Name: Analisi proteomica di polarizzazione di macrofago umano in un ambiente a basso tenore di ossigeno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 15 s
Description: Impara l'analisi proteomica dei macrofagi umani in condizioni ipossiche per caratterizzare gli stati di attivazione cellulare. Questo metodo con quantificazione label-free aiuta a studiare la polarizzazione macrofagica.

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AM è finanziato dal programma Leader di gruppo di giovani (ATIP/Avenir Inserm-CNRS), la Ligue Nationale contre le Cancer e la ARC Fondation pour la recherche sur le Cancer. Ringraziamo Mariette Matondo dalla spettrometria di massa per la piattaforma di biologia (UTECHS MSBIO, Istituto Pasteur, Parigi). Ringraziamo Lauren Anderson per la sua lettura del manoscritto.

Campioni di sangue umano (LRSC) da donatori sani, de-identificati sono stati ottenuti da EFS (servizio nazionale di sangue francese) come parte di un protocollo autorizzato (CODECOH DC-2018 – 3114). I donatori hanno dato il consenso firmato per l'uso di sangue.
1. Media e preparazione di Buffer
<ol><li>Preparare il supporto di macrofago [glutamax RPMI + 10 mM HEPES + 1 x aminoacidi non essenziali (NEAA)] e riscaldarla a 37 ° C.</li>
	<li>Preparare il macrofago medium + 10% di siero umano dal plasma AB (SAB), filtrare (filtro di 0,22 µm), poi riscaldarla a 37 ° C (indicato come macrofago medium + 10% SAB in appresso).</li>
	<li>Preparare il tampone di ordinamento [1 x tamponato fosfato salino (PBS) + 0,5% albumina di siero bovino (BSA) + acido etilendiamminotetracetico 2mm (EDTA)], filtrare (filtro di 0,22 µm) e mantenerla a 4 ° C.</li>
</ol>2. isolamento di cellule mononucleari del sangue periferico (PBMCs) dalla camera di Leukoreduction System (LRSC)
<ol><li>Mettere 15 mL di soluzione di separazione cellulare gradiente di densità (Vedi Tabella materiali) in un mL 50 centrifugazione tubo quindi può scaldare a temperatura ambiente (TA) prima di ricevere il LRSC. Nota: Densità dipende dalla temperatura. Come questo prodotto è conservato a 4 ° C, questo passaggio deve essere fatto in anticipo in modo che può equilibrare a RT.</li>
	<li>Svuotare il LRSC in una provetta di centrifugazione di 50 mL, aggiungere fino a 50 mL di PBS 1X e mescolare. Molto lentamente, aggiungere 25 mL della miscela preparata durante passaggio 2.2 sopra 15 mL di soluzione di gradienti di densità riscaldato durante passaggio 2.1. Nota: Fare attenzione a non mescolare le fasi durante questo passaggio. Il sangue deve essere aggiunto alla soluzione gradienti di densità senza alcuna dispersione di questa fase.</li>
	<li>Centrifugare entrambi tubi di centrifugazione per 25 min a 700 x g senza interruzioni. Nota: Al termine della centrifugazione in gradiente di densità, gli strati dal basso verso l'alto sono: gli eritrociti e granulociti formando il pellet, fase di soluzione gradienti di densità, strato di PBMCs e nel plasma.</li>
	<li>Con una pipetta, passare attraverso la fase di plasma senza aspirazione si e raccogliere lo strato PBMC in un nuovo tubo di centrifugazione di 50 mL. Aggiungere fino a 50 mL di 1X PBS in PBMCs come una fase di lavaggio e centrifugare per 10 minuti a 300 x g.</li>
	<li>Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 40 mL di terreno del macrofago.</li>
</ol>3. magnetico etichettatura e isolamento di CD14+ cellule (monociti)
<ol><li>Contare i PBMCs in una camera di Malassez. Prelevare la quantità di PBMCs necessarie per condurre l'esperimento (in genere 100-300 x 106 cellule), inserirli in un tubo di centrifugazione e centrifugare per 10 minuti a 300 x g.</li>
	<li>Aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 80 µ l di buffer di ordinamento preparato durante il passaggio da 1.3 a 107 PBMCs. aggiungere 20 µ l di microsfere di CD14 ogni 107 PBMCs. Mix ed incubare per 15 min a 4 ° C sotto agitazione costante.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di tampone a 107 PBMCs di ordinamento come una fase di lavaggio e centrifugare per 10 minuti a 300 x g. aspirare il supernatante e risospendere il pellet in 500 µ l di tampone per 108 PBMCs di ordinamento.</li>
	<li>Posto una colonna nel campo magnetico del separatore. Preparare la colonna sciacquandolo con 3 mL di tampone di ordinamento.</li>
	<li>Applicare la sospensione cellulare sulla colonna. La colonna dipende dal numero di cellule per essere isolato (qui, LS colonne per fino a 109 PBMCs vengono utilizzate). Raccogliere il flusso continuo contenenti celle adenoide. Nota: A partire da questo passaggio, tutti i tubi (selezioni positivi e negativi) sono conservati per più tardi il controllo delle diverse fasi tramite flusso cytometry.</li>
	<li>Lavare la colonna con 3 x 3 mL di tampone di ordinamento. Raccogliere le cellule senza etichetta, passando attraverso il tubo stesso dal passaggio 3.12. Eseguire i passaggi di lavaggio dal buffer di ordinamento aggiungendo, essere attenti a non far asciugare la vostra colonna. Posizionare un tubo di raccolta sotto la colonna e rimuoverlo dal separatore.</li>
	<li>Pipettare 5 mL di tampone di ordinamento nella colonna. Sciacquare immediatamente le cellule magneticamente con etichetta premendo saldamente lo stantuffo nella colonna. Per aumentare la purezza del CD14+ cellule, la frazione eluita è arricchita nel corso di una seconda colonna.</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 3.4 a 3.7 con una nuova colonna.</li>
</ol>4. placcatura dei monociti
<ol><li>Contare i monociti in una camera di Malassez. Verificare la purezza del CD14+ cellule tramite flusso cytometry. Prelevare la quantità di monociti necessari per l'esperimento e metterli in un tubo di centrifugazione.</li>
	<li>Centrifugare per 10 minuti a 300 x g. aspirare il supernatante e risospendere il pellet di monociti nel mezzo del macrofago. Le cellule del piatto e lasciarli accontentarsi di 50 min a 1 h. aspirare il mezzo e sostituirlo con il mezzo di macrofago + 10% SAB + 25 ng/mL del macrofago stimolante le colonie di fattore (M-CSF) per indurre la differenziazione.</li>
