Uno studio di Immunohistopathologic per profilare il folato recettore Beta macrofago e microambiente vascolare immuni nella arterite a cellule giganti

Questo protocollo immunoistochimico e istopatologico può essere utilizzato per esaminare il recettore del folato beta, che è una proteina candidata con potenziale valore prognostico e terapeutico per il microambiente vascolare nell'arterite cellulare gigante. Questo protocollo è testato nel tempo e ampiamente utilizzato e può essere utilizzato per esplorare gli attributi beta del recettore del folato nei tessuti dell'arteria temporale, anche dopo la conservazione a lungo termine. Per acquisire sezioni tissutali, utilizzare un microtomo per tagliare sezioni spesse da quattro a cinque micrometri di arterie temporali incorporate in paraffina, galleggiando ogni sezione in un bagno d'acqua Celsius di 40 gradi man mano che si ottengono, per rimuovere le rughe.

Utilizzare diapositive al microscopio in vetro per catturare tre sezioni per diapositiva e riscaldare le diapositive su una piastra riscaldante, in un forno a 60 gradi Celsius per 60 minuti. Quando le sezioni hanno aderito alle diapositive, posizionare gli scivoli in un rack verticale per asciugare a 37 gradi Celsius per 24 ore. Il giorno successivo trasferire le diapositive in un contenitore di diapositive per l'archiviazione a quattro gradi Celsius per almeno 12 ore.

Successivamente, caricare le diapositive in un portasci e idratare i tessuti con due immersioni in xilene di cinque minuti e al 100% e una serie di immersione in etanolo discendente di cinque minuti per concentrazione, con 10 secondi di agitazione ogni 30 secondi. Dopo l'immersione al 70% di etanolo, sciacquare gli scivoli due volte in acqua doppia distillata per cinque minuti, con 10 secondi di agitazione ogni 30 secondi. Per il recupero dell'antigene, trasferire il rack in un contenitore di vetro con 200 microlitri di 95 gradi Celsius, 10 millimolare per litro tampone di citrato per 30 minuti.

Al termine dell'incubazione, lasciare raffreddare i vetrine a temperatura ambiente per 20 minuti prima di risciacquare con acqua corrente per cinque minuti. Per rimuovere l'attività endogena della perossidasi, utilizzare prima un marcatore idrofobico per disegnare un cerchio attorno a ciascun campione di tessuto, prima di incubare i campioni in 200 microlitri di perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti, seguito da 3 lavaggi in 200 micoliter di soluzione salina tris-tamponata, o TBSS, per lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, tamponare delicatamente ogni diapositiva per rimuovere qualsiasi tampone in eccesso e aggiungere 200 microlitri del cocktail di anticorpi primari di interesse e una scivolata di copertura ad ogni diapositiva per un'incubazione di un'ora in una camera umida a temperatura ambiente.

Al termine dell'incubazione, scartare le foglietti di copertura e risciacquare gli scivoli con tre lavaggi di due minuti in TBSS fresco. Dopo aver rimosso il tampone in eccesso, aggiungere 200 microlitri di un'appropriata soluzione anticorpale secondaria biotinilata e uno slittamento di copertura ad ogni diapositiva per un'incubazione di 45 minuti nella camera umida a temperatura ambiente. Dopo aver scartato le foglietti di copertura, sciacquare le diapositive con TBSS come dimostrato.

Rimuovere eventuali buffer in eccesso. Ed etichettare le sezioni con 200 microlitri di tampone di substrato DAB per 10 minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, lavare gli scivoli con TBSS e acqua corrente del rubinetto per 10 minuti, prima di contrastare con ematossilina per tre minuti.

Quindi, aggiungere 70 microlitri di un mezzo di montaggio appropriato a ogni diapositiva e puntare lentamente una striscia di copertura in vetro sul supporto di montaggio per evitare di creare bolle man mano che lo scivolo del coperchio viene abbassato in posizione. Per l'analisi istopatologica, posizionare lo scivolo sullo stadio di un microscopio luminoso e valutare l'architettura vascolare della prima sezione tissutale. Quindi, quantificare il numero di macrofagi rispetto al numero di linfociti per sezione.

Per l'analisi immunoistochimica, esaminare il modello di colorazione beta del recettore del folato su ogni sezione tissutale e quantificare il numero di cellule beta positive del recettore del folato, positive CD68 e CD3 in 10 campi ad alta potenza selezionati casualmente per sezione. La colorazione di ematossilina ed eosina in campioni normali rivela una normale anatomia arteriosa, con cellule endoteliali nell'intima tunica, cellule muscolari lisce nel supporto di tunica e una matrice di collagene eterogenea, che includono fibroblasti e vasi di alimentazione chiamati vasa vasorum nella tunica adventitia. Arterite cellulare gigante arterie temporali positive dimostrano un'infiammazione da moderata a grave, con aggregati e macrofagi, o istiociti, linfociti, cellule plasmatiche occasionali e cellule giganti multi-nucleate.

Si nota anche un restringimento luminale, accompagnato da ispessimento intimale e una rottura del 90% della lamina elastica interna. I linfociti positivi cd3 e i macrofagi positivi cd68 sono presenti anche in tutti gli esemplari positivi all'arterite cellulare gigante, con modelli di colorazione simili osservati in tutte le biopsie. La colorazione per il recettore del folato beta è limitata ai macrofagi e alle cellule giganti multi-nucleate che si localizzano preferenzialmente all'adventitia e ai media.

In particolare, il recettore beta del folato comprendeva circa il 30% dei macrofagi totali. La lavorazione, il taglio e la decessiazione dell'arteria temporale richiedono un'attenta destrezza per eseguire i passaggi successivi. L'interpretazione della diapositiva richiede l'esperienza di un patologo cardiovascolare esperto.

Ricordare agli spettatori di utilizzare precauzioni di contatto e respiratorie, come guanti e cappe ventilate, quando maneggiano campioni e reagenti.