattamenti enzimatici. Il protocollo di decellularizzazione multi-passaggio descritto in questo articolo risolve tale resistenza e con successo genera matrici decellularizzate. Per raggiungere questo obiettivo, il processo si estende sopra parecchi giorni. Molti processi di decellularizzazione sono stati proposti per i diversi tipi di tessuti18, e in questo articolo viene descritto un protocollo adatto per decellu...

Difetti della cartilagine articolare del ginocchio causato da eventi traumatici possono portare a disagio e soprattutto possono avere un grande impatto sulla vita della popolazione giovane e attiva1,2,3. Inoltre, il danno della cartilagine in giovane età può condurre a una più rapida insorgenza dell'osteoartrite più tardi nella vita4. Attualmente, l'unica terapia di salvataggio per l'osteoartrite generalizzata del ginocchio è la chirurgia di sostituzione dell'articolazione. Come la cartilagine è un tessuto avascolare, aneurali e hypocellular, la sua capacità rigenerativa è severamente limitato. Di conseguenza, gli approcci di medicina rigenerativa sono ricercati per aiutare e stimolare la capacità rigenerativa del tessuto nativo. Per questo scopo, ponteggi sono progettati e utilizzati come sia un cella-elemento portante o come un materiale induttivo che inciti alla differenziazione e rigenerazione del tessuto da cellule native5 del corpo.
Scaffold decellularizzati ampiamente sono stati studiati nell'ambito della medicina rigenerativa6. Ha avuto un certo successo, ad esempio, nel favorire la rigenerazione della pelle7, strutture addominali8e tendini9. Il vantaggio dell'utilizzo di impalcature decellularizzate è loro origine naturale e la loro capacità di trattenere spunti bioattivi che sia ottenere e inducono la differenziazione delle cellule verso la linea appropriata necessaria per la riparazione del tessuto6,10. Inoltre, poiché la matrice extracellulare (ECM) è un biomateriale naturale e decellularizzati impedisce una potenziale risposta immunitaria rimuovendo contenuti cellulari o genetico, sono superare questioni riguardanti la biocompatibilità e biodegradabilità.
Matrice della cartilagine-derivato (CDM) impalcature hanno dimostrato grande condrogenica potenziale negli esperimenti in vitro quando seminati con cellule stromali mesenchimali11. Inoltre, queste impalcature hanno dimostrato il potenziale di tessuto osseo forma attraverso l'ossificazione endochondral sulle posizioni ectopici in impostazioni in vivo12. Come CDM ponteggi guidano la formazione di entrambi dell'osso e tessuto cartilagineo, queste impalcature possono detenere potenziali per riparazione di difetti osteocondrali oltre la riparazione della cartilagine.
Questo articolo viene descritto un protocollo adattato da Yang et al (2010)13 per la produzione di decellularizzazione impalcature CDM da equino soffocare la cartilagine. Queste impalcature sono ricche di collagene di tipo II e privo di cellule e non contengono alcun glicosaminoglicani (gag) dopo decellularizzati. Gli esperimenti sia in vitro che in vivo su riparazione di difetti condrali (osteo) possono essere condotta utilizzando queste impalcature.

