Name: Quantificazione del leucocita Egress tramite vasi linfatici dalla pelle murina e tumori (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Impara a quantificare l'uscita dei leucociti dai tumori cutanei in vivo utilizzando tecniche di fotoconversione nei topi transgenici Kaede. Questo metodo consente di tracciare le dinamiche immunitarie endogene.

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Gli autori vorrei ringraziare il Dr. Marcus Bosenberg per la fornitura di YUMM 1.1 e linee di melanoma murino YUMM 1.7 e Dr. Deborah J. Fowell per la fornitura di B6. CG-Tg(CAG-tdKaede) 15Utr topi in accordo con RIKEN BRC attraverso la Bio-risorsa nazionale di MEXT, Giappone.

Tutti i protocolli di animali sono stati approvati dal comitato di utilizzo presso la Oregon Health & Science University e istituzionali Animal Care.
1. induzione di infiammazione e pittura di FITC di Mouse Pinna
<ol><li>In una cappa a flusso laminare, anestetizzare un mouse C57Bl/6 utilizzando vaporizzata isofluorano (indurre a 3-5% isofluorano e mantenere a 1-3% isofluorano; portata di ossigeno a 0,5-1,0 L/min). Garantire adeguata amputate monitorando la perdita del riflesso pedale, movimenti involontari e ridotta frequenza respiratoria.</li>
	<li>Posare un orecchio piatto con il lato ventrale dell'orecchio verso l'alto. Pipettare 20 µ l di soluzione FITC 5% sciolto in 1:1 acetone: dibutilftalato (DBP) al lato ventrale di pinna di orecchio. Consentire l'orecchio ad asciugare per pochi secondi.</li>
	<li>24 h dopo l'applicazione di FITC, eutanasia i topi tramite l'esposizione di anidride carbonica seguita da dislocazione cervicale. Raccogliere i padiglioni auricolari in PBS separando le orecchie dalla testa con le forbici. Raccogliere la cervicale dLNs e inguinale non drenante LNs in PBS utilizzando una pinzetta per separare la LNs dai tessuti circostanti. Inguinale non drenante LNs servirà come controlli negativi per la presenza di leucociti /Kaede rosso+ +FITC. Smaltire le carcasse al protocollo ospedaliero. Nota: Il tempo ottimale post fotoconversione per analisi dipenderà il tipo di cella e noti comportamenti migratori. Cellule dendritiche, ad esempio, possono essere rilevate in dLNs come presto come 6h post DBP applicazione.</li>
</ol>2. induzione di infiammazione e di fotoconversione di Mouse Pinna
<ol><li>In una cappa a flusso laminare, anestetizzare un mouse di Kaede-Tg (sfondo C57Bl/6) tramite l'iniezione intraperitoneale di 80 mg/kg ketamina e 10 mg/kg xylazina sciolto in soluzione salina. Garantire la corretta amputate come descritto nel passaggio 1.1.</li>
	<li>Posare un orecchio piatto con il lato ventrale dell'orecchio verso l'alto. Pipettare 20 µ l di un 1:1 di acetone: DBP al lato ventrale del padiglione auricolare dell'orecchio. Consentire l'orecchio ad asciugare per pochi secondi.</li>
	<li>Dopo l'applicazione di DBP, tagliare una fessura in un pezzo di carta stagnola e tirare l'orecchio attraverso la fessura per esporre l'orecchio alla sorgente di luce viola. Porre l'orecchio piatto con il lato dorsale rivolto verso l'alto utilizzando nastro biadesivo per fissare l'orecchio all'estruso.</li>
	<li>Posizionare l'orecchio direttamente sotto la fonte di luce e fotoconvertita per 3 minuti utilizzando una sorgente luminosa di 405 nm a 100 mW di potenza.</li>
	<li>24 h dopo fotoconversione, eutanasia i topi di Kaede-Tg e raccogliere i padiglioni auricolari, LNs cervicale e inguinale LNs descritte al punto 1.3. Nota: Oltre a considerazioni citate al passaggio 1.3, i tassi di proliferazione saranno determinare i tempi di analisi come si verifica la perdita di Kaede rosso in cellule in rapida divisione.</li>
</ol>3. vaccinia infezione del Mouse Pinna e applicazione di FITC
<ol><li>Anestetizzare un mouse C57Bl/6 con isofluorano vaporizzato come descritto nel passaggio 1.1.</li>
	<li>Appoggiare il lato ventrale dell'orecchio piatto. Pipettare 5 x 106 unità formanti placca (PFU) del virus vaccinico (VacV) diluito in 10 µ l di PBS sul padiglione auricolare dell'orecchio. Utilizzando un ago 29, poke pinna 25 volte40.</li>
	<li>post-infezione 24h, anestetizzare topi VacV-infettati con isofluorano come descritto nel passaggio 1.1 e dispensare 20 µ l 5% FITC disciolto in acetone sul lato ventrale del padiglione auricolare dell'orecchio. Consentire l'orecchio ad asciugare per pochi secondi.</li>
	<li>24 h dopo l'applicazione di FITC, eutanasia i topi e raccogliere i padiglioni dell'orecchio, LNs cervicale e inguinale LNs descritte al punto 1.3. Nota: FITC può essere applicato a qualsiasi infezione post punto di tempo per determinare DC traffico a vari intervalli di 24 h. Precedentemente abbiamo segnalato che la migrazione DC a dLNs è mantenuta a livelli simili da giorno 1 a 3 post infezione41.</li>
</ol>4. vaccinia infezione del Mouse Pinna e fotoconversione.
<ol><li>Anestetizzare un mouse di Kaede-Tg con isofluorano vaporizzato come descritto nel passaggio 1.1.</li>
	<li>Infettare il pinna orecchio con VacV come descritto al punto 3.2.</li>
	<li>24h post-infezione, anestetizzare topi infettati VacV Kaede come descritto nel punto 2.1 ed eseguire fotoconversione come descritto ai punti 2.3-2.4.</li>
	<li>24 h dopo fotoconversione, eutanasia i topi e raccogliere i padiglioni auricolari, LNs cervicale e inguinale LNs descritte al punto 1.3. Nota: Come indicato al punto 3.4, fotoconversione può essere somministrato a qualsiasi infezione di post punto di tempo.</li>
</ol>5. orecchio e linfonodo elaborazione per citometria a flusso
