Name: Identificazione di Coding e classi di RNA Non codificanti espressa in suina sangue intero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-28T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Scopri un protocollo ottimizzato per l'isolamento di mRNA e ncRNA da sangue intero suino con riduzione della globina. Questo metodo facilita lo studio delle interazioni ospite-patogeno in genomica.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Quest'opera è stata sostenuta principalmente dalla da USDA catino AFRI 2013-67015-21236 e in parte da USDA catino AFRI 2015-67015-23216. Questo studio è stato sostenuto in parte da un appuntamento al agricole ricerca servizio ricerca partecipazione programma amministrato dall'Istituto Oak Ridge per scienza e formazione (ORISE) attraverso un accordo tra agenzie tra il dipartimento dell'energia ( DOE) e il dipartimento dell'agricoltura statunitense. ORISE è gestito da Oak Ridge Associated Università DOE contratto no. DE-AC05-06OR2310.
Vorremmo ringraziare il Dr. Kay Faaberg per i cloni infettivi HP-PRRSV, Dr. Susan Brockmeier per il suo aiuto con gli animali coinvolti nell'esperimento e Sue Ohlendorf per assistenza di segreteria in preparazione del manoscritto.

<ol><li>Finotello, F., Di Camillo, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+differential+gene+expression+with+RNA-seq%3A+challenges+and+strategies+for+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Briefings+in+Functional+Genomics%22%5BJournal%5D)">Measuring differential gene expression with RNA-seq: challenges and strategies for data analysis.</a> Briefings in Functional Genomics. 14 (2), 130-142 (2015).</li>
<li>Coble, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-seq+analysis+of+broiler+liver+transcriptome+reveals+novel+responses+to+high+ambient+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">RNA-seq analysis of broiler liver transcriptome reveals novel responses to high ambient temperature.</a> BMC Genomics. 15, 1084(2014).</li>
<li>Koltes, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+putative+quantitative+trait+nucleotide+in+guanylate+binding+protein+5+for+host+response+to+PRRS+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Identification of a putative quantitative trait nucleotide in guanylate binding protein 5 for host response to PRRS virus infection.</a> BMC Genomics. 16, 412(2015).</li>
<li>Miller, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+signature+genes+in+PRRSV-infected+porcine+monocyte-derived+cells+to+different+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of signature genes in PRRSV-infected porcine monocyte-derived cells to different stimuli.</a> PLoS One. 12 (7), 0181256(2017).</li>
<li>Head, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Library+construction+for+next-generation+sequencing%3A+overviews+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges.</a> Biotechniques. 56 (2), 61-64 (2014).</li>
<li>Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq%3A+a+revolutionary+tool+for+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics.</a> Nature reviews. Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).</li>
<li>Dominic, O. N., Heike, G., Martin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+RNA+Depletion+for+Efficient+Use+of+RNA-Seq+Capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Ribosomal RNA Depletion for Efficient Use of RNA-Seq Capacity.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 103 (1), 11-14 (2013).</li>
<li>Pollet, S. FR-AgEncode: a French pilot project to enrich the annotation of livestock genomes- RNA Extraction Protocol. , Available from: 
 <a target="_blank" href="ftp://ftp.faang.ebi.ac.uk/ftp/protocols/assays/INRA_SOP_RNA_extraction_20160504.pdf">ftp://ftp.faang.ebi.ac.uk/ftp/protocols/assays/INRA_SOP_RNA_extraction_20160504.pdf</a> (2015).</li>
<li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+small+non-coding+RNA+classes+expressed+in+swine+whole+blood+during+HP-PRRSV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Identification of small non-coding RNA classes expressed in swine whole blood during HP-PRRSV infection.</a> Virology. 517, 56-61 (2018).</li>
