Name: Sequenziamento di RNA unicellulare di neuroni di topo fluorescente contrassegnati con cernita manuale e doppia trascrizione In Vitro con conteggi assoluti sequenziamento (DIVA-Seq) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Impara il sequenziamento di RNA unicellulare di neuroni fluorescenti del topo usando cernita manuale e trascrizione in vitro. Questo metodo consente l'isolamento delicato di sottopopolazioni neuronali specifiche con alta purezza.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal NIH (5R01MH094705-04 e R01MH109665-01 al Z.J.H.), dal fondo di neuroscienze CSHL Robertson (a Z.J.H.) e da un NARSAD induttrici nell'Unione fraterna (A.P.).

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<li>Klein, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Droplet+barcoding+for+single-cell+transcriptomics+applied+to+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells.</a> Cell. 161 (5), 1187-1201 (2015).</li>
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<li>Zeisel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+in+the+mouse+cortex+and+hippocampus+revealed+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cell types in the mouse cortex and hippocampus revealed by single-cell RNA-seq.</a> Science. 1934, (2015).</li>
<li>Tasic, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mouse+cortical+cell+taxonomy+revealed+by+single+cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adult mouse cortical cell taxonomy revealed by single cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19, 335-346 (2016).</li>
<li>Okaty, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-Scale+Molecular+Deconstruction+of+the+Serotonin+Neuron+System%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Multi-Scale Molecular Deconstruction of the Serotonin Neuron System.</a> Neuron. 88 (4), 774-791 (2015).</li>
<li>Poulin, J. F., Tasic, B., Hjerling-Leffler, J., Trimarchi, J. M., Awatramani, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disentangling+neural+cell+diversity+using+single-cell+transcriptomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Disentangling neural cell diversity using single-cell transcriptomics.</a> Nature Neuroscience. 19 (9), 1131-1141 (2016).</li>
<li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploiting+single-cell+expression+to+characterize+co-expression+replicability%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Exploiting single-cell expression to characterize co-expression replicability.</a> Genome Biology. 17, 101(2016).</li>
<li>Crow, M., Paul, A., Ballouz, S., Huang, Z. J., Gillis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+the+replicability+of+cell+types+defined+by+single+cell+RNA-sequencing+data+using+MetaNeighbor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Characterizing the replicability of cell types defined by single cell RNA-sequencing data using MetaNeighbor.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li>
<li>Hrvatin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+analysis+of+experience-dependent+transcriptomic+states+in+the+mouse+visual+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Single-cell analysis of experience-dependent transcriptomic states in the mouse visual cortex.</a> Nature Neuroscience. 21 (1), 120-129 (2018).</li>
</ol>

Autori dichiarano che non esistono Nessun concorrenti interessi finanziari.

Il manuale di protocollo di ordinamento è adatto per un supervisione sequenziamento di RNA del neurone popolazioni che sono sia scarsamente etichettati nel cervello di topi o rappresentano una popolazione di cellule rari che altrimenti non è fattibile per studiare mediante cella di alto-rendimento corrente metodi di ordinamento e di amplificazione. Cellule sottoposte a FACS solitamente subiscono pressioni di linea guaina e campione nella gamma di psi ~ 9 – 14, a seconda delle dimensioni dell'ugello e desiderato tassi di ...