<ol><li>Creare sospensioni singola cella dei padiglioni auricolari ear: sbucciate a pezzi i lati ventrali e dorsali del pinna orecchio utilizzando due coppie di pinzette e posto all'interno dell'orecchio rivolto verso il basso nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente collagenasi di 1 mg/mL D e 80 U/mL DNasi, diluito in Buffered Saline soluzione (HBSS di Hank) (contenente Ca2 + e Mg2 +). Incubare a 37 ° C per 30 min premere il tessuto digerito attraverso un colino di cella in nylon 70 µm.</li>
	<li>Creare sospensioni singola cella da LNs: posto LNs nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente collagenasi di 1 mg/mL D e 80 U/mL dnasi diluito in HBSS. Aprire civettuole linfonodo usando due aghi di 29-calibro della capsula e poi incubare i linfonodi a 37 ° C per 30 min premere il tessuto digerito attraverso un colino di cella in nylon 70 µm.</li>
</ol>6. intradermica Melanoma impianto del tumore e fotoconversione.
<ol><li>Radere il pelo dal centro della parte posteriore di un mouse di Kaede-Tg utilizza un rasoio elettrico.</li>
	<li>Posizionare un ago 29 al centro della schiena tra le scapole superiore di destra e sinistra e iniettare per via intradermica 5x105 cellule del tumore (diluite in 50 µ l di soluzione fisiologica) nella pelle dei topi di Kaede-Tg. I tumori devono essere posizionati accuratamente per assicurare il drenaggio linfatico ai linfonodi specificati (cioè, sinistra e destra brachiale LNs per tumori collocato al centro della parte superiore della schiena). Evitare di collocare il tumore sopra dLN poiché ciò può comportare fotoconversione diretto di LNs attraverso il tumore di pelle.</li>
	<li>Consentire i tumori crescere di dimensione desiderata (100-650 mm3).</li>
	<li>Un giorno prima della raccolta del tessuto, anestetizzare un mouse di Kaede-Tg come descritto al punto 2.1 e radere i peli appena ricresciuto intorno al tumore.</li>
	<li>Tagliare un foro circolare nella carta stagnola e tirare il tumore attraverso per esporre il tumore alla sorgente luminosa. Tagliare il foro leggermente più piccolo del tumore per impedire la caduta indietro attraverso il foro di tumore e ridurre al minimo la conversione della pelle adiacente, non tumorali.</li>
	<li>Posizionare il tumore direttamente sotto la sorgente luminosa e fotoconvertita per 5 min utilizzando una sorgente luminosa di 405 nm a 200 mW di potenza.</li>
	<li>24 h dopo fotoconversione, eutanasia i topi come descritto al passaggio 1.3. Raccogliere i tumori, brachiale dLNs e inguinale LNs non-drenante in PBS. Tagliare i tumori dalla pelle circostante utilizzando le forbici e rimuovere LNs descritte al punto 1.3.</li>
</ol>7. tumore e linfonodo elaborazione per citometria a flusso
<ol><li>Creare sospensioni singola cella dai tumori: tritare i tumori con le forbici in pozzetti di una piastra a 24 pozzetti contenente collagenasi di 1 mg/mL D e 80 U/mL dnasi diluito in HBSS. Incubare a 37 ° C per 1 h. Press il tessuto digerito attraverso un filtro di nylon 70 µm.</li>
	<li>Creare sospensione unicellulare dei linfonodi come descritto al punto 5.2.</li>
</ol>8. anticorpo che macchia per citometria a flusso
<ol><li>Dopo digerire i tessuti nelle sospensioni singola cella, eseguire tecniche di colorazione citometria a flusso standard per etichettare le cellule con gli indicatori di interesse. Brevemente, dispensare 2 x 106 le cellule in una piastra a 96 pozzetti. Incubare i campioni con blocco Fc (1 µ g/mL) per 20 minuti sul ghiaccio; lavare due volte con tampone di FACs (albumina di siero bovino 1% in PBS). Aggiungere live/dead macchia (diluito in PBS) ai campioni ed incubare per 15 minuti sul ghiaccio; lavare due volte con tampone di FACs. Incubare con gli anticorpi primari (Tabella materiali) diluiti in un tampone di FACs per 30 min in ghiaccio; lavare due volte con tampone di FACs. Nota: Kaede verde e Kaede fluorescenza rossa si sovrappone con fluorofori FITC e PE; così, FITC e anticorpi coniugati PE non possono essere utilizzati in combinazione con proteine di Kaede.</li>
	<li>Dopo la colorazione, è necessario eseguire gli esempi su un citometro a flusso. In alternativa, fissare le cellule con 2% PFA.</li>
</ol>9. analisi di citometria a flusso di
<ol><li>Impostare il FITC (Kaede verde) e il canale di PE (Kaede rosso) tensioni PMT al 70-80% dell'intervallo totale (centro della popolazione di circa 104) utilizzando ex vivo Kaede verde o gli splenocytes Kaede rosso colore singolo o sangue. Nota: Non compensano per il verde di Kaede (FITC) e canali di Kaede rosso (PE) come questo si tradurrà in una maggiore segnale diffuso.<ol>
<li>Per creare controlli di singolo-colore Kaede, raccogliere una milza o sangue da un mouse di Kaede-Tg. Lisare cellule rosse del sangue con buffer di ACK, poi dividere le celle in due gruppi: non convertiti Kaede verde e convertito Kaede rosso.</li>
		<li>Per singolo colore Kaede rossi controlli, sospendere le cellule in 1 mL di PBS e fotoconvertita in una piastra a 24 pozzetti per 5 min utilizzando un sorgenti luminose di 405 nm con una potenza di 100 mW. Utilizzare queste cellule per impostare il Kaede verde (FITC) e Kaede rosse tensioni PMT sul citofluorimetro (punto 9.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo aver impostato le tensioni per le proteine di Kaede, compensare tutte le altre macchie di anticorpo primario utilizzando single-fluoroforo etichettato perline di compensazione per le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Eseguire gli esempi su un citometro a flusso per raccogliere dati. Nota: La proteina di Kaede è continuamente essere prodotta dalle cellule. Questo significa che 24 h dopo fotoconversione, cellule convertite sarà doppio positivo per Kaede verde e Kaede rosso come recentemente sintetizzato Kaede (verde) della proteina ha accumulato nella cella.</li>
	<li>Analizzare i dati utilizzando il software FlowJo o un software simile.</li>
</ol>

