Name: Polmone microRNA Profiling attraverso il ciclo estrale in topi esposti a ozono (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 7 s
Description: Scopri il profilo dei microRNA polmonari nel ciclo estrale di topi esposti a ozono. Questo metodo valuta l'espressione dei microRNA che regolano i geni infiammatori nei polmoni.

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Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni dal NIH K01HL133520 (PS) e K12HD055882 (PS). Gli autori ringraziano il Dr. Joanna Floros per l'assistenza con gli esperimenti di esposizione di ozono.

Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) della Penn State University.
1. valutazione della fase del ciclo estrale
<ol><li>Frenare correttamente una femmina mouse C57BL/6 (8 – 9 settimane) utilizzando la tecnica di ritenuta del mouse con una sola mano descritta in Machholz et al.10.</li>
	<li>Riempire la pipetta di plastica sterile con 10 μL di acqua ultra-pura.</li>
	<li>Introdurre la punta della pipetta di plastica nella vagina.</li>
	<li>Sciacquare delicatamente il liquido 4 – 5 volte per raccogliere il campione.</li>
	<li>Posizionare il filo finale contenente fluido vaginale su un vetrino.</li>
	<li>Osservare il rossore vaginale non colorato sotto un microscopio chiaro con un obiettivo 20x. Nota: Animali che non presentano cicli regolari a causa di pseudogravidanza o altre cause devono essere escluse dall'esperimento. Si consiglia di eseguire le secrezioni vaginali quotidiane per almeno tre cicli consecutivi confermare la ciclicità.</li>
</ol>2. esposizione all'ozono
<ol><li>Inserire un massimo di 4 topi in due contenitori di vetro di 1,2 L con coperchi di maglia di filo e acqua ad libitum.</li>
	<li>Mettere un contenitore di vetro nel suo alloggiamento di ozono e l'altro nella camera di esposizione di aria filtrata.</li>
	<li>Regolare la concentrazione di ozono ai livelli di ozono 2 ppm e monitor regolarmente. Nota: L'apparato di ozono fornisce un flusso d'aria regolato (> 30 aria modifiche/h) con controllo temperatura (25 ° C) e umidità relativa (50%). Il sistema genera ozono di un ozonizzatore di scarica elettrica, che è monitorato e controllato da un analizzatore di ozono ultravioletta e controllori di flusso di massa, come descritto in precedenza11.</li>
	<li>Rimuovere i contenitori di vetro dopo 3 h di esposizione di aria ozono/filtrata. Restituire gli animali per gabbia con biancheria, cibo e acqua ad libitum.</li>
</ol>3. polmone raccolta
<ol><li>4 h dopo l'esposizione, anestetizzare gli animali con un'iniezione intraperitoneale di un chetamina/xilazina cocktail (90 mg/kg ketamina, xilazina 10 mg/kg). Nota: Per confermare un adeguato livello di anestesia, controllare il mouse per un pedale reflex (pizzico di punta costante) e regolare l'anestetico, se necessario.</li>
	<li>Inumidire la pelle del topo con etanolo al 70%.</li>
	<li>Fare un'incisione del midline di 2 cm utilizzando un funzionamento forbici e pinzette chirurgiche per esporre la vena cava.</li>
	<li>Sacrificio di topi di transection della vena cava e l'aorta. Se necessario, inserire un ago di calibro 21 G nella vena cava sopra le vene renali per raccogliere il sangue prima del dissanguamento. In alternativa, raccogliere il sangue tramite la puntura di cuore seguendo protocolli standard.</li>
	<li>Utilizzare una forbice chirurgica per tagliare aperto la cavità addominale e rimuovere pelle/superiore muscolo, lo spostamento verso l'alto verso le costole.</li>
	<li>Utilizzare una forbice chirurgica per perforare il diaframma. Nota: Polmoni crollerà dal diaframma.</li>
	<li>Tagliare via la gabbia toracica utilizzando una forbice chirurgica per esporre il cuore ed i polmoni.</li>
	<li>Usando il forcipe, prendere una RNAsi-libera microcentrifuga da 1,5 mL e immergerlo in azoto liquido per riempire il tubo. Nota: Usare occhiali e guanti protettivi per gestire azoto liquido.</li>
	<li>Rimuovere i polmoni, inserirli nella RNAsi-libera 1,5 mL microcentrifuga riempito con azoto liquido per snap-congelare il tessuto e attendere alcuni secondi fino a quando il liquido evapora.</li>
	<li>Chiudere il coperchio del tubo e conservare il tessuto a-80 ° C fino all'utilizzo.</li>
</ol>4. RNA preparazione
<ol><li>Polverizzare tutto polmoni utilizzando un polverizzatore di tessuto in acciaio inox. Nota: Il polverizzatore di tessuto deve essere disposto in azoto liquido prima dell'uso. Dopo ogni utilizzo con soluzione di RNasi, pulire il polverizzatore.</li>