</ol>5. polarizzazione dei macrofagi al giorno 6
<ol><li>Aspirare il mezzo. Sostituirlo con del macrofago medium + 10% SAB con vari stimoli. Ad esempio, aggiungere 10 ng/mL interferone gamma (INFγ) + 1 ng/mL lipopolysaccharide (LPS) per ottenere la polarizzazione M1, o 20 ng/mL interleuchina 4 (IL4) + 20 ng/mL interleuchina 13 (IL13) per polarizzazione M2. Nota: La stimolazione può essere eseguita tra 24 e 48 h prima di procedere ad altri test.</li>
	<li>Raccogliere le cellule utilizzando una soluzione distaccante o un raschietto di cella.</li>
</ol>6. cella cultura in condizioni di ossigeno basso
<ol><li>A partire dal passaggio 4, mantenere i monociti e quindi macrofagi in un ambiente di ossigeno controllato per eseguire l'analisi in condizioni di ipossia. Utilizzare una stazione di lavoro di ipossia per mantenere le cellule sotto la pressione parziale di ossigeno desiderata durante l'esperimento. Nota: Quando si lavora sotto pressione bassa dell'ossigeno, è importante preparare tutti i supporti e buffer di lavaggio sotto la stazione ed attendere sufficientemente per ottenere la corretta pressione parziale nel liquido. Ad esempio, 10 mL di PBS in un 60mm di Petri richiede circa 2 ore per raggiungere 25 mmHg per la pressione parziale di O2 a partire da pressioni atmosferiche (come abbiamo misurato utilizzando un sensore a fibra ottica). In molte stazioni ipossiche o incubatori, la pressione dell'ossigeno è impostata come una percentuale della pressione atmosferica. Se le misure precise sono necessari, è preferibile utilizzare una stazione che autorizza per impostare direttamente la pressione dell'ossigeno in mmHg.</li>
</ol>7. Lisi e digestione In-Gel (protocollo 1)
Nota: In questa e nelle sezioni seguenti, sono descritti due protocolli utilizzati per ottenere peptidi ed eseguire analisi LC-MS/MS. Protocollo n. 1 vengono descritti lisi cellulare e frazionamento in gel e digestione e protocollo 2 lisi delle cellule in soluzione, seguita da digestione in soluzione e frazionamento utilizzando un metodo di messa a fuoco isoelettrico.
<ol><li>Eseguire lisi cellulare nel Laemmli buffer [234 mM Tris-HCL (pH 6,8), 7,5% SDS, 37% glicerolo, 33,3% (v/v) β-mercaptoetanolo, blu di bromofenolo 0,2% p/v]. Caricare l'equivalente proteico di 300.000 cellule per ogni campione su gel di acrilammide bis-Tris di 4-12%.</li>
	<li>Controllare la durata della migrazione elettroforetica per consentire ogni campione della proteina sia suddiviso in 6 gel bande come esemplificato nella Figura 3.</li>
	<li>Fissare il gel con una soluzione di fissaggio (30% etanolo + acido acetico 7.5% per 20 min), quindi aggiungere la soluzione colorante (R-250 Coomassie blu per 45 min). Aggiungere la soluzione decolorante (30% etanolo + 7,5% acetico finché non vengono visualizzate bande) prima di asportare le bande proteiche con un bisturi pulito.</li>
	<li>Tagliare a dadini ogni banda asportato prima introduzione in tubi di 500 µ l. Una superficie di vetro pulita è autorizzata per evitare la contaminazione con le cheratine (soluzione SDS al 5% in acqua deionizzata può essere utilizzato per pulire le superfici).</li>
	<li>Lavare le fette del gel 3 volte in 200 µ l di bicarbonato di ammonio di 25 mM per 20 min a 37 ° C, seguita da un lavaggio in bicarbonato di ammonio di 25 mM e acetonitrile (50% v/v). Disidratare i pezzi di gel con 200 µ l di acetonitrile 100% per 10 min.</li>
	<li>Incubare ogni pezzo di gel con 10 mM DTT (dithiothreitol) in bicarbonato di ammonio di 25mm per 45 min a 56 ° C (200 µ l), seguita da iodoacetamide 55 mM a 25 mM di bicarbonato di ammonio (200 µ l) per 35 min al buio a TA.</li>
	<li>Per interrompere alchilazione, Incubare ogni pezzo di gel con 200 µ l di 10 mM DTT in bicarbonato di ammonio di 25 mM per 10 min a RT. Wash i pezzi di gel in 200 µ l di bicarbonato di ammonio di 25 mM, quindi disidratare con 200 µ l di acetonitrile 100% per 10 min.</li>
	<li>Digerire le proteine durante la notte a 37 ° C con tripsina/Lys-C mix secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Estrarre i peptidi risultanti da pezzi gel aggiungendo 50 μL di 50% acetonitrile per 15 minuti, poi 50 μL di acido formico al 5% per 15 min e infine, 50 μL di 100% acetonitrile per 15 min. piscina e asciugare ogni frazione in tubi di basso assorbimento per limitare l'assorbimento dei peptidi e perdita del campione. Conservare i campioni a-80 ° C fino a ulteriori analisi.</li>
</ol>8. proteine estrazione e digestione In soluzione (protocollo n. 2)
<ol><li>Eseguire la lisi cellulare (2 x 106 cellule) con 150 µ l di buffer di lisi seguenti:<ol>
<li>7m urea, 2m tiourea, 40 mM Tris e 4% CHAPS, completati con inibitori della proteasi (mini completa, inibitore della proteasi EDTA-free cocktail).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Omogeneizzare le soluzioni per 30 min a RT con un agitatore. Centrifugare a 13.800 x g per 20 min RT e mantenere il supernatante.</li>
	<li>Rimuovere i contaminanti con un kit di pulizia 2D:<ol>
<li>Il kit contiene soluzione precipitante, soluzione co-precipitante, tampone di lavaggio e lavaggio additivo.</li>
		<li>Aggiungere 300 µ l di soluzione precipitante e mescolare bene. Incubare in ghiaccio per 15 min. aggiungere 300 µ l di soluzione di co-precipitante. Centrifugare le provette (almeno) a 12.000 x g per 5 min. Una piccola pallina dovrebbe essere visibile. Procedere rapidamente alla fase successiva per evitare risospensione o dispersione del pellet. Rimuovere il sopranatante senza disturbare il pellet.</li>
		<li>Centrifugare le provette nuovamente con il tappo-cerniera e pellet rivolta verso l'esterno per portare il liquido rimanente alla parte inferiore del tubo. Un breve impulso è sufficiente. Non ci dovrebbe essere nessun liquido rimanente visibile nei tubi.</li>
