Proteina chinasi C-delta inibitore Peptide formulazione usando nanoparticelle d'oro
9 marzo 2019
In precedenza abbiamo usato un ibrido del peptide di nanoparticelle d'oro per consegnare per via endovenosa un peptide sintetico, inibitore della protein chinasi C-delta, che ha ridotto la lesione di polmone acuta indotta da ischemia-riperfusione. Qui vi mostriamo il protocollo dettagliato della formulazione di droga. Altri peptidi intracellulare possono essere formulate allo stesso modo.
Il nostro esclusivo sistema di somministrazione di farmaci, che utilizza particelle d'oro di 20 nanometri in due peptidi corti specifici, può stabilizzare le nanoparticelle d'oro in soluzione fisiologica e migliorare il suo assorbimento cellulare e quindi fornire efficacemente farmaci a base di peptidi o altri farmaci nelle cellule. Il nostro ibrido peptidico PNL è facile da sintetizzare e stabile. Usando l'ibrido peptidico della nanoparticella d'oro come portatori di farmaci, possiamo trasferire i farmaci peptidici nelle cellule in modo efficace e in abbondanza.
Abbiamo trattato la lesione da ischemia-riperfusione nei polmoni con il nostro ibrido PNL/PKCi. Il PNL porta peptidi inibitori della PKC nel citoplasma. Questo metodo di consegna è stato in grado di ridurre lesioni polmonari più gravi utilizzando un dosaggio inferiore di PKCi rispetto ad altri metodi di consegna.
Per iniziare questa procedura, recuperare i peptidi da un congelatore a meno 20 gradi Celsius e scongelarli a temperatura ambiente. Utilizzare una micro bilancia per pesare 0,01 grammi di ogni peptide scongelato e trasferire ogni peptide in un tubo conico separato da 50 millilitri. Aggiungere 18,74 millilitri di acqua deionizzata al tubo P2 e 16,93 millilitri di acqua deionizzata al tubo P4.
Aggiungere 8,21 millilitri di acetonitrile al 50% diluito in acqua deionizzata al tubo inibitore del delta PKC. Vortice le soluzioni peptidiche brevemente. Quindi posizionare i tubi in un sonicatore a 40 megahertz per cinque minuti.
Successivamente, trasferire le soluzioni in un armadio di biosicurezza. È fondamentale mettere il tubo conico da 50 ml in un sonicatore per cinque minuti. Se questo passaggio viene ignorato, il PNL/PKCi formerà aggregazioni.
Trasferire un millilitro di ogni soluzione peptidica nel proprio nuovo tubo conico da 50 millilitri. Aggiungere 19 millilitri di acqua deionizzata ai tubi contenenti P2 e P4. E aggiungere 19 millilitri del 50% di acetonitrile al tubo contenente l'inibitore del delta PKC. Aggiungere 475 millilitri della soluzione P2, 25 microlitri della soluzione P4, 500 microlitri della soluzione di inibitore del delta PKC a un tubo da 15 millilitri.
Quindi aggiungere nove millilitri di una soluzione PNL di 20 nanometri allo stesso tubo. Rimuovere la soluzione combinata dall'armadio di biosicurezza e avvolgere il tubo in un foglio di alluminio. Posizionare il tubo su uno shaker durante la notte.
Il giorno dopo, restituisci i campioni all'armadietto della biosicurezza. Trasferire un aliquote millilitro della soluzione PNL/PKCi in micro tubi da 1,5 millilitri. Centrifugare i micro tubi a una micro centrifuga a 15294 volte g e a quattro gradi Celsius per 30 minuti.
Trasferire di nuovo i microtubi nell'armadio di biosicurezza e rimuovere il supernatente da ogni tubo, garantendo nel contempo che il pellet PNL non sia disturbato. Resuspend ogni pellet nel solvente desiderato in base alla concentrazione richiesta. Per valutare la solubilità ibrida PNL/PKCi, versare 0,5 millilitri della soluzione PNL/PKCi in una cuvette per competenza.