	<li>Dividere i polmoni polverizzati e inserire due provette da 1,5 mL (metà del polmone).</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l di tiocianato di guanidinium per provetta e mescolare.  Omogeneizzare ogni campione utilizzando 18g, 21g e aghi 23 G, rispettivamente. Nota: I campioni possono essere addizionati con 5.6 x 108 copie di un piccolo RNA spike-in control (da una specie diversa) prima di procedere con l'estrazione.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l di etanolo per ogni campione e vortex per 15 s.</li>
	<li>Carico la miscela in una colonna di spin in una provetta e centrifugare a 12.000 x g per 1 min. scartare il flusso continuo.</li>
	<li>
Per dnasi I trattamento (in colonna);
	<ol>
<li>Aggiungere 400 µ l di RNA Wash Buffer e centrifugare a 12.000 x g per 1 min.</li>
		<li>In un tubo di RNAsi-libera, aggiungere 5 µ l di dnasi I e 75 µ l di digestione del DNA: 1x buffer e mescolare. Aggiungere il mix direttamente alla matrice colonna.</li>
		<li>Incubare a temperatura ambiente per 15 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 400 µ l di soluzione di prelavaggio RNA alla colonna e centrifugare a 12.000 x g per 1 min. scartare il flusso continuo e ripetere questo passaggio.</li>
	<li>Aggiungere 700 µ l di tampone di lavaggio di RNA alla colonna e centrifugare a 12.000 x g per 1 min. scartare il flusso continuo.</li>
	<li>Centrifugare a 12.000 x g per 2 minuti rimuovere il tampone rimanenti. Trasferire la colonna in una provetta di RNAsi-libera.</li>
	<li>Per eluire il RNA, aggiungere 35 µ l di acqua privo di DNasi e RNasi direttamente alla matrice colonna e centrifugare a 12.000 x g per 1,5 min.</li>
	<li>Misurare la concentrazione di RNA totale (260 nm) e purezza utilizzando uno spettrofotometro. Seguire le istruzioni per eseguire la quantificazione di RNA in un campione di 1,5 µ l aliquota. Spegnete lo strumento con acqua privo di DNasi e RNasi utilizzato per eluizione. Nota: Un rapporto di 260/280 di ~2.0 è generalmente accettato come "puro" per il RNA. Concentrazione di RNA tipica varia solitamente tra 750 e 2.500 ng / µ l.</li>
	<li>Conservare a-80 ° C.</li>
</ol>5. miRNA Profiling
<ol><li>
Retrò-trascrivere piccoli RNA, uso 200 ng di RNA totale.
	<ol>
<li>Preparare la miscela di reazione d'inversione-trascrizione su ghiaccio (volume totale per reazione è di 20 µ l). Per ogni reazione, aggiungere 4 µ l di tampone, 2 µ l di 10 x mescolano nucleotidi, 2 µ l di trascrittasi inversa e 2 µ l di acqua RNAsi-libera: 5x. Mescolare tutti i componenti e aliquota in 600 µ l RNAsi-libera tubi di plastica (10 µ l di miscela per reazione). Nota: Il mix master di d'inversione-trascrizione contiene tutti i componenti necessari per la sintesi del cDNA del primo-filo tranne modello RNA. Nota: Quando si prepara il mix master, calcolare il volume in eccesso (10%).</li>
		<li>Aggiungere il modello di RNA (200 ng in 10 µ l) in ogni provetta contenente mix master d'inversione-trascrizione. Mix, centrifuga per 15 s a 1.000 x ge memorizzarli sul ghiaccio fino alla messa in termociclatore o blocco asciutto.</li>
		<li>Incubare per 60 min a 37 ° C.</li>
		<li>Incubare per 5 minuti a 95 ° C e mettere i tubi sul ghiaccio.</li>
		<li>Diluire il cDNA aggiungendo 200 µ l di acqua RNAsi-libera in ogni reazione di d'inversione-trascrizione di 20 µ l.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Eseguire PCR in tempo reale utilizzando la risposta infiammatoria del Mouse e autoimmunità miRNA Array di PCR.
	<ol>
<li>Preparare una miscela di reazione (volume totale 1100 µ l): per ogni reazione, aggiungere 550 µ l di 2 x PCR mix master, 110 µ l di miscela primer universale: 10x, 340 µ l di acqua RNAsi-libera e µ l 340 del modello cDNA (diluito reazione dal punto 5.1.5).</li>
		<li>Aggiungere 10 µ l di miscela di reazione ad ogni pozzetto del quieto pre-caricato matrice PCR utilizzando una pipetta multicanale.</li>
		<li>Sigillare il miRNA piastra PCR Array con pellicola adesiva ottico.</li>
		<li>Centrifugare la piastra per 1 min a 1.000 x g a temperatura ambiente per rimuovere le bolle.</li>
		<li>Programmare il ciclatore in tempo reale, la fase di attivazione iniziale di PCR per 15 min a 95 ° C, 3-passo ciclismo contenente denaturazione per 15 s a 94 ° C, ricottura per 30 s a 55 ° C e l'estensione per 30 s a 70 ° C per 40 cicli di numero. Nota: Segui produttore ciclismo condizioni istruzioni per impostare il ciclatore in tempo reale. Eseguire il passaggio di curva di dissociazione incorporato nel software cycler in tempo reale.</li>
		<li>Eseguire analisi di dati.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. analisi dei dati