		<li>Senza disturbare il pellet, aggiungere 40 µ l di soluzione di co-precipitante. Lasciate che il tubo di sedersi sul ghiaccio per 5 min. Centrifugare per 5 minuti, quindi rimuovere e scartare il lavaggio. Aggiungere 25 µ l di acqua deionizzata. Vortexare ciascuna provetta per 5-10 s. Il pellet dovrebbe disperdersi ma non si dissolve in acqua.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di tampone di lavaggio (pre-raffreddato per almeno 1 h a-20 ° C) e 5 µ l di additivo di lavaggio. Vortice fino a quando la pallina è completamente dispersa. Incubare le provette a-20 ° C per almeno 30 min. Vortex per 20-30 secondi ogni 10 min Nota: I tubi sono memorizzabili a-20 ° C fino a 1 settimana con degradazione minima della proteina o la modifica.</li>
		<li>Centrifugare le provette (almeno) a 12.000 × g per 5 min. con attenzione rimuovere e scartare il surnatante. Una pallina bianca dovrebbe essere visibile. Lasciar il pellet airdry per non più di 5 min (se troppo asciutto, che sarà difficile risospendere il pellet).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Risospendere il pellet di proteina in 300 µ l di bicarbonato di ammonio di urea e 0,1 M 8 M. Vortice fortemente per 1 min. determinare la concentrazione di proteine utilizzando un saggio colorimetrico.</li>
</ol>9. in-soluzione digestione (protocollo n. 2)
<ol><li>Ridurre i ponti disolfuro aggiungendo 5,1 µ l di una soluzione acquosa di 700 mM DTT (concentrazione finale 12,5 mM) per le proteine sedimento da passaggio di 8,4 e incubare a 37 ° C per 30 min con un agitatore. Alchilata residui di cisteina aggiungendo 20,3 µ l di una soluzione acquosa di iodoacetamide 700mm (concentrazione finale 40 mM) e incubando a 25° C per 30 min al buio con un agitatore.</li>
	<li>Aggiungere 990 µ l di bicarbonato di ammonio 0,1 M al campione. Aggiungere un volume corrispondente di tripsina/Lys-C mix (substrato enzimatico: rapporto 1: 100 w/w). Incubare a 37° C durante la notte con un agitatore.</li>
</ol>10. pulizia cartuccia (protocollo n. 2)
<ol><li>Bagnare una cartuccia con 1 colonna-volume (1 mL) di metanolo. Pulire la cartuccia con 1 colonna-volume (1 mL) di acqua di 80% acetonitrile/HPLC-grado e scartare il flusso continuo. Equilibrare la cartuccia con 4 colonna-volumi (4 mL) di acqua di acido formico/HPLC-grado di 0,1% e scartare il flusso continuo.</li>
	<li>Acidificare campioni con 90 µ l di acqua a pH 2-3 (controllare il pH con un indicatore di pH) o 10% acido formico. Caricare i campioni acidificati e raccogliere il flusso continuo. Ricaricare il flusso continuo (contenente i peptidi non-mantenuta). Lavare la cartuccia con colonna-volume 6 (6 mL) di acqua di acido formico/HPLC-grado di 0.1%.</li>
	<li>Eluire peptidi dalla cartuccia con 1 colonna-volumi (1 mL) di acqua di acetonitrile/HPLC-grado acid/50% formico 0.1%. Trasferire in una provetta di microcentrifuga da 1,5 mL. Concentrare il campione utilizzando un concentratore a vuoto (150 x g, vuoto a 160 mBar).</li>
</ol>11. frazionamento mediante focalizzazione isoelettrica (protocollo n. 2)
Nota: I peptidi sono separati secondo loro punti isoelettrici utilizzando un frazionatore di gel off su una striscia di 13 cm che copre un range di pH da 3 a 10. Abbiamo usato il seguente protocollo fornito dal fornitore (riassunto di seguito):
<ol><li>Preparare le seguenti soluzioni: soluzione (600 µ l di soluzione di glicerolo, 60 µ l di tampone OFFGEL, 4,34 mL di acqua ultrapura) e soluzione B (1,776 mL di soluzione A) e 444 µ l di acqua ultrapura.</li>
	<li>Assemblare le strisce IPG, cornici ed elettrodi secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Risospendere il campione con 1,8 mL di soluzione B. aggiungere 40 µ l di soluzione B in ciascun pozzetto. Caricare 150 µ l di campione in ciascun pozzetto.</li>
	<li>Selezionare il metodo di default per i peptidi: OG12PE00 (metodo di default OFFGEL per peptidi per l'utilizzo con un 3100 OFFGEL Low Res Kit, pH 3-10, 12-pozzetti fotogrammi. Attendere che questo metodo è stato completato (~ 20 h). Raccogliere le frazioni in tubi correttamente etichettati.</li>
</ol>12. pulizia Harvard Apparatus colonna inversa C18 Post-IEF (protocollo n. 2)
<ol><li>Aggiungere progressivamente μL pochi alla volta dell'1% TFA in acqua deionizzata per ogni frazione di acidificare il campione. Verifica tramite carta di pH il pH è circa 3 o inferiore.</li>
	<li>Preparare le seguenti soluzioni: soluzione 1 (5 mL di acetonitrile, 10 µ l di acido formico, 4,99 mL di acqua ultrapura) e soluzione 2 (0,5 mL di acetonitrile, 10 µ l di acido formico, 9,49 mL di acqua ultrapura).</li>
	<li>Pre-bagnato la colonna di spin con 150 µ l di soluzione 1. Centrifuga per 90 s 750 x g e scartare il flusso continuo. Lavare la colonna di spin con 150 μL di soluzione 2. Centrifuga per 90 s 750 x g e scartare il flusso continuo.</li>
	<li>Passare la frazione attraverso la colonna. Centrifuga per 90 s 750 x g e scartare il flusso continuo. Lavare con 150 μL di soluzione 2. Centrifuga per 90 s 750 x g e scartare il flusso continuo.</li>
	<li>Eluire la frazione con 50 μL di soluzione 1. Centrifuga per 90 s a 750 x g. Ripetere la procedura una volta di più.</li>
	<li>A secco-frazione utilizzando un concentratore a vuoto (150 x g, vuoto 160 mBar) e conservare a-80 ° C</li>
</ol>13. analisi dei dati di proteomica e bioinformatica18
<ol><li>Analizzare i dati ottenuti da un nano-LC-MS/MS utilizzando il motore di ricerca di Andromeda e quantificazione software come MaxQuant (versione 1.5.2.8) di spettrometro di massa.</li>
	<li>Impostare tasso di falsi scoperta (FDR) all'1% per una lunghezza minima di 7 aminoacidi e proteine e peptidi. Impostare la specificità degli enzimi come C-terminale di Arg e Lys. Consentire 2 fenditure perse alle obbligazioni di prolina. Selezionare carbamidomethylation di cisteina come una variante fissa e ossidazione N-terminale della proteina acetilazione e metionina come variabile modifiche.</li>
	<li>Analizzare ulteriormente i dati con software di analisi statistica. Eseguire un'analisi di arricchimento funzionale utilizzando il software FunRich (www.funrich.org/). Eseguire un'analisi di arricchimento di ontology del gene utilizzando software di DAVID (https://david.ncifcrf.gov/).</li>
</ol>

