Valutazione dell'interazione tra la proteina di complemento C1q e l'acido chialuronico nella promozione dell'adesione cellulare
15 giugno 2019
Il componente complementare C1q è una molecola pro-infiammatoria altamente espressa nel microambiente tissutale che può interagire con la matrice extracellulare. Qui, descriviamo un metodo per testare come C1q legato all'acido ialuronico influisce sull'adesione cellulare.
Una procedura completa per valutare l'interazione tra la proteina del complemento C1q e l'acido ialuronico nel promuovere l'adesione cellulare. Abbiamo recentemente definito che il componente del complemento C1q una molecola del sistema immunitario innato è altamente espressa nel microambiente tumorale e placenta ed è in grado di interagire con la componente della matrice extracellulare. In questo caso, acido ialuronico.
Proponiamo un metodo per studiare le funzioni biologiche delle proteine in tutto l'ambiente ecronomico. Al fine di studiare la capacità di queste molecole di modellare le proprietà di divisione cellulare dei fattori della matrice extracellulare. Per studiare come questa interazione possa essere percepibile dalle cellule presenti nel tessuto dell'ambiente, abbiamo impostato questo metodo semplice in cui le cellule binarie derivate dai tessuti umani sono state autorizzate ad aderire al C1q legato alla matrice extracellulare, in questo caso acido ialuronico.
Per la procedura di rivestimento il primo passo è il legame dell'acido ialuronico ad alto peso molecolare a 96 micropiacche rivestite di tessuto. Per il rivestimento, l'acido ialuronico viene diluito in tampone di carbonio PH 9,6 da 0,1 mole ad una concentrazione di 15 microgrammi per millilitro. E la pipettazione delicata viene corrisposta per ottenere una soluzione omogenea.
Per rivestire i pozzi vengono utilizzati 100 microlitri della soluzione. La piastra viene quindi trasferita a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno dopo il vuoto aspira i pozzi trattati.
Lavare una volta con dPBS. Aggiungere C1q o BSA nei pozzi corrispondenti. C1q è oggi disponibile in commercio con una concentrazione di un milligrammo per millilitro e viene diluito ad una concentrazione di 25 microgrammi per millilitro.
E dPBS contenente 0,5%BSA e 0,7 millimoli calcio e magnesio e formazioni divalenti. BSA LPS free viene utilizzato alla concentrazione dello 0,5% e data PBF. La piastra viene quindi trasferita a quattro gradi Celsius durante la notte.
Le interazioni dipendenti dalla dose di C1q con acido ialuronico immobilizzato sono determinate dall'immuno SA collegato all'enzima. Etichettatura delle celle con DiI veloce. Il dii veloce tracciante lipofilo viene utilizzato per etichettare le cellule di interesse. Le cellule resuspended in dPBS vengono utilizzate alla concentrazione di un milione di cellule per millilitro.
Fast DiI viene diluito da uno a 100 direttamente nella sospensione cellulare. La sospensione cellulare viene mescolata manualmente e trasferita a 37 gradi Celsius per 15 minuti. Dopo cinque minuti di incubazione, mescolare la sospensione cellulare e ripetere questa operazione altre due volte.
Per rimuovere l'eccesso di DiI veloce, aggiungere 10 millilitri di dPBS. Ruotare delicatamente su e giù e centrifugare a 250 g per sette minuti. Resuspend il pellet cellulare in un millilitro di mezzo endofilo umano privo di siero in presenza di 0,1%BSA.
Adesione delle cellule sulle matrici di acido ialuronico C1q. Il vuoto aspira il dPBS dai pozzi rivestiti. Distribuire 100 microlitri di sospensione cellulare etichettata ai pozzi rivestiti.
200 microlitri di celle etichettate sono smontati in un tubo di ependure da utilizzare per la generazione di curve standard. Incubare il piatto per 35 minuti a 37 gradi Celsius. Estraete il piatto dall'incubatrice.
Aspirare delicatamente le cellule sbilanciate. Lavare una volta con dPBS contenente 0,5%BSA e 0,7 millimoli calcio e magnesio. Lys le cellule aderenti aggiungendo 200 microlitri di tampone di lysis.
Allo stesso tempo preparare la curva standard su una o due diluizioni seriali delle celle etichettate nel tampone dilisi. Eseguire la lettura del segnale di florescence a uno strumento infinito F 200 T-can usando 544 nanometri come lunghezza d'onda di eccitazione e 590 nanometri come lunghezza d'onda di emissione. Risultati rappresentativi.
Come dimostrato dai risultati rappresentativi, è evidente che l'adesione cellulare all'acido ialuronico ha trovato C1q come fortemente migliorato rispetto al solo HA o al BSA legato all'HA. La percentuale di celle aderenti su ogni matrice viene calcolata sulla base della curva standard. Conclusioni. Nei nostri esperimenti abbiamo prima di tutto valutato la capacità del componente del complemento C12 di legare la matrice extracellulare in questo caso acido ialuronico usando un metallo arisale.
In secondo luogo abbiamo analizzato la capacità delle cellule primarie umane macchiate di colorante fluorescente di inseguire l'acido ialuronico legato. Il modello che abbiamo proposto in questo studio è un metodo più facile, più veloce ed economico in alternativa al modello 3D di impalcature a matrice extracellulare per la valutazione su questa risposta cellulare a una combinazione di stimoli.