<ol><li>Estrarre valori Ct dal software real time PCR per ciascun campione in un software di analisi. Nota: Ct A valore di 34 è considerato come Cut-off. Se i campioni contengono spike-in controllo (ad esempio, cel-mir-39), normalizzare i valori di Ct nel Raccoglitore in controllo per ciascun campione. Potrebbero essere necessario impostare manualmente i valori di soglia. Valori basali vengono impostati automaticamente.</li>
	<li>Normalizzare i valori di Ct al Ct medio di sei comandi di pulizie di miRNA: SNORD61, SNORD68, SNORD72, SNORD95, SNORD96A, RNU6-2, utilizzando la seguente equazione: ΔCt = (Ct_Target − Ct_housekeeping)</li>
	<li>Per fold modificare calcoli, calcolare i valori di ΔΔCt utilizzando un campione specifico del controllo, utilizzando l'espressione relativa equazione12: espressione di miRNA relativa: 2-essereCt, dove - ∆∆Ct =-[∆ CT test - controllo ∆ CT] Nota: Un cambiamento di piega di 200 è considerato come Cut-off.</li>
	<li>Esportare piega modificare i valori di espressione per eseguire analisi statistiche su R utilizzando il pacchetto limma Bioconductor8.</li>
	<li>Correggere per i confronti multipli usando il metodo Benjamini-Hochberg13. Nota:  Una copia dello script R è disponibile presso: <a href="http://psilveyra.github.io/silveyralab/">http://psilveyra.github.io/silveyralab/</a>. Analizzati dati e DataSet sono disponibili presso il Gene Expression Omnibus sotto il numero GSE111667, anche https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE111667.</li>
</ol>7. analisi dei dati: Analisi funzionale Software
<ol><li>Organizzare il dataset. Includono i miRNA con loro rapporti di ceppo rispettive espressioni e valori di p. Vedere la tabella 1 per la formattazione del set di dati specifico.</li>
	<li>Software di analisi funzionale aperta (versione 01-10).</li>
	<li>Caricare il set di dati utilizzando il seguente formato: formato di File: "formato flessibile", contiene intestazione di colonna: "Sì", selezionare il tipo di identificatore: "miRBase (maturo)", piattaforma di matrice utilizzato per esperimenti: scegliere la piattaforma di matrice. Nota: Accettati sono formati di file. txt (file di testo delimitato da tabulazione), xls (file excel) e diff (file cuffdiff).</li>
	<li>Selezionare "Dedurre Observations" e verificare che il gruppo sperimentale di etichettatura sia corretto.</li>
	<li>Vai a "Sintesi di Dataset" di rivedere l'importo totale dei miRNA mappati e non mappati.</li>
	<li>
Fare clic sul pulsante "nuovo" nella parte superiore sinistra del programma. Selezionare "Nuovo MicroRNA destinazione filtro" e caricare un dataset di microRNA.
	<ol>
<li>Impostare origine: TarBase, ingegno esperti risultati, miRecords.</li>
		<li>Impostata la fiducia: sperimentalmente osservato o alta (predetto).</li>
		<li>Selezionare "Aggiungi colonne" di includere una varietà di informazioni biologiche sulle destinazioni quali specie, malattie, tessuti, percorsi e altro ancora.</li>
		<li>Per concentrarsi su obiettivi che hanno cambiato espressione nell'esperimento, selezionare "Aggiungi / Sostituisci mRNA dataset". Utilizzare "Accoppiamento di espressione" per individuare i microRNA con i livelli di espressione di uguali o diversi. Nota: L'analisi di filtro fornirà microRNA nomi e simboli, mRNA bersaglio, la fonte che descrive la relazione di destinazione e il livello di confidenza del rapporto previsto (Figura 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fare clic su "Aggiungi a My Pathway" per inviare il dataset filtrato ad una tela di percorso ed esplorare altre relazioni biologiche.</li>
	<li>Utilizzare Progettazione percorso per creare un modello di pubblicazione-qualità degli effetti di microRNA.</li>
	<li>
Un'opzione alternativa consiste nel creare un'analisi di base.
	<ol>
<li>Per tipo di analisi di base, selezionare "Analisi dell'espressione".</li>
		<li>Per tipo di misura, selezionare "Expr rapporto Log".</li>
		<li>Riepilogo di filtro di analisi: considera solo molecole e/o relazioni dove: (specie = mouse) AND (fiducia = sperimentalmente osservati) AND (origini dati = "Ingegno esperto risultati", "Ingegno ExpertAssist risultati", "miRecords", "TarBase", o " TargetScan umani").</li>
		<li>Selezionare un limite di valore di p = 0,05.</li>
		<li>Eseguire l'analisi. Nota: La relazione comprenderà: vie canoniche, analisi di regolatori a Monte, malattie e funzioni, effetti di regolatore, reti, molecole e altro ancora.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere nessun interessi concorrenti.