Gli autori non hanno nessun conflitto di divulgare.

Anche se l'uscita del leucocita dai tessuti periferici, non linfoidi è critico per l'avvio e la risoluzione della risposta immunitaria, i meccanismi molecolari che regolano i servizi esterni sono capiti male. Questa lacuna nella conoscenza è in gran parte a causa della pronta disponibilità di strumenti per la quantificazione in vivo. Qui, descriviamo l'uso di topi fotoconvertibile (Kaede-Tg) a quantificare egress endogeno del leucocita dalla pelle e tumori e fornire un diretto confronto testa a testa con vernice...

Risposte immunitarie tessuto periferico sono a forma di non solo di reclutamento leucocitario ai siti di infiammazione, ma anche dai meccanismi che regolano la loro successiva conservazione. Così, l'immunità protettiva è dettata dalla cumulativi meccanismi cellulari e molecolari che determinano se un leucocita entra, soggiorni all'interno, o meglio migra dal tessuto periferico tramite vasi linfatici. D'importanza, la propensione per i leucociti uscire del tessuto attraverso i vasi linfatici (definito in uscita) è legata alla loro funzioni specializzate. Le cellule dendritiche (DC) acquisiscono comportamento migratore in risposta a segnali di maturazione che conduce al trasporto dell'antigene e presentazione nello scarico dei linfonodi (dLN), un processo che è necessario per l'immunità adattativa1. Lo scavenging cellule mieloidi, quali macrofagi e neutrofili, servono a rimuovere i detriti apoptotici attraverso fagocitosi. Durante l'infezione batterica, neutrofili uscita del tessuto e, infine, andare incontro ad apoptosi in dLNs2 e in un modello di colite DSS indotta, dati supportano l'ipotesi che l'uscita del macrofago è necessaria per risolvere l'infiammazione locale3. Tuttavia, se conta dei neutrofili e dei macrofagi in uscita si verifica in tutti i contesti infiammatori, è sconosciuto. Prove per l'uscita dei linfociti T da stazionario4,5,6,7, infetti8e infiammata4,9,10, 11,12 tessuti periferici non linfoidi indica che le cellule T ricircolare attivamente, anche se i segnali tissutali che guidano questa uscita rimangono poco compresi. Parecchi studi hanno identificato i segnali necessari per la migrazione direzionale verso lo scarico di capillari linfatici e successivi uscita compreso ligando di chemochina (motivo C-C) 21 (CCL21) e del suo recettore CCR74,11, 13, ligando di chemochina (motivo C-X-C) 12 (CXCL12) e il suo recettore CXCR42,14e sfingosina-1-fosfato (S1P)10,15,16. Questi meccanismi non sono attivi in tutti i contesti, tuttavia, e se essi determinano in uscita di tutti i tipi di cellule rimane una questione aperta. D'importanza, ulteriore comprensione dei meccanismi che regolano l'uscita e la sua rilevanza funzionale nella malattia richiede metodi quantitativi in vivo di analisi.
Diversi metodi sono stati usati per quantificare in uscita in più modelli animali in vivo , tra cui diretto incannulazione dei vasi linfatici, trasferimento adottivo di ex vivo etichettato leucociti, applicazione transcutanea di traccianti fluorescenti, iniezione di particelle con etichettate e in vivo fotoconversione17,18. Incannulazione diretta dei vasi linfatici afferenti del mouse è difficile e limitata nei piccoli animali dai volumi di liquido che può essere raccolto. Così, inserimento di una canula in gran parte è stata eseguita in animali di grandi dimensioni (ad es., pecore) dove tali manipolazioni chirurgiche sono pratici. Questi studi forniscono la prova diretta per la presenza di cellule mieloidi e linfoidi in linfa10,19,20. Inoltre, ovine modelli rivelano che l'infiammazione acuta e cronica aumentata presenza dei linfociti nei linfonodi da quasi 100 volte10,21.