<li>Fleming, D. S., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small+non-coding+RNA+expression+status+in+animals+faced+with+highly+pathogenic+porcine+reproductive+and+respiratory+syndrome+virus+%28HP-PRRSV%29%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+World+Congress+on+Genetics+Applied+to+Livestock+Production%22%5BJournal%5D)">Small non-coding RNA expression status in animals faced with highly pathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus (HP-PRRSV).</a> Proceedings of the World Congress on Genetics Applied to Livestock Production. (11), Species - Porcine 2 (2018).</li>
<li>Bivens Nathan, J., Zhou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA-Seq+Library+Construction+Methods+for+Transcriptome+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Plant+Biology%22%5BJournal%5D)">RNA-Seq Library Construction Methods for Transcriptome Analysis.</a> Current Protocols in Plant Biology. 1 (1), 197-215 (2016).</li>
<li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+between+ribo-minus+RNA-sequencing+and+polyA-selected+RNA-sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">A comparison between ribo-minus RNA-sequencing and polyA-selected RNA-sequencing.</a> Genomics. 96 (5), 259-265 (2010).</li>
<li>Guo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAseq+by+Total+RNA+Library+Identifies+Additional+RNAs+Compared+to+Poly%28A%29+RNA+Library%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">RNAseq by Total RNA Library Identifies Additional RNAs Compared to Poly(A) RNA Library.</a> BioMed Research International. 2015, 9(2015).</li>
<li>Choi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+gene+discovery+and+coverage+using+RNA-seq+of+globin+RNA+reduced+porcine+blood+samples%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Increasing gene discovery and coverage using RNA-seq of globin RNA reduced porcine blood samples.</a> BMC Genomics. 15, 954(2014).</li>
<li>Wu, K., Miyada, G., Martin, J., Finkelstein, D. Globin reduction protocol: A method for processing whole blood RNA samples for improved array results. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://media.affymetrix.com:80/support/technical/technotes/blood2_technote.pdf">http://media.affymetrix.com:80/support/technical/technotes/blood2_technote.pdf</a> (2007).</li>
<li>TruSeq® Stranded Total RNA Sample Preparation Guide. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Illumina%22">Illumina</a>. , (2018).</li>
<li>New England Biolabs Inc. Protocol for use with NEBNext Multiplex Small RNA Library Prep Kit for Illumina (Index Primers 1-48) (E7560). , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg">https://www.neb.com/~/media/Catalog/All-Protocols/758F75A29CDE4D03954E1EF75E78EA3D/Content/manualE7560_Figure_1.jpg</a> (2018).</li>
<li>Shin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Variation+in+RNA-Seq+transcriptome+profiles+of+peripheral+whole+blood+from+healthy+individuals+with+and+without+globin+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Variation in RNA-Seq transcriptome profiles of peripheral whole blood from healthy individuals with and without globin depletion.</a> PLoS One. 9 (3), 91041(2014).</li>
<li>Costa, V., Angelini, C., De Feis, I., Ciccodicola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Uncovering+the+complexity+of+transcriptomes+with+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedicine+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Uncovering the complexity of transcriptomes with RNA-Seq.</a> Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2010, 853916(2010).</li>
<li>Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+microRNA--novel+RNAs+derived+from+small+non-coding+RNA+and+their+implication+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Letters%22%5BJournal%5D)">Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer.</a> Cancer Letters. 340 (2), 201-211 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Menzione di marchi o prodotti commerciali in questo articolo è solo scopo di fornire informazioni specifiche e non implica raccomandazione o approvazione da parte del dipartimento di agricoltura degli Stati Uniti. USDA è un fornitore di pari opportunità e il datore di lavoro.

Il primo passo fondamentale nel protocollo che rendeva ottimizzato inclusa la procedura di svuotamento della globina aggiunto, che ha permesso di ottenere letture di qualità da campioni di sangue intero. Una delle più grandi limitazioni sull'utilizzo di sangue intero in studi di sequenziamento sono il numero elevato di letture nel campione che mappa alle molecole della globina e ridurre le letture che potrebbero mappe ad altre molecole di interesse18. Pertanto, nell'ottimizzare il protocollo per i...

