Isolamento dei Keratinociti Epidermimi del topo e della loro cultura clonogenica in vitro

L'obiettivo di questo protocollo è quello di isolare i cheratinociti epidermici dalla pelle dorsale dei topi adulti per una varietà di applicazioni a valle come la biologia molecolare, la biochimica, lo smistamento delle cellule attivate a fluorescenza e gli usi primari in vitro (ad esempio, clonogenici cheratinociti).

Il nostro metodo per la raccolta di cellule epidermiche da topi adulti è utile per applicazioni a valle come le cellule staminali cheratinociti. La nostra tecnica è altamente riproducibile e può essere utilizzata in combinazione con procedure in vivo nei topi nel contesto del modello di carcinogenesi cutanea. Dopo aver raccolto campioni di pelle dorsale da topi adulti eutanasiati, utilizzare le forcelle autoclavate e un bisturi per posizionare una pelle dorsale alla volta lato peloso verso il basso in una sottile piastra di Petri e eliminare il tessuto sottocutaneo, incluso il grasso del tessuto cutaneo ventrale fino a quando il tessuto non è semitraslucido.

Posizionare la pelle raschiata in PBS fino a quando non vengono lavorate tutte le altre pelli rimanenti. Quindi utilizzare un bisturi per affettare i campioni della pelle in strisce da 0,5 per uno a 1,5 centimetri. Posizionare il lato peloso delle strisce in una piastra di Petri sterile prima di far galleggiare il lato peloso dei campioni sulla superficie di una piastra di Petri da 20 millilitri più due x gentamicina, integrata con 0,25% di tripside in una piastra di Petri di plastica da 100 per 20 millimetri per due ore a 32 gradi Celsius.

Alla fine dell'incubazione, posizionare una piastra di Petri sterile, plastica e quadrata contenente 15 millilitri di mezzo di raccolta a una pendenza di 30 gradi e utilizzare forcep curve per trasferire con cura una striscia di pelle galleggiante nel piatto. Tenendo una nuova lama bisturi ad un angolo perpendicolare alla pelle e usando una forza sufficiente ma non eccessiva, eliminare l'epidermide e i peli dal campione nel mezzo. Una volta raschiate tutte le strisce, decantare accuratamente la cellula epidermica contenente supernatante in un barattolo sterile da 60 millilitri contenente una barra di agitazione magnetica da 1,5 pollici e sciacquare la piastra di Petri con un mezzo di raccolta aggiuntivo per raccogliere eventuali cellule epidermiche rimanenti.

Portare il volume finale nel barattolo a 30 millilitri con mezzo fresco e mescolare la soluzione cellulare epidermica a 100 rotazioni al minuto per 20 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione di agitazione in un armadio di biosicurezza rimuovere la barra di agitazione e filtrare la soluzione cellulare attraverso un colino di 70 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri. Utilizzare le forcep e quindi una pipetta per premere i peli e i materiali dello strato corneo attraverso il colino per manipolare il tessuto per rilasciare le cellule ciliate intrappolate e utilizzare altri cinque millilitri di mezzo di raccolta per rilasciare le cellule ciliate rimaste intrappolate nel tubo.

È fondamentale che le cellule epidermiche e i peli siano manipolati in modo da rilasciare le cellule dai follicoli piliferi. Portare il volume totale nel tubo fino a 50 millilitri con mezzo fresco e raccogliere il filtrato cellulare per centrifugazione. Rimorsi il pellet in 5 millilitri di mezzo di raccolta fresco in circa 20 triturazioni con pipetta da 5 millilitri.

Prendere 0,5 millilitri di diluizione da uno a 20 e trasferirlo in un tubo di microfugo da 2 millilitri. Dopo aver miscelato attentamente il campione, prendere 200 microlitri dal tubo di microfugo e mescolare delicatamente con un volume uguale di soluzione blu 0,4%trypan. Mescolare delicatamente questa soluzione tre volte e trasferire le cellule in un emocitometro per il conteggio dei cheratinociti nucleati.

Classifica tutte le celle blu scuro come celle non vitali e segna piccole cellule dorato e rosato come cellule vitali. La vitalità è in media dell'80% circa e la resa finale di cheratinociti per topo dovrebbe essere di circa 30 milioni di cellule vitali. Dopo il conteggio, raccogliere le cellule con un'altra centrifugazione, e per la coltura di massa rimescolare da due a quattro volte 10 al sesto cheratinociti vitali per 35 millimetri di piastra di Petri in 2 millilitri di mezzo di coltura cellulare.

Per un saggio di formazione di colonie clonogeniche, risosopendare le cellule a una per 10 al terzo cheratinociti per quattro millilitri di E Medium di William modificato con integratori in concentrazione di siero per piatto di Petri rivestito di collagene di 60 millimetri su strati di alimentatore di topo svizzero irradiato a raggi X 3T3. Per la coltura di massa, far crescere le colture a 32 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per il periodo di coltura cellulare appropriato. Cambiare il mezzo 24 ore dopo la semina iniziale per la coltura di massa e tre volte alla settimana successiva.

Alla fine della coltura clonale aspirare il mezzo e fissare le colonie in formalina tamponata al 10% durante la notte a temperatura ambiente. La mattina seguente, macchiare le colonie con lo 0,5% di rodiammina B in acqua autoclavata per un'ora, prima di risciacquare i piatti in acqua fredda autoclavata fino a quando l'acqua non scorre limpida. Quindi inclinare i piatti sui loro coperchi per asciugare prima di contare le colonie.

Qui, vengono mostrati i risultati tipici dei test di formazione della colonia di cheratinociti dopo vari trattamenti topici. Le cellule staminali del follicolo pilifero coevengono in genere circa il 9% delle cellule isolate dalla pelle dorsale del topo C57BL/6 adulta, come valutato dalla colorazione citometrica del flusso per i marcatori delle cellule staminali del follicolo pilifero del topo. In questa figura si possono osservare le caratteristiche di crescita delle colonie di cellule staminali cheratinociti dopo la coltura in quattro diverse condizioni medie.

Seguendo questa procedura, le cellule possono essere utilizzate per citometria a flusso, smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, coltura cellulare e analisi biologiche molecolari. Questa tecnica ci ha permesso di determinare che il numero di cellule staminali epidermiche è un tratto quantitativo e complesso che porta all'identificazione di un nuovo gene regolatore delle cellule staminali.