Sequenziamento di singola cellula RNA (RNA-seq) ha trasformato la trascrittomica studi. Mentre su larga scala singola cellula RNAseq può essere eseguita utilizzando una varietà di tecniche, come le goccioline1,2, microfluidica3, nanogrids4e micropozzetti5, maggior parte dei metodi non possono ordinare tipi di cella definita che esprimono codificato geneticamente fluorofori. Per isolare una popolazione di selezionare la cella, fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) sono spesso usata con etichettate celle in una cella singola modalità di ordinamento. Tuttavia, FACS presenta alcune restrizioni e richiede fasi di lavorazione meticolosa del campione. In primo luogo, un gran numero di celle di input è in genere necessari (spesso parecchie milioni cellule / mL), con una frazione significativa (> 15 – 20%) contenente la popolazione con etichetta. In secondo luogo, preparazioni di cellule possono richiedere vari cicli di passaggi di centrifugazione su gradiente di densità rimuovere frazione glial, detriti e mucchi di cella che potrebbero altrimenti intasare l'ugello o flusso delle cellule. In terzo luogo, FACS impiega solitamente di colorazione e decolorazione passaggi per live/dead colorazione (ad esempio, 4 ′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), ioduro di propidio (PI) e coloranti Cytotracker), che prendere ulteriore tempo. In quarto luogo, come una regola empirica per ordinamento (ad esempio DAPI e proteina fluorescente verde/rosso (GFP/RFP)), di solito due campioni di due colori e un controllo sono necessari, che richiedono un campione senza etichetta per essere elaborati oltre il ceppo del mouse desiderato. In quinto luogo, filtro viene spesso eseguito più volte prima e durante l'ordinamento di campione per prevenire in maniera proattiva le righe di esempio intasato in una macchina di FACS. Sesto, il tempo deve essere assegnato in configurazioni di FACS più comunemente utilizzati per inizializzare e stabilizzare il flusso fluido e realizzare la calibratura della gocciolina. Settimo, controllo campioni vengono in genere eseguiti in sequenza prima della raccolta del campione reale per impostare la pagina di matrici di compensazione, rifiuto del doppietto, impostazione gates, utenti ecc o procedere sei e sette stessi prima del tempo o richiedono la assistenza di un tecnico in parallelo. Infine, post-FACS, spesso ci sono misure per garantire che solo etichettati singole cellule sono presenti in ciascun pozzetto; ad esempio, controllando i campioni in un setup di screening ad alto contenuto ad esempio un imager piatto veloce.
Per aggirare la procedura descritta sopra e facilitare un relativamente rapido, mirato sequenziamento di una piccola popolazione di singoli neuroni fluorescente contrassegnati, descriviamo un manuale di procedura seguita da due turni di un altamente sensibile in vitro di ordinamento protocollo di amplificazione, chiamato doppio in vitro trascrizione con conteggi assoluti sequenziamento (DIVA-Seq). La generazione della libreria di amplificazione e cDNA di RNA è adattata da Eberwine et al. 6 e Hashimshony et al. 7, con alcune modifiche per soddisfare interneuroni del mouse che hanno più piccoli volumi cellulare; ancora, abbiamo anche trovato che è altrettanto utile per eccitanti neuroni piramidali.

<table><tbody><tr><td>ERCC RNA Spike-In Control Mixes</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 4456740</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 18080093</td><td></td></tr><tr><td>RNaseOUT Inibitore ribonucleasi ricombinante</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat# 10777019</td><td></td></tr><tr><td>tampone di frammentazione dell'RNA</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# E6105S</td><td></td></tr><tr><td>RNA MinElute kit</td><td>Qiagen</td><td>Cat# 74204</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatasi antartica</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# M0289</td><td></td></tr><tr><td>Poly nucleotide chinasi</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# M0201</td><td></td></tr><tr><td>T4 RNA ligasi2, troncato</td><td>New England Biolabs</td><td>Cat# M0242</td><td></td></tr><tr><td>Ampure Xp perline magnetiche</td><td>Beckman Coulter</td><td>Cat# A63880</td><td></td></tr><tr><td>SPRIselect selezione dimensione perline magnetiche</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat # B23317</td><td></td></tr><tr><td>DL-AP5</td><td>Tocris</td><td>Cat # 0105</td><td></td></tr><tr><td>CNQX</td><td>Tocris</td><td>Cat # 1045</td><td></td></tr><tr><td>TTX</td><td>Tocris</td><td>Cat # 1078</td><td></td></tr><tr><td>Proteasi da Streptomyces griseus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat # P5147</td><td></td></tr><tr><td>Messaggio Amp II kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>Cat # AM1751</td><td></td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>Cat# UN3156</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 761036</td><td></td></tr><tr><td>Illumina TrueSeq smallRNA kit</td><td>Illumina</td><td>Cat# RS-200-0012</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizzatore RNA Pico chip</td><td>Agilent</td><td>Cat# 5067-1513</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizzatore Chip DNA ad alta sensibilità</td><td>Agilent</td><td>Cat# 5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalizzatore 2100</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio di dissezione con fluorescenza e illuminazione a campo chiaro con ottica DIC. (Modello Leica MZ-16F).</td><td>Leica</td><td>Modello MZ-16F</td><td></td></tr><tr><td>Microcapillare in vetro: tubi capillari in borosilicato 500/conf. OD= 1 mm, ID=0,58 mm, parete= 0,21 mm, lunghezza= 150 mm.</td><td>Warner instruments</td><td>Modello GC100-15, Ordine# 30-0017</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per pipette capillari</td><td>Sutter Instruments Co</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Thermo Microm</td><td>HM 650V</td><td></td></tr><tr><td>Unità di raffreddamento tissutale Vibratome</td><td>Thermo Microm</td><td>CU 65</td><td></td></tr></tbody></table>