Sequenziamento di nuova generazione (NGS) è emerso come un potente strumento per lo studio dei cambiamenti che si verificano a livello genomico di organismi biologici. Preparazione del campione per i metodi di NGS può essere variata a seconda del microrganismo, tipo di tessuto, e soprattutto le domande i ricercatori sono desiderosi di indirizzo. Molti studi sono rivolti a NGS come mezzo per studiare le differenze nell'espressione genica tra gli Stati come individui sani e malati1,2,3,4. Il sequenziamento di prendere posto su una base di intero genoma e consente un ricercatore di catturare la maggior parte, se non tutte, le informazioni genomiche per un marcatore genetico particolare in un momento indicano.
I marcatori più comuni dell'espressione osservati sono il RNA messaggero (mRNA). Le procedure più usate per le librerie durante la preparazione per RNA-seq sono ottimizzate per il recupero di molecole di mRNA mediante l'utilizzo di una serie di purificazioni, frammentazioni e legature5,6. Tuttavia, la decisione su come un protocollo dev'essere eseguito si basa pesantemente sul tipo di campione e le domande circa il campione ha detto. Nella maggior parte dei casi viene estratto il RNA totale; Eppure, non tutte le molecole di RNA sono di interesse e in casi come gli studi di espressione di mRNA eccessivamente abbondanti specie di RNA, come RNA ribosomiale (rRNA) devono essere rimossi per aumentare il numero di trascrizioni rilevabili connesso con i mRNA. Il metodo più popolare e ampiamente utilizzato per rimuovere le molecole di rRNA abbondante è la riduzione delle trascrizioni di poliadenilazione RNA denominato polyA svuotamento7. Questo approccio funziona bene per l'analisi dell'espressione di mRNA come non influenza i trascritti di mRNA. Tuttavia, negli studi che sono interessati a RNA non codificante o virale, deplezione di polyA rimuove anche queste molecole.
Molti studi scelgono di concentrarsi sulla preparazione libreria sequenza di RNA per esaminare sia espressione di mRNA (codifica) o una particolare classe di grande o piccolo RNA non codificanti. Anche se ci sono altre procedure8 come la nostra che consentono la preparazione di campioni doppi, molti studi preparano librerie da campioni separati per studi separati quando disponibile. Per uno studio come il nostro, ciò richiederebbe normalmente più campioni di sangue, aumentando il tempo, materiali di consumo e lo stress degli animali. L'obiettivo del nostro studio è stato quello di essere in grado di utilizzare sangue intero da animali per identificare e quantificare le diverse classi di entrambi mRNA e RNA non codificanti espressi tra sano e patogenicità suina virus riproduttivo e respiratorio sindrome (HP-PRRSV) ha sfidato suini9,10 pur avendo solo un campione di sangue intero singolo (2,5 mL) da ogni suino. Per fare questo, abbiamo bisogno di ottimizzare l'estrazione tipica e protocolli di creazione di librerie per generare i dati appropriati per consentire analisi di mRNA e di non-codificanti RNA (ncRNA) espressione11 da un singolo campione.
Ciò ha richiamato la necessità di un protocollo che ha permesso per mRNA e analisi di RNA non codificante perché il kit standard disponibili e metodi per la creazione di estrazione del RNA e la biblioteca sono stati destinati principalmente al mRNA e utilizzano una deplezione di poly-A passaggio12. Questo passaggio avrebbe reso impossibile il recupero di RNA non codificante o trascrizioni virali dal campione. Di conseguenza, era necessario un metodo ottimizzato che ha permesso per estrazione di RNA totale senza svuotamento polyA campione. Il metodo presentato in questo manoscritto è stato ottimizzato per consentire l'uso di sangue intero come tipo di campione e di costruire librerie di sequenziamento per sia mRNA che ncRNAs di piccole e grandi dimensioni. Il metodo è stato ottimizzato per consentire l'analisi di RNA non codificanti rilevabili tutti così come mantenere il RNA virale per successive indagini13. In tutto, il nostro protocollo di preparazione libreria ottimizzata consente per l'indagine di più molecole di RNA da un campione di sangue intero singolo.
L'obiettivo generale dietro l'uso di questo metodo era quello di sviluppare un processo che ha permesso per la raccolta di non-codificanti RNA sia mRNA da un campione di sangue intero. Questo ci permette di avere mRNA, ncRNA e RNA virale per ogni animale nel nostro studio provengono da un singolo campione9. Questo, in definitiva, consente più scientifico scoperta senza costi aggiuntivi di animale e dà un quadro più completo dell'espressione di ogni singolo campione. Il metodo descritto consente per l'esame dei regolatori dell'espressione genica, nonché a consentire per il completamento degli studi correlativi confrontando entrambi mRNA e l'espressione di RNA non codificanti utilizzando un campione di sangue intero singolo. Il nostro studio ha utilizzato questo protocollo per esaminare i cambiamenti nell'espressione genica e possibili regolatori epigenetici in viralmente infettato 9 - settimana-vecchi maschi maiali commerciali.