Trasferimento adottivo di linfociti con etichettati e geneticamente manipolati soprattutto ha rivelato che CCR7 è necessaria per l'uscita di CD4+ T cellule da acutamente inflamed pelle5,11, mentre il pretrattamento dei linfociti con la piccola molecola agonista del recettore S1P, FTY720, inibisce solo parzialmente la loro uscita10. È interessante notare che, l'uscita dei linfociti trasferiti da pelle cronicamente infiammata è CCR7-indipendente10, ma parzialmente può richiedere CXCR49. Esperimenti di trasferimento adottivo, tuttavia, forniscono numeri non-fisiologica di ex vivo linfociti attivati ed etichettati nel tessuto attraverso l'iniezione, che altera l'ambiente biomeccanica dei tessuti e l'elevata pressione del fluido interstiziale che aprire capillari linfatici iniziali e alterare le loro proprietà di trasporto22. Come un'applicazione alternativa, transdermica di isotiocianato di fluorescina (FITC) in presenza o assenza di sostanze irritanti cutanei (ad es., dibutilftalato, DBP) o infezione23,24 consente per il tracciamento degli cellule fagocitiche che si accumulano tracciante e la migrazione a dLNs. Analogamente, fluorescente identificati tumori forniscono un mezzo per tenere traccia di cellule fagocitiche che hanno inghiottito tumore materiale25. Questi metodi hanno fornito la comprensione importante nei meccanismi che regolano DC uscita13,14,17,26,27 , ma sono in grado di tenere traccia non fagocitica linfociti e, interpretazione può essere complicate da libero drenaggio linfatico di FITC solubile così etichettatura stanziali, LN residente DCs.
In alternativa, la microscopia intravital è un potente strumento che permette per il monitoraggio in vivo di popolazioni leucocitarie fisiologicamente rilevanti in tempo reale28,29. Usato in combinazione con i topi reporter e base di anticorpi in vivo etichettatura immunofluorescente, videomicroscopia microscopia ha rivelato il complesso spaziale e dinamica temporale di immune cellula traffico, tra cui migrazione interstiziale30 , trasmigrazione attraverso l'endotelio linfatico, il passaggio all'interno del lume linfatico e migrazione su LN voce28,31. L'adozione di tecniche di imaging videomicroscopia è limitata dalla spesa, competenze necessarie per la messa a punto e limitata velocità di trasmissione per quantificare più tipi di cellule. Ancora, metodi quantitativi che analizzare le dinamiche di popolazione di accoppiamento tessuti con imaging videomicroscopia fornirà ulteriori e importanti informazioni per quanto riguarda i meccanismi di migrazione verso e all'interno di capillari linfatici e motilità 18 , 31 , 32.
Di conseguenza, in vivo fotoconversione è emerso come un metodo che consente di in situ di etichettatura, indipendente di attività fagocitaria e per la quantificazione di uscita fisiologico del leucocita (quando accoppiato con citometria a flusso) nella assenza o presenza di sfida. Topi di Kaede-Tg esprimono costitutivamente una proteina isolata dal corallo che presenta fluorescenza verde (Kaede verde) fino a quando esposto a luce ultravioletta, dopo di che irreversibilmente converte in fluorescenza rossa (Kaede rosso)33. Photoconverted cellule possono essere monitorate come essi uscire da luoghi periferici del tessuto e si accumulano nel dLNs. Questo e altri simili fotoconvertibile mouse modelli34,35 hanno rivelato biologia importante tra cui uscita costitutiva delle cellule T regolatorie da pelle36, servizi esterni di CXCR4-dipendente delle cellule di B da placche di Peyer37 , mobilizzazione delle cellule di T di memoria residente al momento del peptide ri-sfida38e l'uscita del leucocita ampio da tumore microambienti39. Nel presente documento, eseguiamo un confronto testa a testa di fotoconversione con applicazione transdermica FITC nel contesto di infiammazione cutanea e infezione per consentire un confronto diretto dei dati esistenti con il metodo fotoconvertibile. Inoltre, dimostriamo fotoconversione in tumori impiantati e descrivere l'efficienza di conversione e l'uscita selettiva da microambienti di tumore. Come tale, ci sostengono che ulteriore applicazione di questi metodi è necessario chiarire la biologia critica d'uscita del leucocita dai tumori, che avrà implicazioni significative per l'interpretazione delle complessità di intratumoral del leucocita, immunità anti-tumorale, e risposta alla terapia.