Posizionare la cuvetta su uno spettrofotometro UV-Vis e testare l'assorbimento del picco. In questo studio, l'inibitore della protein chinasi C-delta è coniugato con nanoparticelle d'oro per formare un ibrido GNP/PKCi. Bisogna fare attenzione a valutare le proprietà biofisiche dell'ibrido, poiché le nanoparticelle d'oro tendono ad aggregarsi in un solvente.
Quando le nanoparticelle si aggregano, il colore della soluzione cambierà dal rosa al viola. I campioni vengono analizzati con uno spettrofotometro UV-Vis in grado di rilevare con un alto grado di sensibilità. Se l'ibrido non è aggregato, il picco di assorbimento dovrebbe essere di 525 nanometri.
Se il PNL è aggregato, il picco di assorbimento sarà spostato a destra. Come si può vedere, quando si sono formati aggregati, la densità ottica delta diminuisce. Quando si formulano gli ibridi peptidici PNL, è importante ricordare che il rapporto tra peptidi e soluzione PNL dovrebbe essere da uno a nove.
Questa formula PNL/PKCi può essere utilizzata per lesioni da ischemia-riperfusione in sistemi di organi diversi dal polmone. Tutti i peptidi possono attaccarsi al PNL se questi peptidi hanno un residuo di cisteina all'N-terminale. Ciò significa che l'ibrido peptidico PNL può essere utilizzato per trasportare altri farmaci peptidici nella cellula.
I peptidi progettati razionalmente sono una nuova tecnologia che può portare una specifica interazione proteina-proteina all'interno di quelle cellule. Questa tecnica, sviluppata qui, può essere utilizzata per la consegna di nuovi farmaci peptidici o per versioni modificate di farmaci esistenti.
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Panoramica
Questo studio presenta un nuovo sistema di somministrazione di farmaci che utilizza ibridi peptidici a base di nanoparticelle d'oro per consegnare efficacemente inibitori della proteina chinasi C-delta al fine di ridurre il danno polmonare acuto indotto da ischemia-riperfusione. Il metodo migliora l'assorbimento cellulare e la stabilità dei peptidi, consentendo un trattamento efficace con dosaggi inferiori.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Sistemi di somministrazione dei farmaci
- Nanotecnologia
- Trattamento della lesione polmonare acuta
Sfondo
- Le nanoparticelle d'oro possono stabilizzare i peptidi in soluzioni fisiologiche.
- I farmaci a base di peptidi spesso incontrano difficoltà nel rilascio cellulare.
- Il danno da ischemia-riperfusione è una causa significativa di lesioni polmonari.
- Metodi efficaci di somministrazione dei farmaci possono migliorare i risultati del trattamento.
Scopo dello studio
- Sviluppare un sistema di somministrazione di farmaci stabile ed efficace utilizzando ibridi di peptidi e nanoparticelle d'oro.
- Dimostrare l'efficacia di questo sistema nel trattamento del danno polmonare.
- Fornire un protocollo dettagliato per la sintesi della formulazione farmaceutica.
Metodi Utilizzati
- Sintesi di ibridi peptidici con nanoparticelle d'oro.
- Somministrazione endovenosa dell'ibrido per colpire le cellule polmonari.
- Valutazione dell'assorbimento cellulare e della stabilità in condizioni fisiologiche.
- Valutazione dell'efficacia del trattamento in modelli di lesione da ischemia-riperfusione.
Risultati principali
- L'ibrido GNP/PKCi ha consegnato efficacemente farmaci peptidici all'interno delle cellule.
- Dosi più basse di PKCi hanno determinato un danno polmonare ridotto rispetto ad altri metodi.
- Il sistema ha dimostrato elevata stabilità e facilità di sintesi.
- L'assorbimento cellulare potenziato è stato confermato mediante analisi sperimentale.
Conclusioni
- L'ibrido peptidico con nanoparticelle d'oro è un sistema di somministrazione di farmaci promettente.