sequenziamento di rna unicellulare di neuroni di topo fluorescente contrassegnati con cernita manuale e doppia trascrizione in vitro con conteggi assoluti sequenziamento (diva-seq)

Single-cell RNA Sequencing of Fluorescently Labeled Mouse Neurons Using Manual Sorting and Double In Vitro Transcription with Absolute Counts Sequencing (DIVA-Seq)

Sequenziamento di singola cellula RNA (RNA-seq) è ormai uno strumento ampiamente implementato per diluire l'espressione genica. Piattaforme di RNA-sequenziamento unicellulare commercialmente disponibili elaborano tutti gli input cellule indiscriminatamente. A volte, fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) sono usata a Monte per isolare una popolazione specificamente con etichetta di interesse. Una limitazione di FACS è la necessità di un numero elevato di celle di input con frazioni significativamente con etichetta, che è pratico per la raccolta e profilatura popolazioni rare o scarsamente etichettati neurone dal cervello del topo. Qui, descriviamo un metodo per raccogliere manualmente sparse fluorescente etichettati singoli neuroni da appena dissociato del tessuto di cervello di topo. Questo processo consente per l'acquisizione di neuroni con etichetta singola con elevata purezza e successiva integrazione con protocollo in vitro basati su trascrizione amplificazione che mantiene rapporti di trascrizione endogena. Descriviamo un metodo di amplificazione lineare doppia che utilizza identificatori univoci molecola (UNMIS) per generare singoli mRNA conteggi. Due turni di risultati di amplificazione in un elevato grado di rilevazione del gene al singola cella.

Utilizzando il protocollo descritto in precedenza, GABAergici neuroni erano manualmente ordinati (Figura 1) e RNA è stato amplificato, poi trasformato in una libreria di cDNA (Figura 2) ed ordinato a elevata profondità8. I prodotti amplificati di RNA (aRNA) ha variato fra 200 – 4.000 bp in dimensioni, con una distribuzione di picco leggermente di sopra di 500 bp (Figura 3A). L...

Questo protocollo descrive il manuale procedura per isolare singoli neuroni fluorescente contrassegnati seguiti in vitro basati su trascrizione di mRNA amplificazione per la sequenza di RNA di alta profondità unicellulare di ordinamento.

Sequenziamento di RNA unicellulare di neuroni di topo fluorescente contrassegnati con cernita manuale e doppia trascrizione In Vitro con conteggi assoluti sequenziamento (DIVA-Seq)

Single-cell RNA sequencing (RNA-seq) is now a widely implemented tool for assaying gene expression. Commercially available single-cell RNA-sequencing ...