<table><tbody><tr><td>Collagenasi D</td><td>Roche</td><td>11088866001</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche</td><td>4536282001</td><td></td></tr><tr><td>Silver-LED-405B sorgente luminosa con fibra ottica e collimetro</td><td>Prizmatix Ltd</td><td>V8144</td><td></td></tr><tr><td>Isotiocianato di fluoresceina isotiocianato I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4274</td><td></td></tr><tr><td>dibutilftalato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>524980</td><td></td></tr><tr><td>acetone</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>2440-02</td><td></td></tr><tr><td>siringhe calibro 29</td><td>Exel International</td><td>26029</td><td></td></tr><tr><td>Evans Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E2129</td><td></td></tr><tr><td>filtri cellulari da 70 um</td><td>VWR</td><td>732-2758</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Cassone</td><td>HBL06</td><td></td></tr><tr><td>Kit per la colorazione delle cellule morte Aqua fissabile LIVE/DEAD</td><td>Invitrogen</td><td>L34966</td><td></td></tr><tr><td>Purificato Anti-topo CD16/CD32</td><td>Tonbo Biosciences</td><td>70-0161-M001</td><td></td></tr><tr><td>BV605 CD11c (clone N418)</td><td>Biolegend</td><td>117334</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-Cy5.5 MHCII (clone M5/114.15.2)</td><td>BD Pharmingen</td><td>562363</td><td></td></tr><tr><td>BV421 CD3e (clone 145-2C11)</td><td>Biolegend</td><td>100341</td><td></td></tr><tr><td>APC CD8a (clone 53-6.7)</td><td>TonBo Biosciences</td><td>20-0081-u100</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 CD45 (clone 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103116</td><td></td></tr><tr><td>BV650 CD19 (clone 6D5)</td><td>Biolegend</td><td>115541</td><td></td></tr><tr><td>PercCP-Cy5.5 Ly6C (clone HK1.4)</td><td>Biolegend</td><td>128011</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 F4/80 (clone BM8)</td><td>Biolegend</td><td>123121</td><td></td></tr><tr><td>APC-Cy7 Ly6G (clone 1A8)</td><td>Biolegend</td><td>127623</td><td></td></tr><tr><td>BV711 CD11b (clone M1/70)</td><td>Biolegend</td><td>101241</td><td></td></tr><tr><td>BV605 CD45 (clone 30-F11)</td><td>Biolegend</td><td>103155</td><td></td></tr><tr><td>BV711 CD4 (clone RM4-5)</td><td>BD Biosciences</td><td>563726</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (Frazione V)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Set di particelle anti-ratto e anti-criceto Igk / Compensazione del controllo negativo</td><td>BD Biosciences</td><td>552845</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso Fortessa</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10 Software</td><td>FlowJo</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantificazione del leucocita egress tramite vasi linfatici dalla pelle murina e tumori

