Sequenze di molecole nascente Single-Stranded DNA virale durante HIV-1 e 3'-Termini determinante retrotrascrizione in cellule infettate
30 gennaio 2019
Qui presentiamo un metodo di sequenziamento profondo che fornisce una determinazione obiettiva della nascente 3'-termini nonché profili mutational di molecole di DNA single-stranded. L'applicazione principale è la caratterizzazione del nascente retrovirali DNAs complementare (cDNA), gli intermedi generati durante il processo di trascrizione inversa retrovirale.
Questo nuovo metodo per analizzare la trascrizione inversa può dirci cose nuove sul campo della virologia retrò. Ad esempio, possiamo conoscere i dettagli di come funzionano i fattori delle restrizioni cellulari o di come i farmaci antiretrovirali inibiscono la sintesi del DNA HIV1. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non solo fornisce informazioni sulla sequenza di nascenti trascrivi inversi, ma consente la mappatura dei loro precisi termini di DNA a 3 primi a singola risoluzione nucleare stretta.
L'arricchimento di DNA gratuito HIV1 dal DNA all'ingrosso delle cellule infette da HIV1, avviene mediante cattura ibrida e deve essere effettuato su una postazione di lavoro PCR. Preparare un mix principale di perline di streptavidina magnetica per tubo dirigendo un centinaio di microlitri di perline per campione in un unico tubo di microcentrofuga posizionare il tubo su un magnete adatto per tubi di micro centrifuga. Dopo che le perline si sono depositate verso il lato magnete del tubo, rimuovere il buffer di stoccaggio, rimuovere il tubo dal magnete e sospendere di nuovo le perline in cinquecento microlitri di lavaggio legante o tampone BW.
Riposizionare il tubo sul magnete, attendere che le perline migrino verso il magnete e rimuovere il supernatante. Rimuovere il tubo dal magnete, aggiungere cinquecento microlitri di soluzione di caseina, sospendere di nuovo le perline e incubare a temperatura ambiente per dieci minuti. Dopo dieci minuti, lavare le perline con tampone BW.
Riposizionare il tubo sul magnete, rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo le perline in cinquecento microlitri di tampone BW. Aggiungere cinquanta picomoli di ogni oligonucleotide biotinilato catturato per campione. Incubare a temperatura ambiente mentre si dondola in un mixer finale su fine per trenta minuti.
Quindi, riportare il tubo al magnete, rimuovere il supernatante, rimuovere il tubo dal magnete, aggiungere cinquecento microlitri di 1x dieci tampone e sospendere di nuovo le perline. Dopo il secondo lavaggio sospendere di nuovo le perline con gli oligonucleotidi immobilizzati in dieci microlitri di 1x dieci tampone per campione. Per ogni campione, etichettare un tubo di microcetrofugo e aggiungere dieci microlitri di sospensione di perline, centosettanta microlitri di DNA e novanta microlitri di tampone 3x ten.
Incubare in un blocco di calore secco a novanta due gradi Celsius per due minuti per denastiare il DNA. Spostare i tubi in un diverso blocco di calore secco, che è impostato su cinquantadue gradi Celsius, e incubare per un'ora. Ogni dieci minuti durante questa incubazione, invertire i tubi da mescolare.
Al termine dell'incubazione di un'ora, lavare le perline una volta con cinquecento microlitri di 1x dieci tampone e sospendere nuovamente in trentacinque microlitri di acqua priva di nucleasi. Assicurarsi che le perline si sistemino bene lasciando i tubi sul magnete per circa tre minuti prima di rimuovere qualsiasi liquido. Per eluire, incubare i tubi a novanta due gradi Celsius in un blocco di calore secco per due minuti.
Quindi, spostare rapidamente i tubi sul magnete, un tubo alla volta. Una volta che le perline sono legate al lato del tubo, trasferire il supernatante contenente il DNA hiv1 in un tubo fresco. Per iniziare questa procedura, sospendere l'adattatore lyophilized a cento micromolari in acqua priva di nucleasi e vortice del tubo.
Per campione, più un campione di controllo, combinare zero punti quattro cinque microlitri di tampone di ligasi del DNA T4 10x, quattro microlitri di adattatore e punto zero cinque microlitri di acqua libera da nucleasi. Riscaldare a novantanove gradi Celsius per due minuti, quindi lasciarlo raffreddare lentamente a sedici gradi Celsius in una macchina PCR. Ciò consentirà all'adattatore di formare una struttura di perni per capelli.