Questo metodo può aiutare a risolvere un ostacolo chiave nel campo dell'isolamento e del sequenziamento dei singoli neuroni. Come la raccolta di una popolazione specifica o una sottopopolazione di neuroni etichettati fluorescentmente dall'area cerebrale definita dall'utente. Il vantaggio principale di questa tecnica è che assicura che il singolo neurone di interesse sia catturato senza contaminare i detriti.È anche relativamente delicato, il che è importante per i tipi di neuroni fragili che muoiono rapidamente quando sottoposti alle pressioni fluide dello smistamento FACS convenzionale. Iniziare preparando microcapillari di vetro tirato con un diametro di uscita da 10 a 15 micron utilizzando un estrattore capillare. Utilizzare forbici fini per tagliare la punta del capillare per ottenere il diametro della scheda desiderato.Quindi utilizzare i connettori di tubo per collegare una lunghezza da 120 a 150 centimetri di tubi flessibili in silicone con un diametro interno di 0,8 millimetri a un filtro siringa a membrana PVDF da 0,2 micron e una valvola di tubi a due vie. Preparare 500 millilitri di liquido spinale cerebrale artificiale refrigerato o ACSF e ossigenare gorgogliando ossigeno bilanciato al 5% di anidride carbonica attraverso un Airstone per 15 minuti o fino a quando la soluzione non si sgombrato completamente. Preparare tre becher da 150 millilitri ciascuno contenente 100 millilitri di ACSF.A uno, aggiungi un cocktail di blocchi di attività. A un altro, aggiungere la frazione di Streptococcus per la proteasi a una concentrazione finale di un milligrammo per millilitro. Al becher finale, aggiungere FBS a una concentrazione finale dell'1% e ossigenare con ossigeno bilanciato con anidride carbonica al 5% attraverso un Airstone.Infine, realizzare tre pipette Pasteur a gambo lungo con diametri di uscita decrescenti rotolandoli su una fiamma aperta. Sezionare il cervello da un topo eutanasiato aprendo il cranio con una piccola forbice ed estraendo il cervello fresco usando forcep fini senza danneggiare la corteccia. Posizionare il cervello in ACSF refrigerato e ossigenato lasciando un Airstone attaccato all'ossigeno bilanciato con anidride carbonica al 5% per l'intera durata del sezionamento.Posizionare il cervello sul mandrino del vibratomo e tagliare le sezioni coronali o sagittali a 300 micron di spessore. Raccogli tutte le sezioni necessarie per ottenere un minimo di 10-50 celle etichettate. Mettere le fette su un porta fette con rete di cotone posto all'interno di un becher in modo che siano bagnate in ACSF ossigenato.Spostare le fette nel becher contenente ACSF con bloccanti di attività e bloccare per 15-20 minuti a temperatura ambiente mentre si gorgoglia ossigeno utilizzando un Airstone. Spostare le fette sul becher contenente ACSF con la soluzione di proteasi per eseguire una digestione lieve a temperatura ambiente. Dopo la digestione, lavare la proteasi spostando le fette al becher contenente ACSF con soluzione di blocco dell'attività per cinque-10 minuti a temperatura ambiente.Continua a gorgogliare ossigeno. Preparare quindi una piastra di Petri da 100 millimetri contenente ACSF con 1%FBS a temperatura ambiente e spostare singole sezioni nel disco per la microdisezione. Sotto un mirino di dissezioni fluorescenti, utilizzare una coppia di forcep fini per micro sezionare aree e strati di interesse con un minimo di 10-50 cellule.Utilizzando una pipetta Pasteur, spostare i pezzi microsezionati su un tubo di microcentrifugo da 2 millilitri contenente circa 0,8 millilitri di 1%FBS in soluzione ACSF. Titolare il tessuto sezionato nel tubo di microfuoco a temperatura ambiente. Eseguire circa 10 tratti con ciascuna delle pipette Pasteur fiammate a partire dal più grande e terminando con il più piccolo diametro di uscita.Erogare le cellule dissociate in una piastra di Petri di 100 millimetri contenente ACSF ossigenato e attendere da cinque a sette minuti affinché le cellule si sistemino gradualmente. Osservare il segnale GFP e RFP al microscopio a dissezione. Identificare i detriti esaminando la morfologia sotto illuminazione a campo luminoso.Una volta identificata un'area di cellule con pochi detriti, utilizzare il capillare e attaccarlo ai tubi per raccogliere le celle bloccando l'estremità della valvola di tubo con la lingua. Quindi posizionare il capillare vicino alle cellule. Rilasciare il blocco sul capillare e bloccarlo rapidamente di nuovo per catturare la cellula utilizzando l'azione capillare.Spostare il capillare su una piastra di Petri di 100 millimetri con ACSF fresco ossigenato e soffiare delicatamente nel tubo osservando la punta capillare sotto l'ottica a fluorescenza per erogare le cellule nel piatto. Ripetere la procedura di raccolta fino a quando non vengono raccolte da 100 a 150 celle assicurandosi che i contaminanti, come i detriti, siano minimi nelle ottiche a contrasto di interferenza differenziale a campo luminoso. Infine, utilizzando ogni volta una pipetta micro-capillare fresca, scegliere una singola cella ed espellerla in non più di 0,5 microlitri in un tubo di micro-fusione da 0,2 microlitri contenente un microlitro di tampone di raccolta campioni con primer.Rompere la punta della pipetta nel tubo di micro-fusione per assicurarsi che la cella rimanga nel buffer di raccolta. Congelare le cellule mettendo i tubi sul ghiaccio secco. Conservare in un congelatore a meno 80 gradi Celsius fino all'elaborazione per l'amplificazione dell'RNA.I neuroni GABAergici sono stati isolati dalla corteccia cingulet del cervello del topo. L'RNA amplificato dai neuroni ordinati manualmente variava tra 200 e 4.000 coppie di basi di dimensioni con una distribuzione di picco leggermente superiore a 500 coppie di basi. Dopo la purificazione delle perline, la libreria cDNA è ulteriormente limitata da un secondo ciclo di purificazione usando perline per eliminare frammenti inferiori a 200 coppie di basi e per il picco a circa 350 coppie di basi.Il sequenziamento ha mostrato un 4,8 per 10 alla 5a mediana o 6,9 per 10 alla 5a lettura mappata media per cella. Dopo la rimozione dell'RNA duplicata usando gli UMI, ogni singola cella aveva una 1,0 per 10 alla 5a mediana o 1,4 volte 10 alla 5a lettura unica media per cella. In ogni consorzio di controlli dell'RNA esterno a singola cellula, il picco di RNA è stato usato come controllo interno per calcolare il numero assoluto di molecole aggiunte al campione.C'era una relazione lineare tra input e conteggi osservati con una pendenza di 0,92 e un quadrato R regolato di 0,94. Una media di circa 10.000 geni per singolo neurone sono stati rilevati utilizzando questa procedura con oltre il 95% delle singole cellule che rilevano più di 6.000 geni. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai biologi molecolari per esplorare il trascritoma di distinti internauri corticali del topo ben caratterizzati e ha identificato alcune categorie geniche che sono responsabili della codifica dell'identità cellulare.