<table><tbody><tr><td>Provette PAXgene</td><td>PreAnalytix</td><td>762165</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di Biologia Molecolare</td><td>ThermoFisher</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>mirVana miRNA Kit di isolamento</td><td>ThermoFisher</td><td>AM1560</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy MinElute Clean Up Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>100% Etanolo</td><td>Decon Labs, Inc.</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Provette a parete sottile da 0,2 mL</td><td>ThermoFisher</td><td>98010540</td><td></td></tr><tr><td>Provette prive di RNasi/DNasi da 1,5 mL</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti Termociclatore a 96 pozzetti</td><td>ThermoFisher</td><td>4375786R</td><td></td></tr><tr><td>Riduzione della globina Oligo (&alpha; 1)</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td>Sequenza GAT CTC CGA GGC TCC AGC TTA ACG GT</td></tr><tr><td>Riduzione della globina Oligo (&alpha; 2)</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td>Sequenza TCA ACG ATC AGG AGG TCA GGG TGC AA</td></tr><tr><td>Riduzione della globina Oligo (&beta; 1)</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td>Sequenza AGG GGA ACT TAG TGG TAC TTG TGG</td></tr><tr><td>GT Riduzione della globina Oligo (&beta; 2)</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td>Sequenza GGT TCA GAG GAA AAA GGG CTC CTC CT</td></tr><tr><td>10X Oligo Ibridazione</td> Tampone-Tris-HCl<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, pH 7.6</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1757-100-KCl</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Millipore Sigma</td><td>60142-100ML-F</td><td></td></tr><tr><td>10X RNasi H Tampone</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-Tris-HCl, pH 7.6</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1757-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-DTT</td><td>ThermoFisher</td><td>Y00147</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-MgCl2</td><td>Promega</td><td>A351B</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;-Acqua di Biologia Molecolare</td><td>ThermoFisher</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>RNasi H</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2292</td><td></td></tr><tr><td>SUPERase-IN</td><td>ThermoFisher</td><td>AM2694</td><td>Inibitore della RNASI</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 2100 Strumento BioAnalyzer per elettroforesi</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2938C</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent DNA ad alta sensibilità&nbsp; Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Kit di preparazione della libreria di RNA totale a filamenti TruSeq con Ribo-Zero&nbsp;</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2201</td><td>Kit di mRNA; Set umano/topo/ratto A&nbsp; (48 campioni, 12 indici)</td></tr><tr><td>Guida alla preparazione del campione di RNA totale a filamento TruSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td>Disponibile on-line</td></tr><tr><td>RNAClean XP Beads</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A63987</td><td></td></tr><tr><td>AMPure XP Beads</td><td>BeckmanCoulter</td><td>A63880</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Striscia ottica a 8 provette</td><td>ThermoFisher</td><td>N8010580</td><td>provette a parete sottile da 0,2 ml</td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 8-tube Strip Cap</td><td>ThermoFisher</td><td>N801-0535</td><td></td></tr><tr><td>RNasi/DNasi - serbatoi di reagenti liberi Qualsiasi</td><td>fornitore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trascrittasi inversa SuperScript II</td><td>ThermoFisher</td><td>18064-014</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Piastre ottiche a 96 pozzetti</td><td>ThermoFisher</td><td>N8010560</td><td>Questi sono stati utilizzati al posto delle piastre da 3 ml secondo necessità</td></tr><tr><td>Pellicola adesiva ottica MicroAmp</td><td>ThermoFisher</td><td>4311971</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Set di preparazione della libreria di piccoli RNA per Illumina (Set 1)&nbsp;</td>Kit di <td>piccoli RNA</td> <td>New England Biolabs</td><td>E73005</td></tr><tr><td>Set di preparazione della libreria di piccoli RNA multiplex NEBNext per Illumina (Set 2)&nbsp;</td><td>Kit per piccoli RNA New England Biolabs</td><td>E75805</td><td></td></tr><tr><td>Kit di purificazione PCR QIAQuick QIAGEN</td><td></td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>96S Piastra super magnetica</td><td>ALPAQUA</td><td>A001322</td><td></td></tr></tbody></table>

identificazione di coding e classi di rna non codificanti espressa in suina sangue intero