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<li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nature Protocols. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li>
<li>Court, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+standardized+urine+proteome+analysis+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Toward a standardized urine proteome analysis methodology.</a> Proteomics. 11 (6), 1160-1171 (2011).</li>
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</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Perché la proteomica è un potente strumento per studiare l'espressione di proteine differenti da una cellula intera o compartimenti subcellulari, ottimizzazione del protocollo lisi cellulare e digestione delle proteine è stati affrontati da una serie di studi. Ci sono tre classi principali di metodi, che includono la digestione in-gel (digestione delle proteine nella matrice del gel di poliacrilammide)17, digestione in soluzione18 e filtro-aided campione preparazione<sup cl...

I macrofagi sono cellule dell'immunità innata coinvolti in una serie di funzioni fisiologiche che vanno dalle risposte agli agenti patogeni infettivi all'omeostasi del tessuto, compresa la rimozione delle cellule apoptotiche e rimodellamento della matrice extracellulare1. Queste cellule sono caratterizzate da una forte plasticità fenotipica2 che si traduce in un molti Stati di attivazione possibili, che sono anche chiamati polarizzazioni. La precisa descrizione molecolare di queste varie polarizzazioni è una priorità nel campo della biologia di macrofago3. È stato proposto di classificare queste polarizzazioni utilizzando la cosiddetta dicotomia M1/M2, in cui M1 rappresenta pro-infiammatorie e M2 rappresenta i macrofagi infiammatori. Questo modello si adatta bene in varie situazioni patologiche, come le infezioni acute, l'allergia e l'obesità4. Tuttavia, in tessuti cronicamente infiammati e cancro, è stato dimostrato che questa classificazione è in grado di cogliere il vasto repertorio fenotipico che i macrofagi presentano in determinati ambienti cellulari5,6, 7. il consenso corrente è che la polarizzazione del macrofago è meglio descritto utilizzando un modello multidimensionale di integrare segnali specifici microambientali8. Questa conclusione è stata confermata attraverso l'analisi trascrittomica dei macrofagi umani, mostrando che il modello M1/M2 è inefficiente nel descrivere le polarizzazioni ottenuti9.
Lo studio presentato si propone di fornire un protocollo per ottenere le firme di proteomica di varie polarizzazioni in macrofagi umani. Descriviamo come differenziare i macrofagi umani negli ambienti dei vari livelli di ossigeno e ottenere peptidi dal macrofago intero proteoma per eseguire una quantificazione privo di etichetta. Questa quantificazione permette il confronto dei livelli di espressione di varie proteine. Come la ricerca sulle cellule staminali ha rivelato l'importanza di ossigeno come un parametro chiave ambientale10, cerchiamo di capire come questo parametro di tessuto può influenzare la polarizzazione del macrofago in esseri umani. La pressione parziale di ossigeno è stata trovata per gamma da 3 a 20% (del totale pressione atmosferica) nel corpo umano, dove il 20% corrisponde approssimativamente a quello comunemente usato in un'incubatrice di coltura cellulare (il valore esatto è di circa 18,6% durante l'assunzione di presenza di acqua in considerazione).
Il lavoro precedente ha indicato che alveolare differiscono dai macrofagi interstiziali da funzionale e morfologica punto di vista11 e che queste differenze sono probabilmente parzialmente dovuto i livelli di ossigeno differente a cui sono esposte12. Inoltre, derivate da midollo osseo macrofagi mostrano una maggiore capacità di phagocytize batteri quando esposti ad un ambiente di ossigeno basso12. L'effetto opposto è stato trovato per macrofagi umani differenziati THP113, ma questi risultati sostengono l'idea che l'ossigeno è un regolatore della biologia del macrofago e che è necessario chiarire questo ruolo a livello molecolare in macrofagi umani. In uno studio precedente, abbiamo applicato un approccio di proteomica per risolvere questi problemi. Misurando i livelli di espressione di migliaia di proteine contemporaneamente, abbiamo messo in evidenza l'impatto di ossigeno sulla polarizzazione e fornito un elenco di nuovi marcatori molecolari. Siamo stati anche in grado di correlare questi risultati per alcune funzioni di macrofagi. In particolare, abbiamo trovato che il tasso di fagocitosi delle cellule apoptotiche aumentava nei macrofagi IL4/IL13-polarizzato, che era legato al upregulation di ALOX15, come rivela l' analisi proteomica14. Nello studio presente, descriviamo come effettuare tale analisi.