<table><tbody><tr>Giunto <td></td><td></td><td>cadaverico</td><td>Questo può essere ottenuto come materiale residuo dal macellaio locale o dal centro veterinario.</td></tr><tr><td>Soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-streptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Amfotericina B</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>15290026</td><td></td></tr><tr><td>Azoto</td><td></td><td></td><td></td>liquido</tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rosso fenolo</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>25200072</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl pH 7,5</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Desossiribonucleasi I da pancreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Ribonucleasi A da pancreas bovino</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R6513</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100 (octoxynol-1)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3125</td><td></td></tr><tr><td>Citrato trisodico diidrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4641</td><td></td></tr><tr><td>Alginato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>180947</td><td></td></tr><tr><td>Formalina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Xilene</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraffina</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterilizzazione con ossido di etilene</td><td>Synergy Health, Venlo, Paesi Bassi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Le cellule stromali multipotenti/condrociti provenienti da donatori</td><td></td><td></td> equini <td>MSC e condrociti possono essere isolati dalle articolazioni del donatore che sono materiale di riposo, provenienti dal macellaio locale o dal centro veterinario.</td></tr><tr><td>MEM alfa</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>22561</td><td></td></tr><tr><td>Acido L-ascorbico 2-fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>41965</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina inattivata termicamente</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10735086001</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita dei fibroblasti-2 (FGF-2)</td><td>R & D Systems</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>Kit di quantificazione del DNA (Quant-iT PicoGreen dsDNA Reagent)</td><td>Thermo Fischer Scientific</td><td>P7581</td><td></td></tr><tr><td>1,9-Dimetil-Metilene Blu cloruro di zinco doppio sale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>341088</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizzatore</td><td>SALMENKIPP</td><td>ALPHA 1-2 LD plus</td><td></td></tr><tr><td>Mulino analitico</td><td>IKA</td><td>A 11 mortaio</td>/pestello basico <td></td></tr><tr><td></td><td>Haldenwanger 55/0A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra a rulli</td><td>CAT</td><td>RM5</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga (per provette da 50 mL)</td><td>Capsula Eppendorf</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>(stampo cilindrico)</td><td>TAAB</td><td>8 mm piatto</td><td></td></tr><tr><td>Superlite S UV</td><td>Lumatec</td><td>2001AV</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo incubatore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Setaccio (maglia 0,71 mm)</td><td>VWR</td><td>34111229</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Bisturi</td></tr><tr><td>Porta</td><td></td><td></td><td></td>bisturi</tr><tr><td>Mestolo</td><td></td><td></td><td></td> piccolo</tr></tbody></table>

fabbricazione di scaffold decellularizzati matrice della cartilagine-derivato

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Difetti osteocondrali non hanno sufficiente riparazione intrinseca capacità di rigenerare il tessuto dell'osso e della cartilagine funzionalmente suono. In questa misura, cartilagine ricerca si è concentrata sullo sviluppo di ponteggi rigenerative. Questo articolo viene descritto lo sviluppo di impalcature che completamente sono derivati dalla matrice extracellulare della cartilagine naturale, proveniente da un donatore equino. Potenziali applicazioni di impalcature includono la produzione di allotrapianti per la riparazione della cartilagine, che serve come impalcatura per osteochondral tissue engineering e fornendo modelli in vitro per studiare la formazione di tessuto. Di decellularizing il tessuto, le cellule del donatore vengono rimossi, ma molti dei suggerimenti di bioattivi naturali sono pensati per essere mantenuto. Il vantaggio principale dell'utilizzo di tali un'impalcatura naturale rispetto ad un'impalcatura prodotta sinteticamente è che nessun ulteriore funzionalizzazione di polimeri è necessaria alla rigenerazione tissutale osteocondrali di unità. I ponteggi di matrice della cartilagine-derivato possono essere utilizzati per la rigenerazione di tessuto dell'osso e della cartilagine nelle impostazioni sia in vivo che in vitro.

Decellularizzazione di CDM ponteggi dovrà sempre essere confermati utilizzando stainings istologici, nonché mediante la quantificazione del DNA per misurare la quantità di resti di DNA. Decellularizzazione insufficiente potrebbe portare a risposte immunologiche indesiderate che influenzano i risultati in vivo in impostazioni15,16,17. Per questo metodo di decellularizzazione specifici, DNA era sot...

Decellularizzati ponteggi cartilagine-derivato possono essere utilizzati come un'impalcatura per la riparazione della cartilagine di guida e come un mezzo per rigenerare il tessuto osteocondrali. Questo articolo descrive dettagliatamente il processo di decellularizzazione e fornisce suggerimenti per utilizzare queste impalcature nelle impostazioni in vitro.

Fabbricazione di scaffold decellularizzati matrice della cartilagine-derivato

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...