Quantifying Leukocyte Egress via Lymphatic Vessels from Murine Skin and Tumors

Uscita del leucocita dai tessuti periferici ai linfonodi drenanti non è solo fondamentale per la sorveglianza immune e l'inizio, ma contribuisce anche alla risoluzione delle risposte dei tessuti periferici. Mentre una varietà di metodi sono usati per quantificare in uscita del leucocita dai tessuti non linfoidi, periferici, i meccanismi cellulari e molecolari che regolano il contesto-dipendente in uscita rimangono poco compresi. Qui, descriviamo l'uso di fotoconversione in situ per l'analisi quantitativa di uscita del leucocita da murina pelle e tumori. Fotoconversione permette l'etichettatura diretta dei leucociti residente all'interno del tessuto cutaneo. Anche se l'esposizione della pelle a luce ultravioletta induce locale le risposte infiammatorie caratterizzano da infiltrati del leucocita e permeabilità vascolare, in un confronto testa a testa con applicazione transcutanea di traccianti fluorescenti, fotoconversione specificamente con etichetta popolazioni migratori delle cellule dendritiche e contemporaneamente abilitato la quantificazione di uscita mieloide e linfoidi da microambienti cutanei e tumori. I meccanismi d'uscita del leucocita rimangono un componente mancante nella nostra comprensione della complessità del leucocita intratumoral, e così l'applicazione degli strumenti descritti nel presente documento fornirà visione unica le dinamiche del tumore immuni microambienti entrambi a costante dichiari e in risposta alla terapia.

In primo luogo abbiamo cercato di replicare fotoconversione risultati pubblicati nella letteratura per valutare l'efficienza e determinare l'infiammazione associata nella pelle del mouse. Padiglione auricolare dell'orecchio è stato esposto a 100 mW viola luce (405 nm) per 3 min come precedentemente descritto33. Singola di sospensioni cellulari generate dalla pelle dell'orecchio, o cervicale dLNs immediatamente dopo l'esposizione ha rivelato un'efficienza di convers...

Qui, noi dimostrare i metodi per la quantificazione in vivo d'uscita del leucocita da ingenuo, infiammato e maligni della pelle murino. Eseguiamo un confronto testa a testa tra due modelli: transdermico FITC applicazione ed in situ fotoconversione. Inoltre, dimostriamo l'utilità di fotoconversione per servizi esterni del leucocita di rilevamento da tumori cutanei.

Quantificazione del leucocita Egress tramite vasi linfatici dalla pelle murina e tumori

Leukocyte egress from peripheral tissues to draining lymph nodes is not only critical for immune surveillance and initiation but also contributes to the ...