MicroRNA profiling è una tecnica vantaggiosa sia per la diagnosi delle malattie e ricerca meccanicistico. In questo manoscritto, abbiamo definito un protocollo per la valutazione dell'espressione dei miRNA che sono preveduti per regolare i geni infiammatori nei polmoni dei topi femminili esposti all'ozono nelle fasi differenti ciclo estrale. Metodi per la determinazione del ciclo estrale, ad esempio il metodo di rilevamento visivo, sono stati descritti16. Tuttavia, questi si basano su misure una t...

i microRNA (Mirna) sono brevi (19-25 nucleotidi), naturale, non-codificanti molecole di RNA. Sequenze di Mirna sono evolutivi conservata tra le specie, suggerendo l'importanza di miRNA nel regolare le funzioni fisiologiche1. Profilo di espressione di microRNA ha dimostrato di essere utile per l'identificazione di Mirna che sono importanti nella regolazione di vari processi, tra cui la risposta immunitaria, differenziamento cellulare, processi di sviluppo e apoptosi2. Più recentemente, Mirna sono stati riconosciuti per il loro uso potenziale nella malattia diagnostica e terapeutica. Per i ricercatori che studiano i meccanismi di regolazione genica, espressione dei miRNA di misurazione può illuminare sistemi-livello modelli di processi normativi, soprattutto quando le informazioni di miRNA sono unite con profilatura di mRNA e altri dati su scala genomica3. D'altra parte, i miRNA hanno anche dimostrati di essere più stabili di mRNA in una gamma di tipi di campioni e sono anche misurabili con sensibilità maggiore di proteine4. Questo ha portato alla notevole interesse nello sviluppo di Mirna come biomarcatori per diverse applicazioni di diagnostiche molecolare, tra cui malattie polmonari.
Nel polmone, miRNA svolgono un ruolo importante nei processi di sviluppo e il mantenimento dell'omeostasi. Inoltre, la loro espressione anormale è stato associato con lo sviluppo e la progressione di varie malattie polmonari5. Malattia infiammatoria polmonare indotta dall'inquinamento atmosferico ha dimostrato una maggiore gravità e prognosi nelle femmine, che indica che gli ormoni e il ciclo estrale può regolare del polmone innata immunità e miRNA espressione in risposta alle sfide ambientali 6. nel presente protocollo, usiamo l'esposizione dell'ozono, che è una componente importante di inquinamento atmosferico, per indurre una forma di infiammazione polmonare in topi femminili che si verifica in assenza di immunità adattativa. Utilizzando ozono, noi stiamo inducendo lo sviluppo di hyperresponsiveness della via aerea che è associato con danno delle cellule epiteliali delle vie aeree e un aumento in neutrofili e mediatori infiammatori nelle vie aeree prossimali7. Attualmente, non esistono protocolli ben descritti a caratterizzare e analizzare Mirna attraverso il ciclo estrale in topi esposti a ozono.
Di seguito, descriviamo un metodo semplice per identificare le fasi del ciclo estrale ed espressione dei miRNA nel tessuto polmonare dei topi femminili esposti all'ozono. Ci rivolgiamo anche bioinformatica efficaci approcci all'identificazione di scoperta e di destinazione di miRNA, con un'enfasi su biologia computazionale. Analizziamo i dati di microarray utilizzando limma, un software R/Bioconductor che fornisce una soluzione integrata per l'analisi dei dati di espressione genica esperimenti8. Analisi dei dati di matrice PCR da limma ha un vantaggio in termini di potenza sul t-test basato procedure quando si utilizza il piccolo numero di matrici/campioni per confrontare l'espressione. Per comprendere il contesto biologico di risultati di espressione di miRNA, abbiamo poi utilizzato il software di analisi funzionale. Al fine di comprendere i meccanismi di regolazione trascrizionale modifiche e a prevedere i risultati probabili, il software combina i set di dati di espressione dei miRNA e conoscenza dalla letteratura9. Questo è un vantaggio se confrontato con software che basta guardare per statistica arricchimento in sovrapposizione a insiemi di Mirna.

