Sequenziamento di RNA unicellulare di neuroni di topo fluorescente contrassegnati con cernita manuale e doppia trascrizione In Vitro con conteggi assoluti sequenziamento (DIVA-Seq)

Questo metodo può aiutare a risolvere un ostacolo chiave nel campo dell'isolamento e del sequenziamento dei singoli neuroni. Come la raccolta di una popolazione specifica o una sottopopolazione di neuroni etichettati fluorescentmente dall'area cerebrale definita dall'utente. Il vantaggio principale di questa tecnica è che assicura che il singolo neurone di interesse sia catturato senza contaminare i detriti.

È anche relativamente delicato, il che è importante per i tipi di neuroni fragili che muoiono rapidamente quando sottoposti alle pressioni fluide dello smistamento FACS convenzionale. Iniziare preparando microcapillari di vetro tirato con un diametro di uscita da 10 a 15 micron utilizzando un estrattore capillare. Utilizzare forbici fini per tagliare la punta del capillare per ottenere il diametro della scheda desiderato.

Quindi utilizzare i connettori di tubo per collegare una lunghezza da 120 a 150 centimetri di tubi flessibili in silicone con un diametro interno di 0,8 millimetri a un filtro siringa a membrana PVDF da 0,2 micron e una valvola di tubi a due vie. Preparare 500 millilitri di liquido spinale cerebrale artificiale refrigerato o ACSF e ossigenare gorgogliando ossigeno bilanciato al 5% di anidride carbonica attraverso un Airstone per 15 minuti o fino a quando la soluzione non si sgombrato completamente. Preparare tre becher da 150 millilitri ciascuno contenente 100 millilitri di ACSF.

A uno, aggiungi un cocktail di blocchi di attività. A un altro, aggiungere la frazione di Streptococcus per la proteasi a una concentrazione finale di un milligrammo per millilitro. Al becher finale, aggiungere FBS a una concentrazione finale dell'1% e ossigenare con ossigeno bilanciato con anidride carbonica al 5% attraverso un Airstone.

Infine, realizzare tre pipette Pasteur a gambo lungo con diametri di uscita decrescenti rotolandoli su una fiamma aperta. Sezionare il cervello da un topo eutanasiato aprendo il cranio con una piccola forbice ed estraendo il cervello fresco usando forcep fini senza danneggiare la corteccia. Posizionare il cervello in ACSF refrigerato e ossigenato lasciando un Airstone attaccato all'ossigeno bilanciato con anidride carbonica al 5% per l'intera durata del sezionamento.

Posizionare il cervello sul mandrino del vibratomo e tagliare le sezioni coronali o sagittali a 300 micron di spessore. Raccogli tutte le sezioni necessarie per ottenere un minimo di 10-50 celle etichettate. Mettere le fette su un porta fette con rete di cotone posto all'interno di un becher in modo che siano bagnate in ACSF ossigenato.

Spostare le fette nel becher contenente ACSF con bloccanti di attività e bloccare per 15-20 minuti a temperatura ambiente mentre si gorgoglia ossigeno utilizzando un Airstone. Spostare le fette sul becher contenente ACSF con la soluzione di proteasi per eseguire una digestione lieve a temperatura ambiente. Dopo la digestione, lavare la proteasi spostando le fette al becher contenente ACSF con soluzione di blocco dell'attività per cinque-10 minuti a temperatura ambiente.

Continua a gorgogliare ossigeno. Preparare quindi una piastra di Petri da 100 millimetri contenente ACSF con 1%FBS a temperatura ambiente e spostare singole sezioni nel disco per la microdisezione. Sotto un mirino di dissezioni fluorescenti, utilizzare una coppia di forcep fini per micro sezionare aree e strati di interesse con un minimo di 10-50 cellule.

Utilizzando una pipetta Pasteur, spostare i pezzi microsezionati su un tubo di microcentrifugo da 2 millilitri contenente circa 0,8 millilitri di 1%FBS in soluzione ACSF. Titolare il tessuto sezionato nel tubo di microfuoco a temperatura ambiente. Eseguire circa 10 tratti con ciascuna delle pipette Pasteur fiammate a partire dal più grande e terminando con il più piccolo diametro di uscita.

Erogare le cellule dissociate in una piastra di Petri di 100 millimetri contenente ACSF ossigenato e attendere da cinque a sette minuti affinché le cellule si sistemino gradualmente. Osservare il segnale GFP e RFP al microscopio a dissezione. Identificare i detriti esaminando la morfologia sotto illuminazione a campo luminoso.

Una volta identificata un'area di cellule con pochi detriti, utilizzare il capillare e attaccarlo ai tubi per raccogliere le celle bloccando l'estremità della valvola di tubo con la lingua. Quindi posizionare il capillare vicino alle cellule. Rilasciare il blocco sul capillare e bloccarlo rapidamente di nuovo per catturare la cellula utilizzando l'azione capillare.

Spostare il capillare su una piastra di Petri di 100 millimetri con ACSF fresco ossigenato e soffiare delicatamente nel tubo osservando la punta capillare sotto l'ottica a fluorescenza per erogare le cellule nel piatto. Ripetere la procedura di raccolta fino a quando non vengono raccolte da 100 a 150 celle assicurandosi che i contaminanti, come i detriti, siano minimi nelle ottiche a contrasto di interferenza differenziale a campo luminoso. Infine, utilizzando ogni volta una pipetta micro-capillare fresca, scegliere una singola cella ed espellerla in non più di 0,5 microlitri in un tubo di micro-fusione da 0,2 microlitri contenente un microlitro di tampone di raccolta campioni con primer.

Rompere la punta della pipetta nel tubo di micro-fusione per assicurarsi che la cella rimanga nel buffer di raccolta. Congelare le cellule mettendo i tubi sul ghiaccio secco. Conservare in un congelatore a meno 80 gradi Celsius fino all'elaborazione per l'amplificazione dell'RNA.

I neuroni GABAergici sono stati isolati dalla corteccia cingulet del cervello del topo. L'RNA amplificato dai neuroni ordinati manualmente variava tra 200 e 4.000 coppie di basi di dimensioni con una distribuzione di picco leggermente superiore a 500 coppie di basi. Dopo la purificazione delle perline, la libreria cDNA è ulteriormente limitata da un secondo ciclo di purificazione usando perline per eliminare frammenti inferiori a 200 coppie di basi e per il picco a circa 350 coppie di basi.

Il sequenziamento ha mostrato un 4,8 per 10 alla 5a mediana o 6,9 per 10 alla 5a lettura mappata media per cella. Dopo la rimozione dell'RNA duplicata usando gli UMI, ogni singola cella aveva una 1,0 per 10 alla 5a mediana o 1,4 volte 10 alla 5a lettura unica media per cella. In ogni consorzio di controlli dell'RNA esterno a singola cellula, il picco di RNA è stato usato come controllo interno per calcolare il numero assoluto di molecole aggiunte al campione.

C'era una relazione lineare tra input e conteggi osservati con una pendenza di 0,92 e un quadrato R regolato di 0,94. Una media di circa 10.000 geni per singolo neurone sono stati rilevati utilizzando questa procedura con oltre il 95% delle singole cellule che rilevano più di 6.000 geni. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai biologi molecolari per esplorare il trascritoma di distinti internauri corticali del topo ben caratterizzati e ha identificato alcune categorie geniche che sono responsabili della codifica dell'identità cellulare.