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

L'avvento di sempre più potenti e innovative tecniche di sequenziamento di generazione successiva ha aperto nuove strade nella capacità di esaminare l'espressione genica sottostanti relazionato ai processi biologici di interesse. Queste innovazioni non solo permettono ai ricercatori di osservare l'espressione delle sequenze di mRNA che codificano per geni che funzione cellulare di effetto, ma le molecole di RNA (ncRNA) non codificanti che rimangono non tradotte, ma ancora hanno anche funzioni di regolamentazione. Anche se i ricercatori hanno la possibilità di osservare l'espressione di mRNA e di ncRNA, era consuetudine per uno studio di concentrarsi su uno o l'altro. Tuttavia, quando gli studi sono interessati nell'espressione di mRNA e di ncRNA, molte volte usano campioni separati per esaminare o codifica o non-codificazione RNAs a causa della differenza nelle preparazioni di biblioteca. Questo può portare alla necessità di più campioni che può aumentare il tempo, materiali di consumo e lo stress degli animali. Inoltre, può causare i ricercatori a decidere di preparare i campioni per sola analisi, solitamente il mRNA, limitando il numero di domande biologiche che possono essere studiate. Tuttavia, ncRNAs estendersi su più classi con ruoli regolatori che espressione di mRNA di effetto. Perché ncRNA sono importanti per i processi biologici fondamentali e disordine di questi processi in durante l'infezione, possono, pertanto, fare obiettivi attraenti per terapeutica. Questo manoscritto viene illustrato un protocollo modificato per la generazione mRNA e non codificanti RNA librerie di espressione, tra cui RNA virale, da un singolo campione di sangue intero. Ottimizzazione del presente protocollo, migliorato purezza RNA, aumentata di legatura per recupero di RNAs metilato e omesso selezione di dimensioni, per consentire la cattura di altre specie di RNA.

I campioni rappresentativi nel nostro studio sono la globina e campioni di sangue intero di ribo-vuotati. Il risultato rappresentativo del protocollo è costituito da un esempio di libreria impoverito della globina con un numero di integrità di RNA (RIN) sopra 7 (Figura 1a) e rapporti di concentrazione di 260/280 nm pari o superiore a 2 (Figura 1b e c 1). Convalida dei risultati del campione è sta...

Qui, presentiamo un protocollo ottimizzato per l'elaborazione di codifica (mRNA) e non codificanti (ncRNA) globina ridotta RNA-seq librerie da un campione di sangue intero singolo.

Identificazione di Coding e classi di RNA Non codificanti espressa in suina sangue intero