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Questo video dimostra un metodo per isolare neuroni marcati in fluorescenza dal cervello di un topo.

Isolamento di neuroni marcati in fluorescenza da un cervello murino

L'RNA totale di alta qualità è stato preparato da corpi cellulari di motoneuroni del midollo spinale del topo mediante microdisezione di cattura laser dopo aver macchiato sezioni del midollo spinale con Azure B nel 70% di etanolo. L'RNA sufficiente (~40-60 ng) viene recuperato da 3.000-4.000 motoneuroni per consentire l'analisi dell'RNA a valle mediante RNA-seq e qRT-PCR.

Produzione di RNA per l'analisi trascritomica dai corpi cellulari dei motoneuroni del midollo spinale del topo mediante microdisezione di cattura laser

Riportiamo un metodo basato sul Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) per isolare le cellule staminali neurali (NSC) e la loro progenie dalla zona subventricolare (SVZ) del cervello del topo adulto. Applicato a topi transgenici FUCCI (Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator), consente lo studio della progressione del ciclo cellulare mediante imaging dal vivo.

Ordinamento delle cellule staminali neurali e di cellule progenitrici del topo adulto subventricolare Zone e Live-imaging loro dinamiche del ciclo cellulare

Nella malattia di Parkinson (PD), sostanza nera (SNC) neuroni dopaminergici degenerano, portando ad una disfunzione del motore. Qui riportiamo un protocollo per la coltura di neuroni del mesencefalo ventrale da un topo che esprime eGFP guidata da una sequenza promotore la tirosina idrossilasi (TH), la raccolta neuroni fluorescenti singoli dalle culture, e misurando il loro trascrittoma utilizzando RNA-Seq.