La fotoconversione fornisce un metodo in vivo tracciabile per l'analisi quantitativa dell'uscita dei leucociti per una visione meccanicistica della residenza dei leucociti e delle dinamiche di uscita da più siti tissutali in stati danneggiati. Bene, qui dimostriamo l'utilità del tracciamento dei leucociti dai tumori cutanei. L'applicazione di questo saggio ad altri tessuti e malattie è limitata solo dalla capacità di somministrare luce.Il principale vantaggio di questa tecnica è che permette la quantificazione delle popolazioni di cellule immunitarie endogene, piuttosto che trasferite come uscita dai tessuti infiammati in vivo. Per indurre l'infiammazione, dopo aver confermato una mancanza di risposta al dito del piedi, utilizzare una micropipetta per somministrare 20 microlitri di ftalato di dibutile o DBP, al lato ventrale dell'pinna dell'orecchio di un topo transgenico Kaede anestetizzato. Dopo aver permesso al DBP di asciugarsi, tirare l'orecchio attraverso una fessura in un pezzo di foglio di alluminio e utilizzare nastro a doppia parte per fissare l'orecchio saldamente al foglio con il lato dorsale rivolto verso l'alto.Quindi, posiziona che sei direttamente sotto una sorgente luminosa di 405 nanometri e fotoconverti per tre minuti a 100 milliwatt di potenza. Per l'infezione da vaccinia, utilizzare una micropipetta per somministrare 5 volte 10 alla 6a placca formando unità del virus vaccinia in 10 microlitri di PBS sulla pinna dell'orecchio di un topo transgenico Kaede anestetizzato e colpire la pinna 25 volte. 24 ore dopo, fotoconverti la pinna come appena dimostrato.Nel momento sperimentale appropriato, raccogliere i linfonodi pinna e cervicale e inguinale e utilizzare due paia di pinzette per smontare il lato ventrale e dorsale di ogni pinna. Quindi posizionare i linfonodi e i pezzi pinna, con l'interno dell'orecchio rivolto verso il basso, in singoli pozzi di una piastra da 24 pozzetti contenente 1 milligrammo per millilitro di Collagenasi D e 80 unità per millilitro di Dnasio diluito in HBSS contenente calcio e magnesio. Utilizzare due aghi calibro 29 per stuzzicare ogni capsula linfonodo e posizionare la piastra a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Al termine dell'incubazione, premere i tessuti pinna e linfonodo digeriti attraverso filtri cellulari in nylon da 70 Micron separati per ottenere sospensioni a singola cellula di ciascun tessuto. Quando i tumori sono cresciuti fino alle dimensioni sperimentali appropriate, radere qualsiasi pelliccia appena ricrescita intorno al sito tumorale e tirare il tumore attraverso un foro circolare tagliato in un pezzo di foglio di alluminio. Posizionare il tumore direttamente sotto la sorgente luminosa di 405 nanometri e fotoconvertire per 5 minuti a 200 milliwatt di potenza.24 ore dopo la fotoconversione, raccogliere i tumori e i linfonodi brachiali e inguinali da ogni animale e utilizzare le forbici per tritare i tumori all'interno di singoli pozzi di una piastra di 24 po 'contenente Collagenasi D e DNasi in HBSS. Posizionare i linfonodi in pozzi separati e stuzzicare aprire le capsule come appena dimostrato. Dopo aver incubato i tumori per un'ora e i linfonodi per mezz'ora a 37 gradi Celsius, premere i tessuti digeriti attraverso filtri separati da 70 Micron per ottenere sospensioni a singola cellula di ciascun tessuto.Per analizzare le sospensioni a singola cellula per citometria a flusso, raccogliere prima la milza o il sangue da un topo transgenico Kaede e liscicolare i globuli rossi con tampone di potassio cloruro di ammonio. Dividere le cellule in un FITC Kaede non convertito e una popolazione kaede PE convertita e rimescolare le cellule Kaede PE a singolo colore in un millilitro di PBS in un pozzo di una piastra di 24 pozzetti, quindi fotoconvertire le cellule per 5 minuti sotto una sorgente luminosa di 405 nanometri a 100 milliwatt di potenza. Successivamente utilizzare le celle Kaede PE fotoconvertite e le celle FITC Kaede non convertite per impostare le tensioni fotomoltiplicatorie sul 70-80% dell'intervallo totale di ogni canale fluorescente.Una volta impostate le tensioni per le proteine Kaede, compensare tutte le altre macchie di anticorpi primari utilizzando singole perline di compensazione etichettate al fluoroforo, secondo le istruzioni del produttore. Quindi, eseguire i campioni sul citometro di flusso in base ai protocolli di analisi citometrica del flusso standard. Le sospensioni a singola cellula generate dalla pelle dell'orecchio o dai linfonodi drenante cervicali immediatamente dopo l'esposizione alla fotoconversione rivelano un'efficienza di conversione del 78% di tutti i leucociti positivi CD45 nella pelle, senza cellule convertite osservate nei linfonodi drenante.La quantificazione del numero di leucociti positivi cd45 infiltrati nelle orecchie fotoconvertite zero e 24 ore dopo la conversione, rivela che l'esposizione alla luce viola causa un aumento statisticamente significativo dell'infiltrazione di leucociti. Questo aumento dell'infiltrazione positiva di leucociti CD45, tuttavia, è piccolo rispetto all'infiltrazione indotta da un potente stimolo infiammatorio come il virus vaccinia. La fotoconversione aumenta anche la permeabilità vascolare nella pinna dell'orecchio misurata dal saggio Miles, indicando insieme che gli effetti della luce viola sull'infiammazione dei tessuti dovrebbero essere considerati quando si ottimizzano la dose, il tempo di esposizione e l'interpretazione dei dati.L'analisi citometrica del flusso delle cellule tumorali dissociate dagli animali fotoconvertiti rivela una significativa conversione delle cellule positive intratumorali CD45 da Kaede FITC positivo a Kaede PE positivo, mentre le cellule linfonodo drenante rimangono non convertite. L'efficienza di fotoconversione dei leucociti positivi cd45 variava significativamente tra i tipi e le dimensioni tumorali, con i leucociti positivi CD45 all'interno di piccoli tumori del melanoma che dimostravano la fotoconversione più efficiente. Con l'aumento dei volumi tumorali, l'efficienza di conversione diminuisce a circa il 50%In particolare, la melanina ha un impatto sorprendente sull'efficienza della fotoconversione con una fotoconversione massima delle cellule positive CD45 osservata all'interno di tumori che producono melanina di appena il 30% nei tumori più piccoli, che scende al 10% man mano che i volumi tumorali si avvicinano ai 400 millimetri cubi.L'esame dei linfonodi che drenano il tumore 24 ore dopo la fotoconversione rivela la presenza di cellule immunitarie positive rosse Kaede di vari fenotipi, dimostrando così l'emigrazione dei leucociti dal tumore fotoconvertito. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per scoprire la cinetica dello stato stazionario e il turnover infiammato dei leucociti nel tessuto periferico. Durante il tentativo di questa procedura, è importante assicurarsi che solo il tessuto di interesse sia fotoconvertito, poiché la fotoconversione involontaria del tessuto circostante comprometterà i risultati.Gli individui nuovi a questo metodo dovrebbero ottimizzare il tempo di esposizione per la conversione del loro tessuto, così come la durata delle volte prima che si verifichi la raccolta dei tessuti in base alla dinamica del leucocita di interesse.