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave nello studio delle interazioni ospite-patogeno consentendo l'esame dell'espressione codificante, non codificante e dell'RNA virale coinvolta nella risposta dell'amminoacido ospite e di come un agente patogeno può influenzare le funzioni biologiche dell'ospite. Il principale vantaggio di questa tecnica è che presenta un protocollo ottimizzato per l'elaborazione di mRNA e RNA non codificante da librerie RNAseq ridotte di globina da un singolo campione di sangue intero. A dimostrare la tecnica sarà Sarah Anderson, una tecnico del mio laboratorio.Inizia centrifugando le provette del sangue a 50 20 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente. Lavorando in un armadietto di sicurezza biologico, dopo aver rimosso il supernatante, aggiungere otto millilitri di acqua priva di RNasi al pellet. Chiudere i tubi e vortice il pellet fino a quando non viene visibilmente sciolto, quindi centrifugare i tubi a 50 20 volte G per 10 minuti a temperatura ambiente per recuperare il pellet.Lavorando in un armadietto di sicurezza biologico, scartare il supernatante e salvare il pellet. Per isolare l'RNA totale, iniziare pipettando 300 microlitri di tampone legante di lisi al pellet. Dopo il vortice, trasferire la miscela da ogni tubo a un nuovo tubo di centrifuga da 1,5 millilitri etichettato.Aggiungere 30 microlitri di additivo omogeneizzato dal kit di isolamento miRNA. Vortice i tubi e posizionare sul ghiaccio per 10 minuti. Lavorando in una cappa aspirante, rimuovere i tubi dal ghiaccio e aggiungere 300 microlitri del reagente cloroformio fenolo acido dal kit e dal vortice per mescolare di nuovo.Dopo aver centrifugato a 10.000 volte G per cinque minuti a temperatura ambiente, rimuovere con cura la fase acquosa in un nuovo tubo. In base alla quantità di recupero acquoso rispetto al passaggio precedente, aggiungere 1,25 volte il volume di etanolo al 100% al fago acquoso in ogni tubo e pipetta da mescolare. Preparare tubi di raccolta freschi contenenti una cartuccia filtrante per ogni campione.Pipetta circa 675 microlitri della miscela lysate-etanolo sulla cartuccia del filtro. Centrifugare brevemente a 10.000 volte G per passare il liquido attraverso il filtro. Scartare il flusso.Ripetere la miscela lysate-etanolo aggiungendo al filtro e alla centrifugazione fino a quando non è stata completamente utilizzata. Aggiungere 700 microlitri di soluzione di lavaggio uno dal kit alla cartuccia filtrante. Centrifugare brevemente per tirare la soluzione attraverso i filtri.Scartare il flusso e conservare le stesse cartucce filtranti e i tubi di raccolta. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di lavaggio due-tre a ciascuna cartuccia filtrante. Dopo aver centrifugato di nuovo, scartare il flusso e ripetere il passaggio di lavaggio.Per rimuovere qualsiasi liquido residuo dalle cartucce filtranti, ruotarle di altri 60 secondi. Trasferire le cartucce in tubi di raccolta freschi. Aggiungere 100 microlitri di acqua preriscaldata senza nucleasi di 95 gradi Celsius al centro di ogni cartuccia filtrante.Centrifugare le cartucce per circa 20-30 secondi alla centrifuga da tavolo alla massima velocità. Per preformare l'ibridazione con oligo di riduzione della globina, prima denaturare l'RNA aggiungendo ogni campione estratto in un tubo di reazione senza nucleasi a parete sottile da 0,2 millilitri. Posizionare i tubi in un ciclore termico a 70 gradi Celsius per due minuti.Successivamente, posizionare immediatamente i tubi sul ghiaccio per ottenere una qualità ottimale dell'RNA. Mentre i tubi si stanno raffreddando, preparare 400 microlitri di miscela di oligo di riduzione della globina 10X e tampone di ibridazione oligo 10X in un tubo a due millilitri. Per rendere la miscela di ibridazione, aggiungere sei microgrammi di campione di RNA, due microlitri della miscela di oligo di riduzione della globina 10X, un microlitro di tampone di ibridazione oligo 10X e acqua priva di nucleasi a un volume finale di 10 microlitri per ogni tubo di reazione a parete sottile a parete sottile da 0,2 millilitri.Posizionare i tubi nel ciclore termico a 70 gradi Celsius per due minuti. Successivamente, posizionare immediatamente i tubi sul ghiaccio. Per eseguire la digestione RNasi H, diluire prima la RNasi H 10X in una X RNasi H con un tampone X RNasi H.Preparare la miscela di reazione RNasi H combinando due microlitri di tampone di RNasi 10X, un