- Questo metodo può migliorare significativamente il trattamento dell'insufficienza polmonare acuta.
- Ulteriori ricerche potrebbero estenderne l'applicazione ad altri farmaci a base di peptidi.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Gli ibridi peptidici con nanoparticelle d'oro (GNP) offrono una piattaforma modulare per il rilascio intracellulare di inibitori a base peptidica, affrontando le principali sfide legate alla stabilità e all'assorbimento cellulare. Questa tecnologia consente un rilascio preciso di peptidi progettati razionalmente, supportando la validazione precoce degli obiettivi terapeutici e la riduzione dei rischi meccanicistici nella scoperta di farmaci. La sua adattabilità a diversi carichi peptidici ne fa una capacità riutilizzabile per la ricerca traslazionale su tutta la linea di prodotti.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Consente l'interrogazione funzionale di bersagli intracellulari mediante inibitori peptidici.
- Permette la riduzione del rischio meccanicistica assicurando un efficace rilascio citoplasmatico delle molecole candidate.
- Facilita una valutazione predittiva dell'interazione con il bersaglio attraverso analisi quantitative dell'assorbimento e della stabilità.
Sviluppo di screening e saggi
- Fornisce una piattaforma standardizzata per la preparazione di coniugati peptidi-nanoparticelle d'oro con proprietà fisico-chimiche riproducibili.
- Consente la valutazione quantitativa dell'aggregazione delle nanoparticelle e del rilascio dei peptidi mediante spettrofotometria UV-Vis.
- Permette la scalabilità del saggio e il riutilizzo della piattaforma per diverse sequenze peptidiche con residui di cisteina in posizione N-terminale.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Dimostra la somministrazione in vivo e l'efficacia in modelli di danno d'organo, sostenendo la continuità traslazionale.
- Permette l'adattamento ad altri sistemi d'organo e a terapie basate su peptidi, purché supportato dalla compatibilità fisico-chimica.
- Riduce il rischio biologico consentendo dosaggi inferiori e minimizzando gli effetti fuori bersaglio rispetto ai vettori tradizionali.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questa formulazione ibrida peptide-GNP collega la fase iniziale della scoperta, l'identificazione del composto promettente e la validazione preclinica, consentendo una somministrazione intracellulare robusta e una caratterizzazione quantitativa dei farmaci peptidici.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante il rilascio intracellulare efficiente di peptidi funzionali.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili della stabilità delle nanoparticelle e della coniugazione dei peptidi.
- Analisi: Utilizza la spettrofotometria UV-Vis per la rilevazione sensibile dell'aggregazione e dell'efficienza di rilascio.
- Ricerca traslazionale: Dimostra l'applicabilità in vivo e l'adattabilità a diversi sistemi organici.
- Riutilizzo aziendale: Offre una piattaforma di rilascio generalizzabile per una vasta gamma di candidati farmaci a base di peptidi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione degli obiettivi intracellulari e negli studi meccanicistici.
- Valore operativo: Standardizza i flussi di lavoro per il rilascio di peptidi e migliora la riproducibilità tra i diversi team di ricerca e sviluppo.
- Valore strategico: Consente decisioni di avanzamento o interruzione basate sulla valutazione del rischio, fornendo un rilascio affidabile e analisi quantitative robuste.
- Impatto sul portafoglio: Favorisce la priorizzazione di terapeutici peptidici con un miglior rilascio e un ridotto rischio di effetti fuori bersaglio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella sintesi di nanoparticelle e nella chimica della coniugazione peptidica.
- Necessita dell'accesso a strumentazione analitica come spettrofotometri UV-Vis per la valutazione dell'aggregazione.
- Richiede una standardizzazione intersettoriale dei rapporti peptidi-GNP e delle condizioni di solvente.
- Adattabile a peptidi con residui di cisteina in posizione N-terminale per una vasta applicabilità.
- Il rischio di aggregazione deve essere gestito attraverso un rigoroso rispetto del protocollo e un monitoraggio fisico-chimico accurato.