Il passo chiave di questa procedura è la legatura efficiente e imparziale di molecole adattate per aprire termini di DNA 3 primi. Le molecole di cDNA nascenti purificate di varia lunghezza sono legate ad un adattatore di DNA a singolo filamento di forcina usando la legasi del DNA T4. L'adattatore trasporta una sequenza casuale di codici a barre a sei nucleotidi, che consente il paring per facilitare la legatura e allo stesso tempo funge da identificatore per letture univoche.
L'adattatore termini a 3 primi porta un distanziale per prevenire l'autolegatura. Per impostare sessanta microlitri reazioni di legatura del volume finale, aggiungere quanto segue a ciascun tubo PCR:sei microlitri di tampone di ligasi del DNA T4 10x, ventiquattro microlitri di PEG quaranta per cento, sei microlitri di cinque betaine molare, quattro punti cinque microlitri di adattatore, un punto due microlitri di T4 DNA ligasi e diciotto punti te microlitri di DNA. Dopo aver mescolato bene le reazioni, incubare in una macchina PCR a sedici gradi Celsius durante la notte.
Il giorno dopo la legatura dell'adattatore, a trenta microlitri di formamide contenenti tampone di carico del gel di DNA ad ogni reazione di legatura e mescolare bene per testa del tubo. Riscaldare in una macchina PCR a novantaquattro gradi Celsius per due minuti, quindi mettere immediatamente sul ghiaccio. Il prossimo passo è prepararsi per denaturare l'elettroforesi del gel.
Mettere un gel di poliacrilammide tbe pre-colato al 6% in un serbatoio di gel appropriato e aggiungere 1 tampone di funzionamento TBE. Pre-eseguire il gel per venti minuti. Successivamente, utilizzare una siringa e un ago calibro ventuno per lavare le tasche in gel con tampone di corsa.
Quindi caricare trenta microlitri per pozzo dello stesso campione in tre pozzi. Si consiglia di eseguire un solo campione per gel per evitare la contaminazione incrociata. Corri per venti minuti.
Mentre il gel è in funzione, preparare tre tubi di microcentrifugo a zero punti cinque millilitri per campione utilizzando un ago a siringa a ventuno calibro per colpire i fori nel fondo. Inserire ciascuno dei tubi preparati in un tubo di micro centrifuga a due millilitri ed etichettarli con il nome del campione più basso, medio o alto. Quando il fronte di tintura blu scuro è a circa metà del gel, fermare l'elettroforesi e rimuovere la cassetta di gel.
Aprire la cassetta e tagliare il gel verticalmente con una lama di rasoio. Asportare generosamente la striscia con tre pozzi di campioni caricati. Aggiungere la striscia di gel a un contenitore con 1 TBE e cinque microlitri di macchia di acido nucleico di cianina e incubare per tre o cinque minuti.
Assicurarsi che la colorazione sia sufficiente per identificare facilmente la parte superiore dell'adattatore libero che deve essere rimossa in seguito. Quindi, pulire accuratamente la superficie di un transilluminatore a luce blu con acqua de ionizzata distillata. Quindi eseguire il pezzo di gel dal contenitore di colorazione e posizionarlo sulla scatola luminosa.
Accendere la scatola luminosa e ispezionare gli acidi nucleici macchiati attraverso il filtro arancione. Un campione rappresentativo di DNA legato su un gel macchiato, è mostrato qui. L'adattatore in genere appare sovraccarico e funziona come un grande blob con DNA legato HIV1 che corre sopra come una striscia.
Le linee rosse indicano i siti in cui il gel deve essere tagliato per rimuovere l'adattatore libero e dividere il campione in tre pezzi pari. Utilizzando un nuovo razorblade, tagliare i lati del gel se ci sono aree senza campione caricato ancora presente. Quindi, tagliare appena sopra l'adattatore per rimuovere l'adattatore e le parti inferiori in gel.