<table><tbody><tr><td>Stazione di lavoro per ipossia</td><td>Oxford Optronix</td><td>Hypoxylab</td><td></td></tr><tr><td>C6 Citometro a flusso</td><td>BD</td><td>Accuri C6</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Agilent Technologies</td><td>5188-6435</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico (FA)</td><td>ARISTAR</td><td>450122M</td><td></td></tr><tr><td>R-250 Coomassie blue</td><td>Biorad</td><td>1.610.436</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisaccaride, E.Coli (LPS)</td><td>Kit di pulizia 2D Calbiochem</td><td>437627</td><td></td></tr><tr><td></td><td>GE Healthcare</td><td>80-6484-51</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium, integratore di glutamax</td><td>Gibco</td><td>61870044</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (NEAA) 100X</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) 1X</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>Colonna per apparecchi Harvard Colonna per micro spin C18 inversa</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>74-4601</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M, pH 8,0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9260G</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Bis-Tris 4-12%</td><td>Life Technologies SAS</td><td>NP0321 BOX</td><td></td></tr><tr><td>CD14 Microsfere</td><td>Miltenyi umano Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>Colonna di separazione MACS LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>Fattore stimolante le colonie di macrofagi (M-CSF)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-485</td><td></td></tr><tr><td>Interleuchina 4 (IL4)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-093-917</td><td></td></tr><tr><td>Interleuchina 13 (IL13)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-112-410</td><td></td></tr><tr><td>Interferone gamma (INF&gamma;)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-482</td><td></td></tr><tr><td>CD14-FITC (clone T&Uuml; K4)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-080-701</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Rotatore di provette</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>Acido trifluoroacetico (TFA)</td><td>Pierce</td><td>28904</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/Lys-C Mix</td><td>PROMEGA</td><td>V5073</td><td></td></tr><tr><td>Mini completo cocktail di inibitori della proteasi senza EDTA</td><td>Roche</td><td>11836170001</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione a gradiente di densità ( Histopaque 1077)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>10771-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Accumax</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7089-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Siero umano da plasma AB maschile umano (SAB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4522-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina (BSA) soluzione 30%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9576-50ML</td><td></td></tr><tr><td>Trisma-base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>49767</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148</td><td></td></tr><tr><td>Blu di bromofenolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>114405</td><td></td></tr><tr><td>Sodio Dodecil Solfato (SDS) 20%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5030</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di ammonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>9830</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma Aldrich</td><td>34888</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43819</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetammide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>57670</td><td></td></tr><tr><td>Tiourea</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9426</td><td></td></tr><tr><td>Kit di dosaggio Micro BCA</td><td>ThermoFisher</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta sterile in plastica da 5 ml</td><td>VWR</td><td>612-1685</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C Eppendorf</td><td>VWR</td><td>460-0223</td><td></td></tr><tr><td>Sep-Pak tC18 cartucce di fase inversa, 100 mg</td><td>Waters</td><td>WAT036820</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi proteomica di polarizzazione di macrofago umano in un ambiente a basso tenore di ossigeno

