Visualizzazione livelli gibberellina cellulare utilizzando l'energia di risonanza di Förster NlsGPS1 Transfer (FRET) biosensore

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dello sviluppo delle piante per quanto riguarda la distribuzione di fitoormoni regolatori della crescita. Utilizzando biosensori FRET geneticamente codificati, ad esempio nlsGPS1 che rileva gibberellini, è possibile misurare la distribuzione dinamica di composti importanti nei tessuti arabidopsis alla soluzione cellulare. Generalmente, gli individui nuovi a questa materia avranno difficoltà, perché l'analisi dei biosensori FRET comporta l'imaging ratiometrico che ha aumentato il rumore e ulteriori passaggi analitici rispetto all'imaging metrico delle intenzioni.

Inizia seminando circa 20 semi di Arabidopsis sterilizzati su 1/2 piatti quadrati di Murashige e Skoog o MS agar. Sigillare le piastre con nastro chirurgico poro e avvolgerle con un foglio di alluminio per uno o tre giorni di incubazione a quattro gradi Celsius per la stratificazione. Per l'imaging delle radici, trasferire le piastre in una camera di crescita in orientamento verticale per tre giorni nelle condizioni indicate.

Per l'ipocotile coltivato al buio, trasferire le piastre nella camera di crescita per un impulso luminoso da una a quattro ore per sincronizzare la germinazione. Quindi avvolgere le piastre con un foglio di alluminio e posizionarle nella camera di crescita in orientamento verticale per tre giorni. Per le misurazioni in stato stazionario, aggiungere 50 microlitri di soluzione fittizia a uno scivolo al microscopio pulito e posizionare delicatamente tre sensori di percezione della gibbellina localizzata nucleare uno o nlsGPS1 che esprimono piantine sullo scivolo.

Quindi individuare una goccia di grasso sottovuoto su ogni angolo di un coperchio pulito scivolare e posizionare delicatamente per coprire scivolare sopra le piantine. Aggiunta con cura di una soluzione fittizia aggiuntiva per rimuovere eventuali bolle d'aria se necessario. Prima del trattamento con gibberellina quattro o GA4, utilizzare una siringa da 20 millilitri riempita con grasso sottovuoto e dotata di una punta di pipetta da 200 microliter modificata con un'apertura di diametro di un millimetro per disegnare un rettangolo uniformemente stratificato lungo tre centimetri e mezzo per un rettangolo largo due centimetri e mezzo su uno scivolo di vetro pulito.

Aggiungere 50 microlitri di soluzione fittizia al centro del rettangolo e utilizzare forcep pulite per sollevare nlsGPS1 esprimendo piantine dalla parte inferiore dei loro cotyledon per un attento trasferimento nella soluzione fittizia. Posizionare un coperchio avvistato con grasso sottovuoto come appena dimostrato al centro del rettangolo di grasso sottovuoto e riempire accuratamente il serbatoio con una soluzione di simulazione extra senza disturbare le piantine. Quindi acquisire immagini delle piantine su un microscopio confocale dotato di laser appropriati per emozionanti CFP e YFP per eseguire la risonanza forster di imaging di trasferimento di energia.

Per GA4 per il trattamento, rimuovere la diapositiva dallo stadio del microscopio e impostare un timer per 20 minuti. Rimuovere immediatamente la soluzione fittizia dal lato destro dello slittamento del coperchio aggiungendo 17 microlitri di un quarto di liquido MS integrati con un micro molare GA4 sul lato sinistro del coperchio fino a quando tutta la soluzione fittizia non è stata sostituita. Quindi riposizionare lo scivolo di vetro sul palco del microscopio e attendere altri 10 minuti prima di acquisire l'immagine di trattamento dopo GA4.