Infine, tagliare la parte superiore del gel, compresi circa un millimetro delle tasche in gel che spesso hanno un segnale intenso e acuto di DNA a peso molecolare più elevato. Dividere il pezzo di gel rimanente contenente il campione orizzontalmente in tre pezzi pari. Aree a basso, medio e alto peso molecolare.
Quindi, tagliare ciascuno dei tre frammenti di gel in due per due pezzi millimetrici e trasferirli nei tubi di microcentrifugo a cinque millilitri a punto zero preparati. Gira alla massima velocità con coperchi aperti per un minuto. Per spremere i pezzi di gel attraverso il foro nel tubo dei due millilitri per creare una granita di gel.
Se alcune particelle di gel rimangono nella parte inferiore del tubo a cinque millilitri a punto zero, trasferirle manualmente sul tubo dei due millilitri usando un ago. Inizia la procedura di estrazione del DNA aggiungendo un millilitro di tampone di estrazione del gel di urea alla granita di gel in ogni tubo di microcentrifugo. Ruotare i tubi con un miscelatore end-over-end a temperatura ambiente per un minimo di tre ore.
Preparare le colonne del filtro. Utilizzare un set pulito di pinzette per aggiungere un piccolo filtro rotondo in fibra di vetro a ogni colonna di centrifuga con filtri a membrana in acetato di cellulosa, che impedisce l'intasamento della membrana. Mettere il filtro in posizione con una punta della testa del tubo rovesciata.
Ruotare brevemente i due tubi millilitri con fango di gel e tampone di estrazione in un microcentrifugo e trasferire settecento microlitri del supernatante alle colonne filtranti preparate. Centrifugare le colonne filtranti in un microcentrifugo alla massima velocità per un minuto. Quindi trasferire il flusso attraverso un nuovo tubo di microcentrifugo a due millilitri.
Ricaricare le colonne con il supernatante rimanente. Cerca di ottenere il più liquido possibile dalla granita di estrazione e non preoccuparti se sono inclusi pezzi di gel. Gira di nuovo.
Combinare il flusso attraverso gli stessi campioni di estrazione e procedere come descritto nel protocollo di testo. Questo protocollo è stato utilizzato in campioni di cellule CEMS-ST infettate da HIV-1 affetto da Vif in assenza o presenza della proteina umana antiretrovirale A3G. Un grafico del numero totale di letture univoce ottenute da ogni campione indica che l'aumento dei livelli di A3G riduce il numero totale di lettura.
Riflettendo l'effetto inibitorio dell'A3G sulla sintesi mediata della cdna della transcriptasi inversa. In questi tre grafici successivi, la frazione di molecole ad ogni lunghezza possibile all'interno dei primi centoottoci due nucleotidi, è mostrata negli istogrammi blu. L'aggiunta di A3G è costata un forte aumento di molecole di cdna troncate più corte in alcune posizioni riproducibili molto specifiche.
Le linee rosse tratteggiate mostrano le percentuali di letture che portano mutazioni da C a T nella rispettiva posizione. Un controllo positivo può essere prodotto elaborando un pool di oligonucleotidi sintetici di sequenza, lunghezza e concentrazione del sapere. Tutte le molecole dovrebbero apparire in abbondanza quasi uguale con solo piccole variazioni.
Se un'esecuzione di libreria produce una distorsione di lunghezza minore, nel sequenziamento, è consigliabile applicare un fattore di normalizzazione derivato dalla pendenza che rappresenta la distorsione delle dimensioni. Questa procedura può essere prontamente adattata ad altri sistemi in cui determinare le tre estremità principali delle molecole di DNA aggiungerebbe approfondimenti chiave sulle are del metabolismo degli acidi nucleici. Si prega di non dimenticare che lavorare con l'HIV può essere estremamente pericoloso e alcune infezioni dovrebbero essere eseguite solo in laboratori di sicurezza designati.
Panoramica
Questo articolo presenta un nuovo metodo di sequenziamento in profondità che consente la determinazione imparziale dei 3'-termini nascenti e dei profili mutazionali del DNA a singolo filamento. La tecnica è particolarmente utile per caratterizzare i DNA complementari (cDNA) retrovirali nascenti generati durante la retrotrascrizione retrovirale.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Virologia
- Genomica
- Biologia molecolare
Contesto
- Comprendere la retrotrascrizione è cruciale nella retrovirologia.