<table><tbody><tr><td>Topi C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>8 settimane</td></tr><tr><td>Acqua ultrapura</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10813012</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta in plastica sterile</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-25</td><td>Capacità: 1,7 mL</td></tr><tr><td>Vetrini per microscopio smerigliato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2951TS</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio ottico</td><td>Microscope World</td><td>MW3-H5</td><td>10x e 20x obiettivo</td></tr><tr><td>Ketathesia- Ketamina HCl Iniezione USP</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>55853</td><td>90 mg/kg. Farmaco controllato.</td></tr><tr><td>Xilazina Soluzione Sterile</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>139-236</td><td>10 mg/kg. Farmaco controllato.</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td>Diluire al 70% di etanolo con acqua.</td></tr><tr><td>Ago calibro 21 G</td><td>BD Biosciences</td><td>305165</td><td></td></tr><tr><td>Siringa</td><td>Fisher Scientific</td><td>329654</td><td>1 mL</td></tr><tr><td>Forbici operative</td><td>World Precision Instruments</td><td>501221, 504613</td><td>14 cm, affilato/smussato, curvo e 9 cm, dritto, fine</td></tr> Kit <tr><td>pinzetta</td> a punta affilata World <td>Precision Instruments</td><td>504616</td><td></td></tr><tr><td>Spectrum&nbsp; Frantumatori tissutali Bessman</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-418-1</td><td>Capacità: da 10 a 50 mg</td></tr><tr><td>Provette per microfughe prive di RNasi</td><td>Thermo Fisher Scientific AM12400</td><td></td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Reagente TRIzol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>RNA Direct-zol MiniPrep Plus</td><td>Zymo Research</td><td>R2071</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>Kit miScript II RT</td><td>Qiagen</td><td>218161</td><td></td></tr><tr><td>Risposta infiammatoria del topo & Autoimmunità miRNA PCR Array</td><td>Qiagen</td><td>MIMM-105Z</td><td></td></tr><tr><td>Provette PCR a parete sottile, prive di DNasi, senza RNasi</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM12225</td><td>per 20 &mu; Reazioni L</td></tr><tr><td>miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control</td><td>Qiagen</td><td>219610</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td>https://office.microsoft.com/excel/</td></tr> <tr><td>Ingenuity Pathway Analysis</td><td>Qiagen</td><td></td><td>https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/</td></tr> <tr><td>R Software</td><td>The R Foundation</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>Termociclatore o blocco di raffreddamento/riscaldamento</td><td>Fornitore generale da laboratorio Microcentrifuga</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fornitore generale da laboratorio Cycler</td><td></td><td></td></tr><tr><td>in tempo reale Fornitore</td><td>generale da laboratorio Pipettatore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>multicanale</td><td>Fornitore generale da laboratorio Tampone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>di lavaggio RNA</td><td>Zymo Research</td><td>R1003-3-48</td><td>48 mL</td></tr><tr><td>tampone di digestione DNA</td><td>Zymo Research</td><td>E1010-1-4</td> 4 <td>mL</td></tr><tr><td>RNA tampone di prelavaggio</td><td>Zymo Research</td><td>R1020-2-25</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Analizzatore di ozono ultravioletto</td><td>Teledyne API</td><td>Modello T400</td><td>http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400</td></tr><tr><td>Regolatori di flusso di massa</td><td>Sierra Instruments Inc</td><td>Flobox 951/954</td><td>http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html</td></tr></tbody></table>

