Utilizzando Ustilago maydis come un Trojan Horse per In Situ consegna di mais proteine

Questo lavoro descrive la clonazione di un ceppo di Trojan horse Ustilago maydis per la consegna in loco delle proteine secrete mais in tre diversi tipi di tessuti mais.

Lo studio dei processi sui livelli genetici e proteici è fondamentale nella ricerca sulle colture. Il nostro approccio consente l'ispezione di proteine del labirinto secrete con la massima risoluzione temporale spaziale a diversi lati e tessuti di infezione. Il metodo Trojan Horse esplora utili capacità di secretoria automatizzata.

Aggira le trasformazioni del labirinto che richiedono tempo e sfidano e facilita studi dettagliati sulle proteine secrete all'interno del labirinto appelplatz. Informazioni dettagliate sulla corretta infezione di foglie di labirinto aggiunte, nappe e orecchio. E mostra lo studio riuscito della progressione dell'infezione e della funzione proteica nel tessuto bersaglio.

A dimostrare la procedura sarà Isabell Fiedler, una studentessa del laboratorio. Per iniziare l'esperimento, graffiare Eumadous da una piastra pediatra usando una pipetta pasteur sterile. Inoculare 5 millilitri di YEPS Light Medium con Eumadous.

Fai crescere la cultura a 28 gradi Celsius, con scuotimenti costanti a 200 giri/min per 16 ore. Il giorno dopo mescolare 900 microlitri di luce YEPS fresca con 100 microlitri della cultura notturna. Misurate l'OD-600 utilizzando YEPS Light Medium come vuoto nell'analisi dello spettrofotometro.

Diluire la cultura notturna con yeps light medium fresco a un OD-600 di 2. Lascia che la cultura cresca a 28 gradi Celsius con scuotimenti costanti a 200 giri/min, fino a raggiungere la fase di crescita del tronco medio, indicata da un OD-600 da 8 a 1,0. Dopo l'incubazione, raccogliere le cellule facendole girare a 3000 volte chi per 10 minuti.

Scartare il supernatante. Quindi, lavare la pilette cellulare una volta con 1 volume di coltura di DDH2O. Ruotare le cellule a 3000 volte chi per 10 minuti e scartare il supernatante.

Quindi, sospendere attentamente la pilette cellulare in DDH2O, utilizzando una pipetta di vetro da 20 millilitri. Regolando così l'OD-600 finale a 3.0 per un test trojan horse o 1.0 per la valutazione della malattia. Coltiva le piante di labirinto in uno stadio di foglie adulte, dove almeno la foglia 7 cresce all'interno del gambo.

Successivamente, trasferire la cultura Eumadous in una siringa da 3 millilitri con un ago ipodermico bi uno calibro 20. Premere attentamente il gambo per localizzare il tessuto stelo specchio. La base dello specchio può essere distinta per una transizione dal gambo più duro al tessuto più morbido.

Contrassegnare lo stelo dello specchio sul gambo usando una penna. Iniettare 1,5 millilitri di coltura eumadosa 1 centimetro sopra il gambo shoot mirror o il gambo specchio infiorescenza. Una volta che le piante di labirinto raggiungono lo stadio della nappa, premere attentamente il gambo per localizzare la nappa nel gambo.

Contrassegnare la punta e la base della nappa sullo stelo usando una penna. Trasferire la coltura eumadosa in una siringa da 3 millilitri con un ago ipodermico bi uno da 20 gauge per iniettare un totale di 1,5 millilitri dell'inoculo intorno alla nappa. Per assicurare un'equa distribuzione dell'inoculo, posizionare lentamente 5 millilitri sulla punta, al centro e alla base della nappa contrassegnata con la penna.

Trasferire la cultura Eumadous in una siringa da 3 millilitri con ago ipodermico bi uno calibro 20. Iniettare l'ago di inoculazione nello spazio tra le foglie della buccia il più profondamente possibile senza ferire l'orecchio, quindi rilasciare 1,5 millilitri dell'inoculo intorno all'orecchio. Quindi, rimuovere la siringa e l'ago e massaggiare accuratamente la sfera per distribuire equamente la soluzione Eumadous.

Far cadere 10 microlitri di inoculo su una piastra di coclea di carbone PD. Quindi incubare a temperatura ambiente per 2 giorni. Hyphae secendo ZM Mach1 sono circondati da segnale fluorescente e ciliegio.

Al contrario, le ife non secrenti mostrano solo un segnale fluorescente nel citoplasma fungino. Una localizzazione impropria della nappa o una distribuzione iniqua dell'inoculo può causare nappe non infette o solo un'infezione parziale della nappa rispetto alla distribuzione uniforme. Il ceppo di progenestere del cavallo di patogeno solo SG-200, coltivato su coclea di carbone PD, forma filamenti di lanugine bianca sul piatto come mostrato.

Mentre il ceppo Eumadous FB1 richiede l'accoppiamento prima della formazione infettiva dei filamenti. Dopo l'infezione, la possibile risposta di segni la proteina epatica cavallo di può essere analizzata utilizzando vari metodi tra cui valutazioni della malattia o imaging microscopico. Per molti agenti patogeni, la trasformazione e la secrezione sono ben comprese e possono essere esplorate in modo simile.

Pertanto, consentono lo studio dell'host, che non è suscettibile alla trasformazione.