- I fattori di restrizione cellulare e i farmaci antiretrovirali influenzano la sintesi del DNA dell'HIV-1.
- I metodi attuali possono mancare di precisione nella mappatura dei termini del DNA.
- Il sequenziamento in profondità può fornire approfondimenti dettagliati sui profili del cDNA virale.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo per la mappatura precisa dei cDNA retrovirali nascenti.
- Migliorare la comprensione dei meccanismi di retrotrascrizione.
- Facilitare lo studio dell'HIV-1 e delle sue interazioni con i fattori dell'ospite.
Metodi utilizzati
- Cattura ibrida per l'arricchimento dei cDNA dell'HIV-1 da cellule infette.
- Uso di perline di streptavidin magnetiche per la purificazione del DNA.
- Legatura del cDNA ad adattatori a capello di spillo per il sequenziamento.
- Elettroforesi su gel denaturante per l'analisi dei prodotti cDNA.
Risultati principali
- Il metodo mappa con successo i 3'-termini dei cDNA nascenti.
- Fornisce informazioni sull'efficienza della retrotrascrizione.
- Identifica letture uniche attraverso le sequenze di barcode negli adattatori.
- Dimostra il potenziale per studiare la sintesi del DNA dell'HIV-1 in dettaglio.
Conclusioni
- Questa tecnica offre uno strumento potente per la ricerca retrovirale.
- Migliora la nostra comprensione dei processi di replicazione virale.
- Le applicazioni future potrebbero includere lo studio dei meccanismi di resistenza ai farmaci.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
This method enables precise mapping of nascent viral DNA 3'-termini and mutation profiles, providing mechanistic insights into antiviral compound effects and host restriction factors on reverse transcription. By capturing single-nucleotide resolution data within infected cells, it supports target validation and lead identification in antiviral discovery. The assay enhances predictive confidence by linking molecular mechanisms to functional outcomes in viral DNA synthesis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by defining how cellular restriction factors or antiretroviral compounds alter reverse transcription intermediates.
- Operational Value: Enables functional target validation through quantitative measurement of nascent cDNA abundance and truncation patterns.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by identifying compounds that induce specific, reproducible truncation signatures in viral DNA synthesis.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated viral DNA systems for downstream screening by enriching and barcoding nascent cDNAs for high-resolution sequencing.
- Operational Value: Standardizes detection of 3'-end variations and internal mutations, enabling reproducible compound screening across laboratories.
- Scalability: Facilitates platform reuse through adaptor barcoding and deep sequencing compatibility for high-throughput applications.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects mechanistic findings from infected cells to preclinical models by defining dose-dependent effects of compounds on reverse transcription efficiency.
- Biomarker Alignment: Links specific truncation patterns and mutation frequencies to pharmacological activity, supporting biomarker-driven decision making.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by revealing off-target effects on nucleic acid metabolism that may predict toxicity or resistance.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation through lead identification to preclinical evaluation, enabling iterative refinement of antiviral candidates based on mechanistic de-risking.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by mapping how perturbations in host factors or drugs alter the length distribution and sequence fidelity of nascent cDNAs.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs on cDNA abundance and truncation, enabling reliable comparison of compound effects across conditions.
- Analytics: Generates barcode-linked sequencing reads that allow precise quantification of full-length and truncated species, facilitating structure-activity relationship analysis.
- Translational Research: Connects in vitro findings to preclinical relevance by demonstrating how host proteins like A3G shift cDNA synthesis toward abortive intermediates.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for studying nucleic acid extension mechanisms applicable to other retroviruses or DNA repair pathways.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in viral DNA synthesis pathways.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility through hybrid capture, adaptor ligation, and gel-based size fractionation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early detection of compounds that induce non-productive reverse transcription, reducing late-stage failure risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by identifying molecules that modulate specific, measurable steps in cDNA synthesis.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid biochemistry, hybrid capture, and deep sequencing data analysis.
- Depends on access to magnetic bead handling equipment, PCR machines, and denaturing gel electrophoresis systems.
- Necessitates cross-team standardization of adaptor ligation conditions and gel excision protocols to ensure inter-laboratory consistency.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-retroviral systems with different nucleic acid structures or abundance.
- Includes practical limitations such as the need for known template sequences and potential biases in ligation efficiency that require normalization.