Proteomic Analysis of Human Macrophage Polarization Under a Low Oxygen Environment

I macrofagi sono cellule dell'immunità innata coinvolti in una serie di funzioni fisiologiche che vanno dalle risposte agli agenti patogeni infettivi all'omeostasi del tessuto. Le varie funzioni di queste cellule sono legate alla loro Stati di attivazione, che è anche chiamato polarizzazione. La precisa descrizione molecolare di queste varie polarizzazioni è una priorità nel campo della biologia del macrofago. È attualmente riconosciuto che un approccio multidimensionale è necessario descrivere come polarizzazione è controllata da segnali ambientali. In questo rapporto, descriviamo un protocollo progettato per ottenere la firma di proteomica di varie polarizzazioni in macrofagi umani. Questo protocollo è basato su una quantificazione dell'espressione della proteina del macrofago ottenuto da Lys C/tripsina-digerito lisi cellulare contenuti e frazionati in gel privo di etichetta. Forniamo anche un protocollo basato sulla soluzione in digestione e frazionamento da utilizzare come alternativa di messa a fuoco isoelettrico. Perché la concentrazione di ossigeno è un parametro ambientale rilevante nei tessuti, utilizziamo questo protocollo per esplorare composizione come atmosferica o un ambiente di ossigeno basso colpisce la classificazione di polarizzazione del macrofago.

A partire da cellule mononucleari di sangue periferico (PBMCs) ottenute per centrifugazione differenziale, il protocollo consente l'ottenimento di una popolazione di CD14+ monociti con un valutati purezza superiore al 98% da citometria a flusso (Figura 1). Questi monociti sono secondariamente differenziati verso varie polarizzazioni (Figura 2). Quando viene scelto un frazionamento su gel, la migrazione su gel di SDS-pa...

Vi presentiamo un protocollo per ottenere le firme di proteomica dei macrofagi umani e da applicare per determinare l'impatto di un ambiente di ossigeno basso sulla polarizzazione del macrofago.

Analisi proteomica di polarizzazione di macrofago umano in un ambiente a basso tenore di ossigeno

Macrophages are innate immune cells involved in a number of physiological functions ranging from responses to infectious pathogens to tissue homeostasis. ...