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Tecniche di imaging di recente sviluppate utilizzando fluorescenza nel vicino infrarosso (NIRF) può aiutare a chiarire il ruolo del sistema linfatico gioca in metastasi del cancro, la risposta immunitaria, la riparazione delle ferite, e altre malattie associate linfatico.

Non invasiva di imaging ottico del sistema vascolare linfatico di un mouse

Questo video mostra un test per il monitoraggio della migrazione delle cellule dendritiche a seguito di infezione del piede con Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guérin BCG nei topi. In caso di infezione batterica, le cellule DC cutanee attivate vengono marcate con un colorante a base di carbossifluoresceina diacetato succinimidil estere (CFSE) permeabile alle cellule. Dopo un intervallo adeguato per la migrazione delle DC al linfonodo popliteo drenante, le cellule linfonodali vengono...

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Questo protocollo descrive un metodo per la valutazione dettagliata dei sottogruppi di leucociti all'interno del microambiente tumorale in un modello tumorale di topo. Le cellule di melanoma B16 che esprimono chemerina sono state impiantate per via sottocutanea in topi singenici. Le cellule del microambiente tumorale sono state quindi colorate e analizzate mediante citometria a flusso, consentendo analisi dettagliate dei sottogruppi di leucociti.

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Viene descritto un test nei topi per tracciare la migrazione cellulare dalla pelle al linfonodo drenante che consente la caratterizzazione delle cellule dendritiche cutanee mobilizzate al linfonodo dopo l'infezione del cuscinetto del piede con Bacille Calmette-Guérin.

Un test CFSE-based per studiare la migrazione delle cellule dendritiche murini della pelle in drenanti linfonodi durante l&#39;infezione con<em&gt; Mycobacterium bovis</em&gt; Bacille Calmette-Guérin

Protocolli per la valutazione quantitativa della chemiotassi dei linfociti e la migrazione sono strumenti importanti per la ricerca in immunologia. Qui, un protocollo in vitro è descritto che permette in tempo reale, multiplexed valutazione della migrazione cellulare, così come un complementare in vivo tecnica abilitazione rilevamento di cellule native alla milza.

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Infiltrazione leucocita del muscolo Cremaster nei topi valutata dalla microscopia intravitale

Qui descriviamo un metodo preciso per raccogliere linfociti del dotto toracico e osservare la migrazione dei linfociti intestinali-tropici nelle chiazze del ratto Peyer per 3 ore usando la fotografia time-lapse. Questa tecnica può chiarire come la dinamica dei linfociti sia influenzata in condizioni infiammatorie.

Osservazione microscopica della dinamica dei linfociti nelle patch di Rat Peyer

Il melanoma è una malattia molto aggressiva che si diffonde rapidamente ad altri organi. Questo protocollo descrive l'applicazione dell'imaging ecografico ad altissima frequenza, abbinato al rendering 3D, per monitorare il volume dei linfonodi inguinali nel modello murino Braf/Pten del melanoma metastatico.

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Quantificazione del leucocita Egress tramite vasi linfatici dalla pelle murina e tumori

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