polmone microrna profiling attraverso il ciclo estrale in topi esposti a ozono

Lung microRNA Profiling Across the Estrous Cycle in Ozone-exposed Mice

Profilatura di MicroRNA (miRNA) è diventato di interesse per i ricercatori che lavorano in diverse aree di ricerca della biologia e della medicina. Gli studi correnti indicano un promettente futuro di utilizzando miRNA nella diagnosi e cura di malattie polmonari. Qui, viene definito un protocollo per i miRNA profilatura per misurare l'abbondanza relativa di un gruppo di Mirna preveduti che regolano i geni infiammatori nel tessuto polmonare da di un modello di topo di infiammazione delle vie aeree indotta da ozono. Perché è stato dimostrato che livelli di ormoni sessuali circolanti possono influire sulla regolazione dell'immunità innata del polmone nelle femmine, lo scopo di questo metodo è di descrivere un miRNA infiammatoria profilatura protocollo nei topi femmina, prendendo in considerazione il ciclo estrale fase di ogni animale al momento dell'esposizione all'ozono. Ci rivolgiamo anche approcci di bioinformatica applicabile a miRNA discovery e destinazione metodi di identificazione tramite limma, un software R/Bioconductor, e software di analisi funzionale per capire il contesto biologico e percorsi associati con espressione differenziale dei miRNA.

I tipi differenti delle cellule osservati negli strisci vengono utilizzati per identificare la fase del ciclo estrale del mouse (Figura 1). Questi sono identificati dalla morfologia delle cellule. Durante il proestro, le cellule sono quasi esclusivamente gruppi di cellule epiteliali nucleate forma circolare, ben formate (Figura 1A). Quando il mouse è in fase di estro, le cellule sono cellule epiteliali squamous cornified, present...

Qui descriviamo un metodo per valutare l'espressione di polmone di Mirna che sono preveduti per regolare i geni infiammatori utilizzando topi esposti all'ozono o aria filtrata nelle diverse fasi del ciclo estrale.