Quindi questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dei macrofagi, come come caratterizzare lo stato di attivazione in vari giacimento a livello proteico. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce l'opportunità di ottenere una diversa espressione di molte proteine nei macrofagi umani utilizzando un metodo di quantificazione privo di etichette. A dimostrare la procedura saranno Marie Malier e Magali Court del mio laboratorio.Per iniziare, aggiungere 15 millilitri di soluzione di separazione cellulare gradiente di densità in ciascuno dei due tubi di centrifugazione da 50 millilitri in modo che la soluzione possa riscaldarsi a temperatura ambiente prima di ricevere l'LRSC. Questo è essenziale in quanto la densità dipende dalla temperatura. Svuotare l'LRSC in un tubo di centrifugazione da 50 millilitri.Aggiungere 1x PBS fino a 50 millilitri e mescolare. Quindi, molto lentamente, aggiungere 25 millilitri della miscela sopra 15 millilitri di soluzione gradiente di densità equilibrata. Fare attenzione a non mescolare le fasi durante questo passaggio.Il sangue deve essere aggiunto sulla soluzione di gradiente di densità senza alcun disturbo di questa fase. Centrifugare entrambi i tubi di centrifugazione per 25 minuti a 700 G senza pause. Alla fine della centrifugazione del gradiente di densità, gli strati dal basso verso l'alto sono gli eriociti e i granulociti, formando il pellet, la fase di soluzione del gradiente di densità, uno strato di PBPC e il plasma diluito.Con una pipetta, passare attraverso la fase plasmatica senza aspirarla. Quindi, raccogliere lo strato PBMC in un nuovo tubo di centrifugazione da 50 millilitri. Aggiungere fino a 50 millilitri di 1x PBS ai PBBC come configurazione di lavaggio e centrifuga per 10 minuti a 300 G.Aspirare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in 40 millilitri di mezzo macrofago.Dopo aver formulato i PBBC in una camera Malassez, trasferire la quantità di PBBC necessaria per condurre l'esperimento in un tubo di centrifugazione. Centrifugare le cellule per 10 minuti a 300 G.Aspirare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in 80 microlitri del tampone di cernita per 10 milioni di PBBC. Quindi, aggiungere 20 microlitri di microperline CD14 per 10 milioni di PBBC.Mescolare bene e incubare per 15 minuti a 4 gradi Celsius sotto agitazione costante. Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di tampone di cernita per 10 milioni di PBPC come fase di lavaggio e centrifugare come prima. Quindi, aspirare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in 500 microlitri di tampone di cernita per 100 milioni di PBBC.Ora, posizionare una colonna nel campo magnetico del separatore. Preparare la colonna risciacquarla con tre millilitri di tampone di smistamento. Applicare la sospensione cellulare sulla colonna.Quindi raccogliere il flusso attraverso contenente celle senza etichetta per la colorazione successiva, se necessario. Lavare la colonna tre volte con tre millilitri di tampone di smistamento. Fai attenzione a non asciugare la colonna.Quindi, posizionare un tubo di raccolta sotto la colonna e rimuoverlo dal separatore. Dopo il lavaggio, pipettare cinque millilitri di tampone di smistamento nella colonna. Sciacquare immediatamente le cellule con etichetta magnetica spingendo saldamente lo stantuffo nella colonna.Infine, ripetere questi passaggi con una nuova colonna prima di placcare i monociti ed eseguire la polarizzazione del macrofago come descritto nel protocollo di testo. Mantenere i monociti e i macrofagi in un ambiente controllato dall'ossigeno per eseguire analisi delle condizioni ipossiche. Utilizzare una stazione di lavoro ipossia per mantenere le cellule sotto la pressione parziale di ossigeno desiderata durante l'esperimento.Quando si lavora sotto bassa pressione di ossigeno, è importante preparare tutti i mezzi e i tamponi di lavaggio sotto la stazione e attendere a sufficienza per ottenere la corretta pressione parziale nel liquido. Eseguire la llisi cellulare in un tampone sotto una cappa adattata. Caricare l'equivalente proteico di 300.000 cellule per ogni campione su gel di acrilammide 4-12%bis-tris.Controlla la durata della migrazione elettroforetica per consentire a ogni campione proteico di dividersi in sei bande di gel come mostrato qui. Dopo aver riparato e macchiato come descritto nel protocollo di testo, asportare le bande proteiche con un bisturi pulito. Tagliare a dadini ogni banda asportata prima di metterli in tubi da 500 microliter.Ora, lavare le fette di gel tre volte in 200 microlitri di bicarbonato di ammonio millimolare per 20 minuti a 37 gradi Celsius, scartando il bicarbonato di ammonio tra ogni passaggio. Seguire questo con un lavaggio in bicarbonato di ammonio millimolare e acetonitrile. Quindi, disidratare i pezzi di gel con 200 microlitridi di acetonitrile al 100% per 10 minuti.Incubare ogni pezzo di gel con DTT da 10 millimolare e bicarbonato di ammonio millimolare per 45 minuti a 56 gradi Celsius. Quindi, scartare il DTT e incubare il pezzo di gel con 55 iodoacetamide millimolare in bicarbonato di ammonio millimolare per 35 minuti al buio a temperatura ambiente. Per fermare l'alchilazione, scartare la soluzione utilizzata e incubare ogni pezzo di gel con 200 microlitri di DTT da 10 millimolare in bicarbonato di ammonio millimolare per 10 minuti a temperatura ambiente.Lavare i pezzi di gel in 200 microlitri di bicarbonato di ammonio millimolare. Quindi, disidratare con 200 microlitri di acetonitrile al 100% per 10 minuti. Digerire le proteine durante la notte a 37 gradi Celsius con Trypsin / Lys-C Mix secondo le istruzioni del produttore.Estrarre i peptidi risultanti da pezzi di gel aggiungendo 50 microlitridi di acetonitrile al 50% per 15 minuti in tubi a basso assorbimento. Dopo aver aggiunto 50 microlitridi di acido formico al 5% per 15 minuti, aggiungere 50 microlitri di acetonitrile al 100% per 15 minuti. Tirare e asciugare ogni frazione in tubi a basso assorbimento per limitare l'assorbimento dei peptidi e la perdita del campione.Archiviare i campioni a 80 gradi Celsius fino a un'ulteriore analisi come descritto nel protocollo di testo. Di seguito è riportata la purezza rappresentativa valutata dalla citometria del flusso a seguito della selezione di perline magnetiche di monociti positivi cd14. L'imaging a contrasto di fase di macrofagi umani differenziati mostra eterogeneità delle morfologie ottenute per due diverse polarizzazioni dopo nove giorni di coltura.Viene mostrato un esempio di digestione off-gel utilizzando gel di pagina SDS macchiati d'argento. La valutazione delle proteine dallalisi cellulare e dopo la digestione in soluzione mostra l'assenza di degradazione durante lalisi e l'efficienza della digestione. Mostrato qui è un esempio di spettro di dissociazione indotto dalla collisione di un peptide trovato a rapporto massa-carica di 597,29 sullo spettro MS con una carica elettrica di due positivi.Da questo spettro, è stata determinata la sequenza corrispondente. Il risultato finale dopo l'analisi è una mappa termica che rappresenta il clustering gerarchico di tutti gli stati di polarizzazione usando proteine espresse in modo differenziato. L'analisi rivela un ammasso di proteine sovrascritte in tutte le polarizzazioni nella condizione del 3% di ossigeno.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che devi prima decidere quale tipo di frazionamento eseguirai su nuovi campioni per adattare il tuo protocollo di conseguenza. L'approccio proteomico che utilizza questo lavoro è complementare agli approcci genomici che sono stati utilizzati negli ultimi anni nel campo degli studi di polarizzazione della biologia dei macrofagi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada al ricercatore nel campo dell'immunologia per esplorare i vari stati di attivazione delle cellule immunitarie nell'uomo e anche in altri mammiferi.Non dimenticare che lavorare con DTT potrebbe essere pericoloso, quindi è necessario lavorare sotto una cappa adattata per eseguire questa procedura.