Questo metodo presenta un modo per creare impalcature derivate da tessuto nativo che possono essere utilizzate per la rigenerazione della cartilagine. Il principale vantaggio di questa tecnica è che i componenti della cartilagine nativa sono conservati nelle impalcature che possono promuovere la formazione e la rigenerazione della cartilagine in vitro e in vivo. Sebbene questo metodo utilizzi cartilagine da giunti soffocanti equini, può essere utilizzata anche cartilagine da qualsiasi altra articolazione.Per iniziare, ottenere un'articolazione cadaverica intatta per l'isolamento della cartilagine e rimuovere il grasso in eccesso della pelle e il tessuto muscolare come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Successivamente, definire la posizione in cui il giunto si articola eseguendo l'inflessione dell'estensione del giunto. Fare un'incisione orizzontale per raggiungere la cavità articolare.Successivamente, fare un'incisione verticale per aprire l'area del giunto. La cavità articolare è riempita con liquido sinoviale che probabilmente gocciola dalla cavità quando si esegue una corretta incisione. Continuare ad aprire completamente l'articolazione rimuovendo grasso eccessivo, muscoli e tendini e tagliando i tendini che tengono insieme l'articolazione.Ispezionare attentamente la cartilagine per eventuali danni macroscopici. Se la cartilagine articolare non ha un aspetto liscio più lucido o se sono presenti prove, vesciche, fenditure o difetti, scartare la cartilagine e ricominciare. Utilizzare un bisturi sterile per rimuovere la cartilagine dall'osso.Tagliare fino all'osso subcondrale per rimuovere la cartilagine della zona profonda. Raccogliere le fette di cartilagine rimosse in tubi da 50 millilitri contenenti soluzione di lavaggio della cartilagine precedentemente preparata. Durante la lavorazione, gocciolare regolarmente la soluzione di lavaggio della cartilagine sulla cartilagine per evitare che la cartilagine si asciughi.Dopo aver raccolto la cartilagine da tutte le aree di interesse, agganciare congelare le fette di cartilagine in azoto liquido per cinque minuti. Quindi trasferire le fette di cartilagine in tubi da 50 millilitri e posizionare immediatamente le fette congelate in un essiccatore. Liofilizzare le fette di cartilagine per 24 ore con l'essiccatore a congelamento.Al termine, conservare le fette di cartilagine liofilizzato in un luogo asciutto a temperatura ambiente. Per la lavorazione manuale, prerischire un mortaio e pestello con azoto liquido, quindi posizionare le fette di cartilagine liofilizzate nella malta e immergerle e azoto liquido. Macinare direttamente i campioni a mano per circa 45 minuti fino a quando non sono sufficientemente polverizzati.In alternativa, per macinare automaticamente i campioni utilizzando una fresatrice, iniziare preraffreddando il vano di rettifica della fresatrice aggiungendo azoto liquido. Quindi aggiungere le fette di cartilagine liofilizzate e fresare il campione alla sua velocità preimpostata per alcuni secondi fino a un minuto. Assicurarsi che tutte le particelle siano macinate e che nessuna particella rimanga nella parte inferiore del compartimento di rettifica.Infine, seguire la tecnica di decellularizzazione descritta nel protocollo di testo di accompagnamento prima di formare impalcature. Trasferire le particelle di cartilagine con una piccola etichetta su uno stampo cilindrico in plastica. Premere tutte le bolle d'aria per evitare cavità nell'impalcatura e riempire completamente lo stampo.Per evitare cavità nelle impalcature, assicurarsi che le bolle d'aria vengano premute durante il riempimento dello stampo con particelle di cartilagine. Dopo la formazione, congelare lo stampo per 10 minuti a meno 20 gradi Celsius. Quindi liofilizzare le impalcature della cartilagine all'interno dello stampo per 24 ore in un essiccatore di congelamento.Dopo la lofilizzazione, rimuovere con cura l'impalcatura dallo stampo. Posizionare l'impalcatura sotto una luce UV a lunghezza d'onda di 365 nanometri e collegarla durante la notte. Formare dischi di impalcature tagliando le impalcature sterilizzate in tre fette spesse millimetri.Quindi trasferire le impalcature in pozzi separatiS di una piastra a sei pozza. Aggiungere un millilitro di Chondrocyte Expansion Medium sopra le impalcature e consentire loro di reidratarsi per 30 minuti. Mentre le impalcature reidratano, preparare le celle e la pipetta 50 microliter della sospensione cellulare preparata sopra l'impalcatura pre imbevuta.Quindi incubare l'impalcatura per un'ora a 37 gradi Celsius. Quando si usano i condrociti, assicurarsi che non siano stati espansi oltre il primo passaggio al fine di ridurre al minimo il numero di cellule differenziate. Dopo un'ora, riportare la piastra sul cappuccio della coltura e capovolta con cura l'impalcatura.Pipettare i restanti 50 microlitri di sospensione cellulare sull'impalcatura e incubare per un'altra ora a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, aggiungere tre millilitri di mezzo ai pozzi con impalcature. Evitare di pipeggiare il mezzo direttamente sulle impalcature e maneggiare delicatamente la piastra di coltura per evitare il distacco delle cellule.Riportare la piastra all'incubatore e alla cella di coltura cedette impalcature a 37 gradi Celsius. Una combinazione di colorazione istorica e quantificazione del DNA sono stati utilizzati per dimostrare che i metodi presentati in questo articolo si traducono in una sufficiente decellularizzazione dell'impalcatura della cartilagine. Si è scoperto che le impalcature risultanti non contenevano cellule insieme a livelli non rilevabili di DNA.Mancano anche di glicosaminoglicani e sono ricchi di collagene II.Qui, la formazione di neomatrici si osserva sull'impalcatura ceduta con cellule staminali mesenchimali che sono state coltivate per quattro settimane. La formazione di glicosaminoglicani è abbondante dopo quattro settimane. Dopo aver tentato questa procedura, è importante esaminare se la decellularizzazione ha avuto esito positivo, prima di utilizzarla in qualsiasi applicazione.Seguendo questa procedura, è possibile eseguire ulteriori analisi biochimiche come l'analizzatore western blot al fine di rispondere a domande specifiche sulla presenza di altri componenti come i fattori di crescita. Questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale per esplorare strategie per la rigenerazione della cartilagine utilizzando tessuti decellularizzati da fonti allogeneiche e sineriche. Devono sempre essere prese precauzioni come indossare un camice da laboratorio e guanti.