Polmone microRNA Profiling attraverso il ciclo estrale in topi esposti a ozono

MicroRNA (miRNA) profiling has become of interest to researchers working in various research areas of biology and medicine. Current studies show a ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunità polmonare su come valutare l'espressione dei microRNA che si prevede regolino i geni infiammatori all'interno del polmone. Questa tecnica offre il modo semplice per identificare i contributi degli ormoni circolanti all'espressione del microRNA polmonare. Per valutare la fase del ciclo estrosa, trattenere manualmente un topo femmina di otto-nove settimane e introdurre la punta di una pipetta di plastica da 10 microliter riempita con acqua ultra pura nella vagina.Sciacquare delicatamente da quattro a cinque volte per raccogliere un campione e depositare lo scarico finale di liquido vaginale su uno scivolo di vetro. Quindi osservare il lavaggio vaginale non macchiato sotto un microscopio leggero con ingrandimento 20X. Per le esposizioni all'ozono e all'aria filtrata, posizionare un massimo di quattro topi in uno dei due singoli contenitori di vetro da 1,2 litri con coperchi in rete metallica.Mettere un contenitore di vetro in una camera di ozono e uno in una camera di esposizione all'aria filtrata. Quindi regolare la concentrazione di ozono a due parti per milione, rimuovendo il contenitore dopo tre ore. Quattro ore dopo l'esposizione, disinfettare la superficie cutanea esposta del primo topo sperimentale con il 70% di etanolo e tagliare la gabbia toracica per esporre il cuore e i polmoni.Utilizzare le forcep per immergere un tubo di micro centrifuga privo di RNasi da 1,5 millilitri nell'azoto liquido e congelare il polmone raccolto nell'azoto liquido. Quindi utilizzare un polverizzatore di tessuto in acciaio inossidabile per mascerare l'intero polmone e dividere il tessuto polverizzato tra due tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Dopo aver raccolto e polverizzato i polmoni da tutti gli animali allo stesso modo, aggiungere 500 microlitri di tiocianato di guanidinio a ciascun campione e omogeneizzare sequenzialmente ogni tessuto con aghi calibro 18, 21 e 23.Dopo l'ultima omogeneizzazione, aggiungere 500 microlitri di etanolo a ciascun campione prima del vortice per 15 secondi. Caricare le miscele in singole colonne di spin in singoli tubi di raccolta per la centrifugazione e scartare i flowthrough. Per il trattamento con DNasi 1, aggiungere 400 microlitri di tampone di lavaggio dell'RNA a ciascuna colonna per un'altra centrifugazione e mescolare cinque microlitri di DNasi 1 e 75 microlitri di tampone di digestione del DNA per campione in tubi senza RNasi.Aggiungere la miscela direttamente alle matrici di colonna per un'incubazione di 15 minuti a temperatura ambiente, seguita da due lavaggi di soluzione di prelavaggio dell'RNA da 400 microliter mediante centrifugazione. Per elutare l'RNA, aggiungere 35 microlitri di acqua priva di DNA direttamente a ciascuna matrice di colonna per una centrifugazione finale e misurare la concentrazione totale di RNA e la purezza di ogni campione su uno spettrofotometro. Quindi conservare l'RNA a meno 80 gradi Celsius.Per la retrotrascrizione della piccola RNasi, aggiungere 200 nanogrammi di RNA totale in 10 microlitri di soluzione di prelavaggio a un tubo di miscela di reazione di trascrizione inversa per campione. Dopo la miscelazione, centrifugare brevemente i campioni e metterli sul ghiaccio fino alla loro incubazione. Successivamente, incubare i tubi per 60 minuti a 37 gradi Celsius, seguiti da un'incubazione di cinque minuti a 95 gradi Celsius.Alla fine della seconda incubazione, diluire il CDNA con 200 microlitri di acqua priva di RNasi per reazione di trascrizione inversa di 20 microlitri e aggiungere 10 microlitri di ogni campione di miscela di reazione ad ogni pozzo di una risposta infiammatoria del mouse precaricata e di un array PCR di microRNA autoimmuni. Lo stadio del proestro può essere identificato dalla presenza di cellule epiteliali nucleate a forma rotonda e ben formate. Quando il topo si trova nella fase dell'estro, nello striscio si osservano grappoli densamente impacchettati di cellule epiteliali anucleate, cornificate e squamose.Durante il metestro, si vedono cellule epiteliali cornificate e leucociti polimorfonucleari. Nel diestro, i leucociti sono generalmente più diffusi. L'RNA estratto da quattro polmoni a topo, come dimostrato, mostra concentrazioni di acido nucleico che vanno da 1198 a 2178 nanogrammi per microlitro e un rapporto medio da A260 a A280 tra 2,01 e 2,02 e un rapporto medio da A260 a A230 tra 2,139 e 2,223.In questa tabella, vengono mostrati cambiamenti due volte nell'espressione del microRNA tra ozono e topi esposti all'aria filtrata. Dopo il filtro di destinazione del microRNA e l'analisi del nucleo per 14 microRNA, per ottenere il significativo rapporto di registro delle espressioni e i valori P, questi dati possono essere mappati dal filtro di destinazione del microRNA. L'analisi di base fornisce anche informazioni su percorsi canonici, malattie e funzioni, regolatori e reti.Inoltre, il software di analisi funzionale può essere utilizzato per produrre un'analisi di rete che mostra la relazione tra i microRNA di interesse e altre molecole. Durante il tentativo di questa procedura, è importante controllare il ciclo dell'estro ogni giorno per almeno tre cicli consecutivi prima di condurre un esperimento. Seguendo questa procedura, altri metodi possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive sull'espressione genica infiammatoria polmonare durante il ciclo dell'estro.Dopo lo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ad altri ricercatori nel campo dell'immunità polmonare per esplorare meccanismi di regolazione dell'ormone sessuale utilizzando altri modelli.

lung-microrna-profiling-across-the-estrous-cycle-in-ozone-exposed-mice

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Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Qui, descriviamo come identificare lo stadio della murino riproduttiva (proestro, estro, metestrus o diestro) per semplice, non invasivo raccolta e la valutazione citologica di campioni di striscio vaginale. Abbiamo inoltre descritto come citologia vaginale riflette livelli circolanti ormonali alla base di transizione attraverso il ciclo riproduttivo murino.