microlitro di inibitore della RNasi e due microlitri di una X RNasi H e cinque microlitri di acqua priva di nucleasi per un volume totale di 10 microlitri. Aggiungere 10 microlitri della miscela di reazione RNasi H ai campioni di ibridazione di riduzione della globina e mescolare accuratamente. Digerire questa reazione a 37 gradi Celsius per 10 minuti e quindi raffreddare a quattro gradi Celsius.Interrompere la digestione aggiungendo un microlitro di EDTA molare 0,5 al tubo e trasferire l'intero contenuto del tubo in un tubo fresco da 1,5 millilitri. Subito dopo, aggiungere 80 microlitri di acqua priva di RNasi, 350 microlitri di tampone di lisi, quindi 250 microlitri di etanolo al 100% a ciascun tubo e mescolare bene mediante pipettazione. Trasferire ogni campione da 700 microlitri in una cartuccia di filtro di eluizione separata posta in un tubo di raccolta a due millilitri per raccogliere il flusso.Centrifugare per 15 secondi a 8.000 volte G o superiore e quindi scartare il flusso. Posizionare le stesse cartucce filtranti di eluizione in nuovi tubi di raccolta a due millilitri. Per lavare le membrane della cartuccia del filtro, aggiungere 500 microlitri del tampone di lavaggio delicato alle cartucce filtranti e centrifugare per 15 secondi a 8.000 volte G o superiore.Scartare il flusso. Quindi, utilizzando gli stessi tubi di raccolta, aggiungere 500 microlitri di 80%etanolo alle cartucce filtranti. Centrifuga per due minuti a 8.000 volte G e superiore.Scartare entrambi i tubi flow-through e collection e salvare le colonne di rotazione dell'eluizione. Posizionare ogni colonna di rotazione dell'eluizione in un nuovo tubo di raccolta da due millilitri. Centrifuga a tutta velocità per cinque minuti con il coperchio aperto sulle cartucce filtranti per asciugare le membrane della colonna di rotazione e prevenire il riporto dell'etanolo.Dopo aver scartato i tubi di raccolta, posizionare ogni cartuccia di filtro essiccata in un nuovo tubo di raccolta da 1,5 millilitri. Aggiungere 14 microlitri di acqua priva di RNasi direttamente al centro della membrana della cartuccia filtrante. Per elutare l'RNA, centrifugare i tubi per 60 secondi a tutta velocità e quindi continuare con ulteriori valutazione e preparazione dell'RNA.Il campione impoverito di globina può ora essere diviso e utilizzato per preparare le piccole librerie di RNA non codificanti, così come l'mRNA impoverito di ribo e le lunghe librerie di RNA non codificanti. Dopo aver preparato le librerie di espressioni dei campioni di sangue intero impoveriti di globina e ribo-impoveriti utilizzando questo protocollo, il riepilogo dell'esecuzione del file di elettroforesi ha mostrato un campione di libreria impoverito di globina con numeri di integrità dell'RNA che variava da 6,3 a 9,2. Questo si dimostrò un miglioramento rispetto ad altri studi che usavano metodi di esaurimento della globina e erano in grado di ottenere numeri RIN solo a sei o quasi.La riduzione della pre-globina e la post-globina di un singolo campione di sangue intero suino hanno mostrato che i rapporti di concentrazione da 260 a 280 nanometri sono o superiori a due. Utilizzando questo protocollo, sono stati ottenuti elettroferogrammi a base di chip di campioni di libreria di mRNA di sangue intero impoveriti di globina e ribo prima della messa in comune e del sequenziamento. Per le librerie di mRNA, l'elettroferogramma rappresentativo ha un picco di circa 280 coppie di basi.Per i piccoli ncRNA gli elettroferogrammi rappresentativi basati su chip contengono un intervallo di picchi da circa 100 a 400 coppie di basi. I picchi a circa 143 coppie di basi corrispondono ai miRNA, e i picchi a circa 153 coppie di basi corrispondono ai piRNA. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare ai tubi di ghiaccio immediatamente dove indicato.Seguendo questa procedura, altri metodi come il sequenziamento di nuova generazione dovrebbero essere eseguiti al fine di rispondere a domande aggiuntive come l'espressione differenziale, i cambiamenti epigenetici e il loro effetto sulle vie e sui processi biologici. Non dimenticare che lavorare con il reagente fenolo-cloroformio è estremamente pericoloso e devono essere prese precauzioni come lavorare in una cappa aspirante. Inoltre, quando si maneggiano sangue intero o organismi infettivi, il lavoro deve essere eseguito in un armadietto di sicurezza biologico prima di un'attivazione dell'organismo infettivo.