Per impostare un percorso orario per un tessuto di interesse, aggiungere 200 microlitri di soluzione fittizia al centro del canale di perfusione di uno scivolo appiccicoso ibidi e posizionare delicatamente le piantine nlsGPS1 nella soluzione fittizia come dimostrato. Utilizzare le forcep per posizionare delicatamente uno scivolo di copertura sopra le piantine utilizzando il retro delle forcep per premere delicatamente sui bordi esterni del coperchio fino a 300 mentre forma un forte legame con il materiale appiccicoso alla periferia dello scivolo appiccicoso. Successivamente, utilizzare due connettori Luer a gomito di diametro interno da 0,8 millimetri e un pezzo di diametro interno di 0,8 millimetri di tubo di silicone per collegare lo scivolo appiccicoso a una siringa da 20 millimetri riempita con soluzione fittizia e per collegare lo scivolo a un contenitore di uscita per raccogliere la soluzione di deflusso.

Premere delicatamente lo stantuffo per erogare una soluzione sufficiente alla camera per assicurarsi che non vi siano bolle d'aria e quindi caricare la siringa su una pompa per siringhe programmabile. Quindi avviare la pompa per avviare il corso del tempo. Per i trattamenti GA4 durante il corso del tempo, mettere in pausa la pompa per interrompere la perfusione E sostituire il finto tampone contenente siringa con una siringa riempita con un quarto di liquido MS integrato con GA4.

Per l'analisi delle immagini 3D, importare i file nel programma software di analisi delle immagini IMARIS e aprire la procedura guidata superfici. Impostare la sottrazione di sfondo su tre micron e la soglia su default. Durante la segmentazione dei nuclei fare attenzione a non includere i molti nuclei con fluorescenza fioca in quanto la razione segnale-rumore dell'oggetto con livelli di segnale vicini allo sfondo sarà troppo bassa per l'analisi dell'immagine ratiometrica.

Quindi mascherare i canali di emissione CFP e FRET in base alle superfici create utilizzando l'emissione YFP. Utilizzare l'estensione del rapporto di intensità media XT per calcolare un rapporto tra l'emissione di accettore di eccitazione del donatore diviso per l'emissione del donatore di eccitazione tra i valori di intensità media delle singole superfici nei due canali. Per colorare le singole superfici con il rapporto di emissione nlsGPS1, selezionare la codifica a colori con le statistiche e impostare il rapporto di intensità media come tipo di statistica.

Sotto l'icona statistiche esportare i rapporti dei singoli valori dalla tabella e copiare e incollare i valori in un foglio di calcolo per la rappresentazione grafica dei dati. Nella radice arabidopsis, il gradiente del rapporto di emissione nlsGPS1 è indicativo di bassi livelli GA4 nelle zone meristematiche e di divisione e alti livelli di GA nella zona di allungamento tardivo. Al contrario, un gradiente del rapporto di emissione non è osservato nelle radici non reattive nlsGPS1, suggerendo che il gradiente GA4 endogeno non è un artefatto.

Un gradiente del rapporto di emissione nlsGPS1 si forma anche in ipocotili coltivati al buio con bassi livelli nei cotiledoni e il tipico gancio e alti livelli nella regione basale rapidamente allungata dell'ipocotile. Al contrario, un gradiente di rapporto di emissione non è osservato negli ipocotili non reattivi nlsGPS1. Inoltre, ga4 fornito esogenamente si accumula preferenzialmente nella zona di allungamento rispetto alla zona di divisione della radice arabidopsis che indica che nlsGPS1 può essere utilizzato per studiare il modello GA endogeno ed esogeno.

Inoltre, l'analisi del corso del tempo delle piantine nlsGPS1 trattate con GA4 rivela un accumulo più veloce di GA4 esogeno nell'allungamento della radice rispetto alla zona di divisione. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di evitare pixel saturi durante l'imaging quantitativo per mantenere costanti i parametri di imaging e ridurre al minimo i problemi di deriva e cambiamento focale durante la perfusione del campione. Seguendo questa procedura elaborati metodi, come le radici di imaging che crescono nei dispositivi di profusione di controllo del chip radicale possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive su come i gradienti GA cambiano nelle punte delle radici arabidopsis che crescono a velocità diverse o in risposta allo stress Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada alla ricerca nel campo della crescita delle piante per esplorare la distribuzione dinamica dei gibberellini in tessuti e organi arabidopsis thaliana aggiuntivi.