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I macrofagi sono le cellule chiave coinvolte nella patogenicità dell'ospite. I macrofagi mostrano una diversità fenotipica e funzionale che può essere analizzata e rilevata mediante analisi proteomica. Questo articolo descrive come eseguire l'elettroforesi 2D di colture primarie di macrofagi umani differenziati in fenotipo M1 o M2.

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Questo protocollo fornisce un metodo per studiare l'infezione da Mycobacterium tuberculosis nei macrofagi polarizzati M1 o M2 umani basati sulla differenziazione dei monociti del sangue periferico alle cellule simili a macrofagi che sono infettate dal ceppo virulento H37Rv etichettato GFP e analizzate con citometria a flusso utilizzando un pannello a 10 colori che include l'espressione di marcatori M1/M2 selezionati.

Polarizzazione delle cellule derivate da monociti umani M1 e M2 e analisi con citometria a flusso sull'infezione da tubercolosi del micobatterio

I macrofagi associati al tumore M2-like (TAM) sono associati alla progressione del tumore e alla prognosi sfavorevole nel cancro. Questo protocollo serve come guida dettagliata per differenziare e polarizzare in modo riproducibile le cellule simili ai monociti THP-1 in macrofagi simili a M2 entro 14 giorni. Questo modello è la base per studiare gli effetti antinfiammatori della TAM all'interno del microambiente tumorale.

Differenziazione e polarizzazione dei macrofagi in un fenotipo M2-like utilizzando una linea cellulare di leucemia THP-1 simile a un monocita umano

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per valutare il potenziale immunomodulatorio delle superfici implantari in vitro, con l'obiettivo di migliorare l'affidabilità e la riproducibilità dei protocolli attuali e promuovere ulteriori ricerche. I profili delle citochine secretorie, l'espressione dell'mRNA e i marcatori della superficie cellulare sono stati monitorati utilizzando macrofagi derivati da monociti nel sangue per studiare la polarizzazione dei macrofagi coltivata sul titanio.

Polarizzazione e caratterizzazione di macrofagi derivati da monociti umani M1 e M2 su superfici implantari 

I monociti e i macrofagi sono cellule immunitarie molto plastiche e riprogrammabili, cruciali per la salute e la malattia. Percepiscono e rispondono a un'ampia gamma di stimoli adottando specifici programmi di differenziazione e fenotipi. Abbiamo standardizzato un modello in vitro per studiare la polarizzazione e la riprogrammazione dei macrofagi, fornendo uno strumento prezioso per la ricerca.

Riprogrammazione del modello di macrofagi derivati da monociti umani per saggi in vitro

Qui, descriviamo in dettaglio i metodi per estrarre i macrofagi dal midollo osseo, dalla milza e dal cuore infartuato e successivamente valutare il flusso metabolico nelle cellule vive.

Analisi del flusso metabolico ex vivo nei macrofagi splenici e cardiaci e nei monociti del midollo osseo

Impara l'analisi proteomica dei macrofagi umani in condizioni ipossiche per caratterizzare gli stati di attivazione cellulare. Questo metodo con quantificazione label-free aiuta a studiare la polarizzazione macrofagica.

Analisi proteomica di polarizzazione di macrofago umano in un ambiente a basso tenore di ossigeno

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