identification-coding-non-coding-rna-classes-expressed-swine-whole

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

RNA-sequenziamento e bioinformatica analisi sono stati utilizzati per identificare i fattori di trascrizione espressi in maniera significativa e differenziale in Lin-CD34 + e CD34- Lin-sottopopolazioni di EMLcells mouse. Questi fattori di trascrizione potrebbero svolgere un ruolo importante nel determinare lo switch tra le cellule Lin-CD34- auto-rinnovamento Lin-CD34 + e parzialmente differenziato.

Identificazione dei fattori chiave di regolazione auto-rinnovamento e differenziazione in cellule ematopoietiche precursori EML da Analysis RNA-sequencing

La capacità delle cellule di adattarsi allo stress è fondamentale per la loro sopravvivenza. La regolazione della traduzione dell'mRNA è una di queste strategie di adattamento, che prevede una rapida regolazione del proteoma. Qui, forniamo un protocollo standardizzato di profilazione dei polisomi per identificare mRNA specifici che vengono tradotti selettivamente in condizioni di stress.

Valutazione della Selective mRNA Traduzione in cellule di mammifero per polisoma Profiling

I fattori epigenetici possono interagire con programmi genetici di modulare l'espressione genica e regolare la funzione delle cellule B. Combinando la stimolazione in vitro delle cellule di B, qRT-PCR e microRNA-sequenza di alto-rendimento e sequenza di mRNA approcci, possiamo analizzare la modulazione epigenetica di miRNA e l'espressione genica in cellule di B.

Modulazione da analisi di inibitore HDAC genoma di microRNA e mRNAs in B le cellule indotte a sottoporsi switch classe DNA ricombinazione e differenziazione delle cellule di Plasma

Qui presentiamo un protocollo di cattura di interazione applicato ai protoplasti a foglia di Arabidopsis thaliana . Questo metodo si basa fondamentalmente sulla creazione di reticolazione UV in vivo e consente l'isolamento e l'identificazione delle proteine ​​legate alla mRNA da un ambiente fisiologico.

Cattura di Interactome mRNA da protoplasti vegetali

Il sequenziamento di nanopore è una nuova tecnologia che consente un sequenziamento conveniente in posizioni remote e impostazioni di scarsa risorse. Qui, presentiamo un protocollo per il sequenziamento di mRNA da sangue intero che è compatibile con tali condizioni.

Sequenziamento dell'mRNA da sangue intero utilizzando il sequenziamento di NanoPore

Qui, descriviamo l'immunoprecipitazioni dei ribosomi e dell'RNA associato da popolazioni selezionate di cellule germinali maschili adulte utilizzando il sistema RiboTag. L'allevamento strategico e un'attenta immunoprecipitazioni si traducono in risultati puliti e riproducibili che informano sul translatoma delle cellule germinali e forniscono informazioni sui meccanismi dei fenotipi mutanti.

Immunoprecipitazioni RiboTag nelle cellule germinali del topo maschio

Questo protocollo descrive come generare un profilo polisomico senza utilizzare generatori di gradienti automatizzati o sistemi di frazionamento del gradiente.

Profilazione dei polisomi senza generatori di gradienti o sistemi di frazionamento

Le interazioni co-traslazionali svolgono un ruolo cruciale nelle modifiche della catena nascente, nel targeting, nella piegatura e nei percorsi di assemblaggio. Qui, descriviamo il Selective Ribosome Profiling, un metodo per l'analisi diretta in vivo di queste interazioni nel modello eucariota Saccharomyces cerevisiae.

Identificazione globale delle reti di interazione co-traslazionale mediante profilazione selettiva dei ribosomi

La traduzione dei ribosomi decodifica tre nucleotidi per codone in peptidi. Il loro movimento lungo l'mRNA, catturato dalla profilazione dei ribosomi, produce le impronte che mostrano la periodicità caratteristica della tripletta. Questo protocollo descrive come utilizzare RiboCode per decifrare questa caratteristica prominente dai dati di profilazione dei ribosomi per identificare i frame di lettura aperti tradotti attivamente a livello di trascrittoma intero.

De novo Identificazione di frame di lettura aperti tradotti attivamente con dati di profilazione dei ribosomi

Il sequenziamento dell'RNA a quantificazione assoluta (AQRNA-seq) è una tecnologia sviluppata per quantificare il panorama di tutti i piccoli RNA nelle miscele biologiche. Qui, vengono dimostrate sia le fasi di preparazione della libreria che quelle di elaborazione dei dati di AQRNA-seq, quantificando i cambiamenti nel pool di RNA di trasferimento (tRNA) in Mycobacterium bovis BCG durante la dormienza indotta dalla fame.

AQRNA-seq per la quantificazione di piccoli RNA

Scopri un protocollo ottimizzato per l'isolamento di mRNA e ncRNA da sangue intero suino con riduzione della globina. Questo metodo facilita lo studio delle interazioni ospite-patogeno in genomica.

Identificazione di Coding e classi di RNA Non codificanti espressa in suina sangue intero

Esplora altri video