Esecuzione Lavage vaginale, di colorazione viola di cristallo, e la valutazione citologica vaginale per l&#39;identificazione ciclo estrale Staging mouse

Due paradigmi di esercizio sono stati testati su un indotto chimicamente modello murino della menopausa di recente sviluppato per esaminare l'impatto della menopausa sulla capacità di esercizio e l'adattamento cardiaco per esercitare.

Un metodo per studiare l&#39;impatto delle chimicamente indotta da insufficienza ovarica sulla capacità di esercizio e adattamento cardiaca nei topi

Questo studio descrive la generazione di successo di un nuovo modello animale di malattia polmonare ostruttiva cronica (COPD) esponendo ripetutamente topi ad alte concentrazioni di ozono.

Generazione di un modello di malattia polmonare ostruttiva cronica nei topi da esposizione ripetuta dell'ozono

Questo manoscritto descrive un protocollo per determinare se l'esposizione all'ozono, un criterio di inquinante dell'aria, imponga l'efferocitosi alveolar in vivo. Questo protocollo utilizza reagenti e tecniche di uso comune e può essere adattato a più modelli di lesione polmonare per determinare gli effetti sull'efferocitosi del macrofagio alveolar.

Valutazione In Vivo dell'efferocitosi del macrofago alveo dopo l'esposizione all'ozono

L'ozono combinato e i topi esposti all'endotossina batterica mostrano una morte cellulare diffusa, compresa quella dei neutrofili. Abbiamo osservato adattamenti cellulari come l'interruzione della lamellipodia citoscheletricha, l'aumento dell'espressione cellulare della complessa subunità V ATP sintasi β e l'angiostatina nella lavanda bronco-alveolare, la soppressione della risposta immunitaria polmonare e il reclutamento ritardato di neutrofili.

Visualizzazione degli adattamenti cellulari polmonari durante l'ozono combinato e la lesione polmonare acuta murina indotta da LPS

Viene presentato un metodo per la microdissezione dell'ovidotto di topo che consente la raccolta dei singoli segmenti mantenendo l'integrità dell'RNA. Inoltre, viene descritta la procedura di dissociazione delle cellule oviduttali non enzimatiche. I metodi sono appropriati per la successiva analisi genica e proteica dei segmenti oviduttali funzionalmente diversi e delle cellule oviduttali dissociate.

Microdissezione e dissociazione dell'ovidotto murino: identificazione del segmento individuale e isolamento di singole cellule

In questo protocollo, il metodo di purificazione dell'affinità dei ribosomi traslanti (TRAP) e l'isolamento dei nuclei marcati in specifici tipi cellulari (INTACT) sono stati ottimizzati per l'interrogazione accoppiata del trascrittoma ovarico e dell'epigenoma specifici della cellula utilizzando il modello murino NuTRAP incrociato su una linea murina Cyp17a1-Cre.

Interrogazione accoppiata cellula-specifica dell'epigenoma ovarico e del trascrittoma ovarico del topo

L'ormone follicolo-stimolante (FSH) in vari tessuti e organi extragonadici è associato alla patogenesi di molteplici malattie. Il modello murino ovariectomizzato e trattato con FSH (OVF) può essere utilizzato per esplorare le azioni extragonadiche di FSH.

Esplorazione degli effetti indipendenti dell'ormone follicolo-stimolante in vivo in un modello murino

Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata del test del cibo sepolto e dell'esperimento di discriminazione degli odori sociali per valutare gli effetti dell'esposizione agli inquinanti ambientali inalati sulla funzione olfattiva nei topi.

Studio degli effetti degli inquinanti ambientali inalati sulla funzione olfattiva nei topi

Qui, presentiamo un protocollo per indurre l'ipossia nei topi neonatali somministrandoli in ambienti controllati con concentrazioni di ossigeno variabili. I modelli murini sottoposti a variazioni di ossigeno alla nascita hanno variato durevolmente l'espressione dei miRNA coinvolti nell'induzione di cambiamenti fenotipici comportamentali come l'autismo.

L'ipossia altera i livelli di miRNA coinvolti nell'ereditarietà non mendeliana del disturbo dello spettro autistico nei topi

Scopri il profilo dei microRNA polmonari nel ciclo estrale di topi esposti a ozono. Questo metodo valuta l'espressione dei microRNA che regolano i geni infiammatori nei polmoni.

Polmone microRNA Profiling attraverso il ciclo estrale in topi esposti a ozono

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