Visualizzazione della struttura del tessuto adiposo bianco 3D usando la macchiatura del intero-supporto

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia adiposa, come come le interazioni intercellulari e la fisiologia dei tessuti adiposi cambiano in diverse condizioni metaboliche come il digiuno e l'obesità. Il vantaggio principale di questa tecnica è che preserva in modo ottimale la struttura 3D adiposa originale ed evita lunghe fasi di elaborazione che di solito sono necessarie per l'immunoistochimica convenzionale. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla struttura del tessuto adiposo, può anche essere applicato ad altri sistemi di organi, come il sistema nervoso, macchiando il cervello a montaggio intero.

Generalmente, gli individui nuovi a questo metodo avranno difficoltà a causa delle difficoltà nel ottenere siti di tessuti di proprietà, trovare il periodo di fissazione corretto e le concentrazioni ottimali di anticorpi. Al termine della dissezione, trasferire il piatto contenente i campioni di tessuto in paraformaldeide all'1% dal ghiaccio alla temperatura ambiente per un'ora. Quindi trasferire i tessuti su una piastra di coltura cellulare da 12 o 24 po 'per un lavaggio più rapido.

È importante ricordare che la procedura di colorazione a montaggio intero deve iniziare immediatamente dopo la dissezione e che non ci sono punti di pausa tra ogni passaggio. Lavare i tessuti con PBS-0.3T su uno shaker inclinato a 22 gradi con una velocità compresa tra 20 e 25 inclinazioni al minuto a temperatura ambiente per cinque minuti. Ripetere questo lavaggio altre due volte.

Successivamente, aggiungere circa 0,5 a un millilitro di tampone di blocco contenente il 5% di siero animale. Incubare la piastra su uno shaker utilizzando le condizioni precedenti per un'ora. Aspirare la soluzione di blocco e aggiungere il millilitro di anticorpi primari diluiti in PBS-0,3T con l'1% di siero animale per ogni pozzo.

Incubare la piastra durante la notte su uno shaker a quattro gradi Celsius con un'inclinazione di 22 gradi e una velocità da 20 a 25 inclinazioni al minuto. Il giorno successivo, utilizzare PBS-0.3T per lavare i tessuti a temperatura ambiente per cinque minuti. Ripetere questo lavaggio altre due volte.

Quindi, aggiungere tra 0,5 e un millilitro di soluzioni anticorpali secondarie appropriate e diluite per ogni pozzo. Avvolgere la piastra in un foglio di alluminio e incubarla su uno shaker a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, lavare la piastra due volte con PBS-0.3T a temperatura ambiente per cinque minuti per lavaggio.

Se è necessaria la visualizzazione di goccioline liquide durante la macchia lipidica neutra, lavare due volte con 1 PBS con ogni lavaggio della durata di cinque minuti. Aggiungere la macchia lipidica neutra diluita in PBS e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Per iniziare l'imaging, utilizzare le forcelle per posare il tessuto piatto su uno scivolo di copertura di vetro da 24 per 60 millimetri.

Se si desidera la colorazione dei nuclei con DAPI, aggiungere da una a due gocce di un mezzo di montaggio che contiene DAPI per immergere completamente il tessuto e impedirne l'essiccazione. Quindi, posizionare la diapositiva su un sistema di microscopio laser confocale invertito. Per ottenere immagini di tessuto colorato a montaggio intero su più piani focali, eseguire pile Z da 100 a 150 micrometri di profondità con dimensioni del passo da quattro a sei micrometri all'ingrandimento desiderato.

In questo studio, la colorazione a montaggio intero viene utilizzata per preservare l'architettura del tessuto adiposo. A differenza dei metodi che coinvolgono più fasi di elaborazione e sessatura, che possono portare alla deturpazione della morfologia dei tessuti adiposi, il metodo di colorazione a montaggio intero può preservare la morfologia degli adipociti, garantendo precisione nell'interpretazione dei risultati. La sovrafissazione del tessuto adiposo porta alla fluorescenza indotta da fissazione, che può essere indicata sovrapponendo regioni identiche, come nei segnali tirosina idrossilasi e PECAM-1 visti qui.

Campioni di macchie correttamente fissi e a montaggio intero, tuttavia, mostrano segnali separati e distinti, indicando che questi segnali non sono autofluorescenza. L'imaging del tessuto adiposo colorato a montaggio intero consente la quantificazione dei cambiamenti morfologici in diverse condizioni sperimentali. In particolare, il tessuto adiposo è altamente vascolarizzato, il che è importante per mediare l'omeostasi metabolica a rapidi cambiamenti nel livello di energia.

Ad esempio, i topi 6J neri C57, che subiscono 24 ore di digiuno, mostrano una dimensione dell'adipocite significativamente più piccola, che indica la lipolisi, e una tendenza all'elevata densità dei vasi sanguigni rispetto ai topi alimentati continuamente. La cancellazione dei tessuti adiposi con iDISCO+ consente ai tessuti adiposi di diventare otticamente trasparenti. L'immunoetichettatura del tessuto adiposo che ha attraversato la pulizia dei tessuti mostra un arborizzazione neurale molto più densa rispetto a quella osservata nella colorazione a montaggio intero senza compensazione dei tessuti allo stesso ingrandimento.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non sovrafissare i campioni per più di un'ora a temperatura ambiente in PFA, altrimenti ciò aumenterà l'autofluorescenza in background. Tuttavia, questo periodo di fissazione può essere prolungato se i campioni sono fissati a quattro gradi Celsius. Seguendo questa procedura, altri metodi come la quantificazione utilizzando ImageJ, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive, come come l'architettura cellulare, come i siti adipocite e la densità dei vasi sanguigni, cambiano in risposta a varie condizioni fisiologiche.