Identificazione affidabile di vita neuroni dopaminergici in Culture Midbrain Utilizzando RNA Sequencing e TH-promotore-driven eGFP Expression

Qui presentiamo un approccio combinatorio per la classificazione di tipi di cellule neuronali prima dell'isolamento e per la successiva caratterizzazione di transcriptomi a singola cellula. Questo protocollo ottimizza la preparazione di campioni per il successo RNA Sequencing (RNA-Seq) e descrive una metodologia studiata appositamente per una migliore comprensione della diversità cellulare.

Sequenza RNA a singola cellula di sottogruppi definiti delle cellule del Ganglio retinico

Forniamo un protocollo per l'isolamento della microglia da diverse regioni sezionate di un emisfero cerebrale adulto, seguito dalla preparazione della libreria semiautomatica per il sequenziamento profondo dell'RNA unicellulare di trascrittomi a lunghezza intera. Questo metodo aiuterà a chiarire l'eterogeneità funzionale della microglia in salute e malattia.

Isolamento di Microglia specifico della regione da un emisfero cerebrale di topi adulto per il sequenziamento profondo dell'RNA a singola cellula

Qui abbiamo presentato un metodo di sequenziamento dell'mRNA a singola cellula multiplexed per profilare l'espressione genica nei tessuti embrionali del topo. Il metodo di sequenziamento dell'mRNA a singola cellula (scRNA-Seq) basato su droplet in combinazione con strategie di multiplexing può profilare singole cellule da più campioni contemporaneamente, riducendo significativamente i costi del reagente e riducendo al minimo gli effetti batch sperimentali.

Analisi del sequenziamento dell'mRNA a cella singola multiplexed delle cellule embrionali del topo

Descriviamo una tecnica per profilare i microRNA nei primi embrioni di topo. Questo protocollo supera la sfida dell'input a bassa cellula e del piccolo arricchimento dell'RNA. Questo saggio può essere utilizzato per analizzare i cambiamenti nell'espressione del miRNA nel tempo in diversi lignaggi cellulari dell'embrione del topo precoce.

Preparazione di piccole librerie di RNA per il sequenziamento da embrioni di topo precoce

Presentato qui è un metodo per sequenziare singoli nuclei isolati dal giro dentato del topo che esclude la maggior parte dei neuroni attraverso l'ordinamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FAN). Questo approccio genera profili di espressione di alta qualità e facilita lo studio della maggior parte degli altri tipi di cellule rappresentati nella nicchia, comprese le popolazioni scarse come le cellule staminali neurali.

Ordinamento negativo dei neuroni dei nuclei attivati dalla fluorescenza combinato con il sequenziamento dell'RNA dei singoli nuclei per studiare la nicchia neurogena dell'ippocampo

Questo articolo stabilisce una pipeline per sospensioni di singole cellule e nuclei di alta qualità di embrioni di topo gastrulanti per il sequenziamento di singole cellule e nuclei.

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula di embrioni interi di topo mutanti: dall'epiblasto alla fine della gastrulazione

Questo protocollo combina la citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula per isolare e caratterizzare gli stati delle cellule microgliali nel cervelletto dei cervelli di topo postnatale precoce. Utilizza la dissociazione enzimatica, la centrifugazione Percoll e l'immunocolorazione per rivelare l'eterogeneità delle microglia e migliorare la comprensione del loro ruolo nello sviluppo e nella malattia cerebellare.

Citometria a flusso e analisi di singole cellule per caratterizzare l'attivazione della microglia nello sviluppo precoce del cervello di topo postnatale

Impara il sequenziamento di RNA unicellulare di neuroni fluorescenti del topo usando cernita manuale e trascrizione in vitro. Questo metodo consente l'isolamento delicato di sottopopolazioni neuronali specifiche con alta purezza.

Sequenziamento di RNA unicellulare di neuroni di topo fluorescente contrassegnati con cernita manuale e doppia trascrizione In Vitro con conteggi assoluti sequenziamento (DIVA-Seq) (Video) | JoVE Journal

Sequenziamento di RNA unicellulare di neuroni di topo fluorescente contrassegnati con cernita manuale e doppia trascrizione In Vitro con conteggi assoluti sequenziamento (DIVA-Seq)

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