Un sistema di BW Reporter per lo studio di interazioni recettore-ligando
7 gennaio 2019
Questo protocollo viene descritto come stabilire un sistema di reporter che può essere utilizzato per identificare e quantificare le interazioni recettore-ligando.
Shalom.Il BW Reporter System consente di studiare le interazioni recettore-ligando. È estremamente utile nei casi in cui il ligando di uno specifico recettore è sconosciuto o nei casi in cui gli esperimenti con il ligando endogeno sono tecnicamente difficili. Questo metodo è sensibile e specifico per un singolo recettore, facile da usare e riproducibile.
A dimostrare la procedura sarà Shira Kahlon, un postdoc per il mio laboratorio. Il giorno prima della trasfezione, placcare 10 piastre con 10 millilitri di 100.000 cellule BW5147 e integrare un RPMI. Quindi posizionare 100 microgrammi del plasmide pcDNA3 in un tubo.
Aggiungere l'acetato di sodio a pH 5.3 al tubo. Successivamente, aggiungere 2,5 volumi di etanolo al 100% alla miscela plasmide. Quindi incubare la miscela plasmide durante la notte a meno 20 gradi Celsius.
24 ore dopo aver placcato le cellule BW, raccogliere le cellule in due tubi da 50 millilitri. Quindi centrifugare le cellule a 515 g per cinque minuti e scartare il supernatante. Rimospend il gruppo RPMI senza aggiunte e ripetere la centrifugazione.
Resuspend il pellet risultante in 1 millilitro di RPMI senza aggiunte. Trasferire il pellet rimorsio in una cuvata di 4 centimetri sul ghiaccio. Centrifugare il plasmide che ha subito precipitazioni di etanolo.
Quindi lavare il plasmide con un millilitro di 70% di etanolo. E ripetere la centrifugazione per altri 20 minuti. Rimuovere tutto l'etanolo e lasciare asciugare parzialmente il pellet.
Quindi rimescolare il pellet in 100 microlitri di RPMI preriscaldato, senza aggiunte. Dopo questo, aggiungere il plasmide rimorsidito alle cellule in coccola. Incubare le cellule sul ghiaccio per cinque minuti.
Quindi, elettroporate le cellule. Quindi trasferire le celle elettroporate in un tubo da 50 millilitri. Aggiungere 50 millilitri di mezzo completo al tubo e centrifugare per cinque minuti, a 515 g.
Scartare il supernatante e rimescolare le cellule in 50 millilitri di mezzo completo. Quindi placcare le cellule in piatti di coltura di 24 pozzi e incubare le cellule per 48 ore. Successivamente, aggiungere un millilitro di mezzo completo, integrato con 10 milligrammi per millilitro di G418 ad ogni pozzo.
48 ore dopo, scartare un millilitro del volume superiore di ogni pozzo. Quindi aggiungere un millilitro di mezzo completo integrato con cinque milligrammi per millilitro di G418 ad ogni pozzo. Utilizzare 50.000 cellule BW trasfette con i bersagli desiderati, in un unico pozzo di una piastra da 96 po'.
Incubare la piastra per 48 ore. Quindi congelare la piastra a meno 20 gradi Celsius. Rivestire una piastra ELISA con anticorpo IL-2 anti-topo.
Posizionare 05 microgrammi di IL-2 anti-mouse, in un volume di 50 microlitri di PBS in ogni pozzo. Incubare la piastra rivestita durante la notte a quattro gradi Celsius. Utilizzare un breve periodo di incubazione a 37 gradi Celsius, per scongelare le cellule BW congelate, precedentemente incubate con i loro bersagli.
Quindi centrifugare la piastra e trasferire 100 microlitri del supernatante da ogni pozzo alla piastra ELISA pre-rivestita. E incubare a 37 gradi Celsius per due ore. Dopo questo aggiungere biotina anti-mouse IL-2 alla piastra ELISA.
Quindi, dopo l'incubazione e il lavaggio, aggiungere la streptavidina coniugata HRP al piatto. Dopo l'incubazione e il lavaggio, aggiungere 100 microlitri della soluzione di substrato TMB, ad ogni pozzo della piastra ELISA. Leggi infine la piastra ELISA a 650 nanometri.
In questo esempio, le cellule CLL sono state pre-incubate con diversi anticorpi anti-CD20. E poi co-incubato con cellule BW trasfette che esprimono i recettori Fc CD16, prima di essere analizzato con ELISA. Dopo l'analisi con ELISA i risultati sono stati quantificati.
I livelli di densità ottica, sono stati convertiti in concentrazioni il-2 del mouse, in base alla curva standard. In un esperimento aggiuntivo, diverse dosi di anticorpi anti-CD20 sono state pre-incubate con cellule CLL. E poi incubato con le cellule BW trasfette.
La particella contiene quattro parti principali. Clonazione, trasfezione di cellule BW, attivazione ed ELISA. Ognuna delle parti deve essere verificata in modo indipendente.
Seguendo questa procedura, ulteriori esperimenti possono essere eseguiti con cellule che esprimono i recettori endogeni, come uccidere gli acidi con cellule NK per studiare le interazioni con i recettori cellulari NK. Abbiamo usato questo sistema per scoprire nuovi ligandi dei recettori cellulari NK. Per esempio, l'emagglutinina è un ligando di NKp46, e PVL è un ligando di TG.
Panoramica
Questo articolo descrive il Sistema BW Reporter, un metodo sensibile e specifico per lo studio delle interazioni recettore-legante, in particolare quando il legante è sconosciuto o difficile da manipolare. Il sistema utilizza cellule murine BW5147 trasfettate con un costrutto recettoriale chimerico, consentendo la quantificazione dell'attivazione del recettore mediante la secrezione di interleuchina-2 (IL-2) rilevata tramite saggio immunoenzimatico (ELISA). Questo approccio facilita l'analisi dell'attivazione del recettore da parte di diversi leganti, inclusi anticorpi e molecole di superficie cellulare.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Immunologia
- Biologia cellulare
- Biologia molecolare
Sfondo
- Le interazioni recettore-legante sono fondamentali per molti processi biologici.