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Bioingegneria

Questo video dimostra la procedura di fabbricazione di microcarrier derivati da matrice extracellulare mediante elettrospraying. Questi microvettori simulano il microambiente nativo tessuto-specifico e sono stabili in modelli di coltura cellulare 3D in vitro a lungo termine.

Fabbricazione di bioscaffold mediante elettrospraying: una tecnica per generare scaffold di microcarrier derivati da matrice extracellulare di tessuto decellularizzato

La riparazione della cartilagine rappresenta una sfida medica insoddisfatta e gli approcci basati sulle cellule per ingegnerizzare la cartilagine articolare umana sono una soluzione promettente. Qui, descriviamo gli idrogel biomimetici tridimensionali (3D) come uno strumento ideale per l'espansione e la maturazione dei condrociti articolari umani.

3D Hydrogel Ponteggi per articolare condrociti, Cultura e Cartilagine Generation

Condrogenesi da cellule staminali richiede la messa a punto delle condizioni di coltura. Qui vi presentiamo un approccio magnetico per condensare le cellule, un passo essenziale per iniziare condrogenesi. Inoltre, mostriamo che la maturazione dinamico in un bioreattore applica stimolazione meccanica ai costrutti cellulari e aumenta la produzione di matrice extracellulare cartilaginea.