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Panoramica
Questo studio esplora l'interazione tra la componente del complemento C1q e l'acido ialuronico, concentrandosi su come questa interazione influenza l'adesione cellulare. C1q, una molecola pro-infiammatoria, è significativamente espresso negli ambienti microambientali del tumore e della placenta.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia cellulare
- Immunologia
Sfondo
- C1q è parte del sistema immunitario innato.
- È altamente espresso in specifici ambienti microambientali dei tessuti.
- C1q interagisce con componenti della matrice extracellulare.
- L'acido ialuronico è un componente chiave della matrice extracellulare.
Obiettivo dello studio
- Valutare il ruolo di C1q nell'adesione cellulare.
- Investigare come C1q legato all'acido ialuronico influenzi il comportamento cellulare.
- Sviluppare un metodo per studiare le interazioni proteiche nell'ambiente extracellulare.
Metodi utilizzati
- Sono state utilizzate cellule binarie derivate da tessuti umani.
- Alle cellule è stato permesso di aderire a C1q legato all'acido ialuronico.
- È stata stabilita una procedura completa per la valutazione.
- Le funzioni biologiche delle proteine sono state valutate nel contesto della matrice extracellulare.
Risultati principali
- L'interazione tra C1q e acido ialuronico promuove l'adesione cellulare.
- Le cellule rispondono alla presenza di C1q nella matrice extracellulare.
- Questo metodo fornisce informazioni sulle proprietà di divisione cellulare influenzate da fattori extracellulari.
- I risultati potrebbero avere implicazioni per la comprensione delle risposte immunitarie negli ambienti tissutali.
Conclusioni
- C1q svolge un ruolo significativo nell'adesione cellulare attraverso la sua interazione con l'acido ialuronico.
- Il metodo sviluppato può essere applicato per studiare ulteriormente le interazioni proteiche.
- Comprendere queste interazioni può migliorare la conoscenza delle funzioni del sistema immunitario in vari tessuti.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Understanding how complement protein C1q modulates extracellular matrix components like hyaluronic acid provides mechanistic insight into tumor-stroma interactions that drive adhesion-mediated progression. This assay enables early de-risking of targets involved in microenvironmental remodeling by quantifying how immune-derived signals alter matrix-dependent cell behavior. The method supports target validation in immuno-oncology by linking innate immune effectors to functional extracellular matrix changes relevant to metastatic competence.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates how C1q binding to hyaluronic acid alters matrix properties to influence tumor cell adhesion, supporting functional target validation of microenvironmental mediators.
- Operational Value: Enables hypothesis testing of complement-driven matrix remodeling in a controlled, reproducible format using primary human tumor-derived cells.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence-based readouts of cell adhesion to C1q-HA matrices, enabling dose-response analysis of protein-matrix interactions.
- Operational Value: Uses a standardized 96-well coating protocol with defined concentrations of HA (15 µg/mL) and C1q (25 µg/mL) to ensure assay reproducibility across screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Models how tumor-expressed C1q reshapes HA-mediated adhesion, offering a disease-relevant system to study stromal activation in neoplasia.
- Operational Value: Bridges discovery and preclinical work by providing a scalable method to evaluate matrix-targeted interventions using clinically relevant human cell inputs.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target engagement to phenotypic screening, where matrix-dependent adhesion serves as a functional readout of pathway modulation in the tumor microenvironment.
- Discovery Biology: Supports mechanistic de-risking by testing whether C1q-HA interaction drives pro-adhesive phenotypes in primary human tumor cells.
- Screening: Delivers standardized, quantitative adhesion outputs compatible with medium-throughput evaluation of modulators of protein-matrix binding.
- Analytics: Fluorescence signal quantification via standard curve enables precise comparison of adhesion conditions across HA, C1q-HA, and BSA-HA matrices.
- Translational Research: Uses human tumor-derived cells and physiologically relevant matrix components to enhance translational confidence in microenvironmental targeting strategies.
- Enterprise Reuse: Platform can be adapted to study other extracellular matrix proteins and immune mediators beyond C1q and HA, supporting cross-project standardization.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in tumor-stroma communication by isolating the effect of C1q on HA-dependent adhesion.
- Operational Value: Defined coating and blocking steps (e.g., overnight 4°C incubation, dPBS washes) promote assay standardization and inter-lab reproducibility.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by quantifying how immune matrix interactions influence early tumorigenic behaviors like anchorage-dependent growth.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets involved in complement-matrix crosstalk based on functional adhesion outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in protein coating, cell culture, and fluorescence-based quantification techniques.
- Dependent on access to fluorescence microplate readers capable of excitation at 544 nm and emission at 590 nm for fast DiI detection.
- Necessitates standardization of cell labeling protocols (e.g., fast DiI dilution, incubation times) to ensure consistent signal across experiments.
- Adaptation to other matrix proteins may require optimization of coating buffers and incubation conditions to maintain protein functionality.
- Limitations include reliance on 2D adhesion models, which may not fully capture 3D stromal complexity observed in vivo.