- Gli esperimenti diretti con recettori e leganti nativi possono risultare difficili a causa di leganti sconosciuti o di difficoltà tecniche.
- I sistemi reporter possono fornire una rilevazione sensibile e specifica dell'attivazione del recettore.
- Sono necessari saggi quantitativi per misurare i livelli di attivazione del recettore.
Scopo dello studio
- Sviluppare e dimostrare un sistema reporter per rilevare le interazioni recettore-legante.
- Consentire la quantificazione dell'attivazione del recettore anche quando il legante è sconosciuto.
- Fornire un metodo riproducibile e di facile utilizzo per lo studio dei recettori.
Metodi Utilizzati
- Clonaggio del dominio extracellulare di un recettore specifico fuso al CD3ζ murino.
- Trasfezione delle cellule murine BW5147 con il costrutto del recettore chimerico mediante elettroporazione.
- Selezione delle cellule trasfettate con l'antibiotico G418.
- Incubazione delle cellule BW trasfettate con cellule bersaglio o anticorpi.
- Misurazione dell'IL-2 murino secreto mediante ELISA come lettura dell'attivazione del recettore.
Risultati principali
- Il sistema di rilevamento rileva con successo l'attivazione di specifici recettori da parte di vari ligandi.
- La misurazione quantitativa della secrezione di IL-2 corrisponde ai livelli di attivazione del recettore.
- Il sistema è stato utilizzato per studiare l'attivazione dei recettori Fcγ umani indotta da anticorpi anti-CD20 su cellule CLL.
- I risultati possono essere standardizzati utilizzando la densità ottica per la conversione nella concentrazione di IL-2 tramite curve standard.
Conclusioni
- Il Sistema Reporter BW è uno strumento affidabile per l'analisi delle interazioni recettore-legante.
- È applicabile anche quando il legante è sconosciuto o difficile da utilizzare sperimentalmente.
- Il metodo è sensibile, specifico e consente un'analisi quantitativa dell'attivazione del recettore.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Il Sistema BW Reporter consente un'analisi sensibile e quantitativa delle interazioni recettore-legante, anche quando il legante è sconosciuto o tecnicamente difficile da gestire. Questa capacità risolve un collo di bottiglia fondamentale nella fase iniziale della scoperta e nella validazione del bersaglio, fornendo una piattaforma riproducibile e scalabile per lo studio dell'attivazione funzionale dei recettori. Il sistema supporta la riduzione del rischio su tutta la linea di prodotti e accelera l'affidabilità meccanicistica in punti critici dello sviluppo di biologici e anticorpi.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Consente la validazione funzionale dell'attivazione del recettore da parte di diversi ligandi, inclusi quelli sconosciuti.
- Permette la riduzione del rischio meccanicistico isolando eventi di attivazione specifici del recettore.
- Facilita il triage rapido di bersagli candidati in base a profili quantitativi di attivazione.
- Fornisce un'uscita standardizzata per l'interrogazione del percorso guidata da ipotesi.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce un output quantitativo e riproducibile basato su ELISA per flussi di lavoro di screening successivi.
- Supporta la standardizzazione del saggio e la riproducibilità tra laboratori negli studi su recettori e ligandi.
- Permette la valutazione su scala ampliabile di anticorpi o candidati ligandi cellulari.
- Prepara sistemi biologici validati per la valutazione di composti ad alta affidabilità.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Allinea i dati di attivazione del recettore a terapie con anticorpi o cellule rilevanti per la malattia.
- Garantisce continuità dalla scoperta alla validazione preclinica dell'interazione funzionale con il recettor.
- Supporta l'avanzamento di candidati biologici con rischio aggiustato in base a soglie quantitative di attivazione.
- Permette lo sviluppo di biomarcatori traslazionali quando l'attivazione del recettore rappresenta un endpoint chiave.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo sistema di reporter è adatto dalla fase iniziale di scoperta fino all'identificazione del composto promettente e alla validazione preclinica, fornendo una piattaforma riutilizzabile per l'analisi funzionale recettore-legante.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la riduzione del rischio meccanicistica quantificando l'attivazione del recettore in risposta a ligandi candidati.
- Screening: Offre output ELISA standardizzati e quantitativi per confrontare l'efficacia e la specificità dei ligandi.
- Analisi: Permette la conversione della densità ottica in concentrazione di IL-2 per analisi statistiche solide tra diverse condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega studi di scoperta e studi preclinici validando l'interazione funzionale con bersagli terapeutici.
- Riutilizzo aziendale: Fornisce un sistema modulare e adattabile per studi diversificati su recettori e ligandi in diversi programmi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del bersaglio.
- Valore operativo: Fornisce saggi standardizzati, riproducibili e scalabili di attivazione dei recettori.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione e l'efficienza del capitale consentendo uno screening funzionale precoce.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e la progressione dei candidati biologici e anticorpali con adeguamento del rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze di clonazione molecolare e trasfezione cellulare per la generazione di recettori chimerici.
- Necessita dell'accesso a strumentazione per ELISA e infrastrutture analitiche per letture quantitative.
- Richiede una standardizzazione condivisa tra gruppi di lavoro per le condizioni del saggio e le procedure di analisi dei dati.
- Adattabile a diversi tipi di recettori e fonti di ligandi, inclusi anticorpi e molecole della superficie cellulare.
- Dipende dalla verifica indipendente di ciascun componente del flusso di lavoro per ottenere risultati robusti.