3D Stem magnetica cellulare Aggregazione e bioreattore maturazione per la cartilagine Regeneration

La matrice extracellulare tessuto-specifico (ECM) è un mediatore chiave della funzione delle cellule. Questo articolo descrive metodi per sintetizzare schiume e microcarriers che sono stabili in coltura senza la necessità di reticolazione chimica per applicazioni in 3D avanzata in colture di cellule in vitro o come bioscaffolds pro-rigenerativi ECM-derivato puri.

Fabbricazione di Schiume matrice extracellulare-derivati ​​e microcarriers come tessuto-specifica delle cellule, Cultura e piattaforme di distribuzione

Qui vi presentiamo, e contrasto due protocolli utilizzati per decellularize tessuti vegetali: un approccio basato su detergente e un approccio privo di detersivo. Entrambi i metodi si lasciano alle spalle la matrice extracellulare dei tessuti vegetali utilizzati, che quindi può essere utilizzata come scaffold per applicazioni di ingegneria dei tessuti.

Due metodi per decellularizzazione di tessuti vegetali per applicazioni di ingegneria del tessuto

Questo protocollo descrive la produzione di filamenti di policaprolattone (PCL) con microsfere di acido (PLA) incorporato polilattico che contengono matrici decellularizzate (DM) per la stampa 3D del tessuto strutturale ingegneria costrutti.

Processo innovativo per la stampa 3D Decellularized matrici

L'obiettivo del presente protocollo è la produzione delle fibre di intera tabella extracellulare mirati per la riparazione della ferita che sono adatti per la valutazione preclinica come parte di un impianto di impalcatura rigenerativa. Queste fibre sono prodotte dalla cultura dei fibroblasti su membrane a fibra cava ed estratte dalla dissoluzione delle membrane.

Produzione di fibre di matrice extracellulare tramite fibra cava sacrificale membrana Cell Culture

Questo protocollo descrive l'assemblaggio di un'impalcatura a nano-matrice di base Janus (JBNm) strato per strato aggiungendo sequenzialmente nanotubi di base Janus (JBNts), matrilina-3 e fattore di crescita trasformante beta-1 (TGF-β1). Il JBNm è stato fabbricato e caratterizzato; Inoltre, ha mostrato un'eccellente bioattività, incoraggiando le funzioni cellulari come l'adesione, la proliferazione e la differenziazione.

Fabbricazione e caratterizzazione di nano-matrice di base Janus strato per strato per promuovere la rigenerazione della cartilagine

Questo articolo introduce un nuovo metodo per la sintesi di idrogel di matrice extracellulare di cartilagine decellularizzata (DC-ECM). Gli idrogel DC-ECM hanno un'eccellente biocompatibilità e forniscono un microambiente superiore per la crescita cellulare. Pertanto, possono essere scaffold cellulari ideali e sistemi di rilascio biologico.

Sintesi di idrogel di matrice extracellulare della cartilagine decellularizzata

La matrice decellularizzata della milza (DSM) ha applicazioni promettenti nel campo dell'ingegneria del tessuto epatico. Questo protocollo delinea la procedura per la preparazione del DSM di ratto, che include la raccolta della milza di ratto, la loro decellularizzazione attraverso la perfusione e la valutazione del DSM risultante per confermarne le caratteristiche.

Fabbricazione di matrice di milza decellularizzata derivata da ratti

Questo protocollo descrive la fabbricazione di costrutti ossei 3D utilizzando osteociti umani incorporati in idrogel di gelatina metacrilata (GelMA) integrati con matrice extracellulare decellularizzata. Il metodo è a basso costo, scalabile e compatibile con le apparecchiature di laboratorio di base, offrendo una piattaforma traslazionale per lo studio dei processi delle malattie muscoloscheletriche.

Una piattaforma di coltura ossea 3D che utilizza osteociti umani e matrice extracellulare decellularizzata per la modellazione delle malattie muscoloscheletriche

Scopri come creare scaffold decellularizzati da cartilagine nativa per la rigenerazione osteocondrale. Questo metodo preserva la matrice extracellulare e supporta la formazione di cartilagine in vitro e in vivo.

Fabbricazione di scaffold decellularizzati matrice della cartilagine-derivato

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