Name: Utilizzando Ustilago maydis come un Trojan Horse per In Situ consegna di mais proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-08T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 38 s
Description: Scopri il metodo Trojan Horse per la consegna in situ di proteine nel mais usando Ustilago maydis. Questa tecnica consente di studiare l'infezione e le funzioni proteiche con alta risoluzione spaziale e temporale nei tessuti vegetali.

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Gli autori vorrei ringraziare Thomas Dresselhaus, Martin Parniske, Noureddine Djella e Armin Hildebrand per la fornitura di materiale di laboratorio spazio e pianta. L'opera originale sul metodo Trojan horse era sostenuto da una borsa postdoc Leopoldina e progetto NSF IOS13-39229. Il lavoro presentato in questo articolo è stato supportato da SFB924 (progetti A14 e B14) del DFG.

1. costruzione di un U. maydis Trojan Horse
Nota: Vedere la Figura 1.
<ol><li>Amplificare un gene di interesse da mais cDNA usando gli iniettori di gene-specific e una rilettura della polimerasi del DNA. Clonare il principale prodotto di PCR e trasformare il costrutto in e. coli seguendo le istruzioni del fornitore del plasmide. Verificare il gene corretto della sequenza di interesse dal Priore di sequenziamento Sanger da utilizzare per i prossimi passi di clonazione. Nota: PCR specifiche devono essere ottimizzati a causa delle specificità di sequenza primer e condizioni di reazione ottimale della polimerasi del DNA.</li>
	<li>Disegnare primers per amplificare il gene mais di interesse senza la sequenza che codifica un peptide segnale (SP).</li>
	<li>Estendere l'estremità a 5 minuti del reverse primer con il motivo RSIATA e un Ncoio taglio sito (tabella 1).</li>
	<li>Amplificare il mais gene di interesse con una correzione di bozze polimerasi del DNA utilizzando il costrutto PCR generato in 1.1 come il modello PCR.</li>
	<li>Matrimoniale-digerire il prodotto PCR e il plasmide trasformazione U. maydis , p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha15, con XbaI e Nco I. purificare il digestato prodotto di PCR e plasmide.</li>
	<li>Legare il prodotto PCR digerito nel p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmmac1-mCherry-Ha modello utilizzando T4 DNA ligasi seguendo le istruzioni del produttore. Trasformare il prodotto di legatura in e. coli e verificare il gene corretto della sequenza di interesse di Sanger sequenziamento.</li>
	<li>Linearizzare il p123-PUmpit2-SpUmpit2- Zmgene di interesse-mCherry-Ha con l'enzima di restrizione Sspio e trasformazione del DNA in u solopathogenic . maydis ceppo SG20016. Isolare U. maydis trasformanti Carbossina selezione e confermare trasformanti isolati da Southern blot analisi16. Nota: Per ogni proteina d'interesse, almeno tre indipendenti U. maydis trasformanti dovrebbero essere isolato e analizzati per valutare eventuali effetti di fenotipo di sfondo casuale mutazioni.</li>
</ol>2. terreni di coltura
<ol><li>Preparare YEPSlight liquido medio16: Estratto di lievito 1,0% (p/v), 0,4% (p/v) Bacto-Peptone e saccarosio 0,4% (p/v). Sciogliere tutti i componenti in ddH2O e sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 min; sterilizzazione in autoclave ad una temperatura superiore, per un lungo periodo di tempo o ripetutamente ridurrebbe la qualità del mezzo.</li>
	<li>Preparare le patate-destrosio-agar (PD-agar)20: 3,9% (p/v) patata destrosio agar e 1,0% (p/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (f.c. 0,01 M). Mescolare tutti i componenti direttamente in bottiglia per sterilizzazione in autoclave e aggiungere ddH2O più un ancoretta magnetica. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 min; sterilizzazione in autoclave ad una temperatura superiore, per un lungo periodo di tempo o ripetutamente ridurrebbe la qualità del mezzo.</li>
	<li>Preparare il PD-Charcoal agar20: 3,9% (p/v) patata destrosio agar, carbone 1% (p/v) e 1.0% (v/v) 1 M Tris-HCl pH 8.0 (f.c. 0,01 M). Mescolare tutti i componenti direttamente in bottiglia per sterilizzazione in autoclave e aggiungere ddH2O più un ancoretta magnetica. Sterilizzare in autoclave a 121 ° C per 15 min; sterilizzazione in autoclave ad una temperatura superiore, per un lungo periodo di tempo o ripetutamente ridurrebbe la qualità del mezzo.</li>
</ol>3. pianta infezione
<ol><li>Eseguire analisi di mais divisione cellulare in risposta a Trojan horse consegnato proteine (ad es., conta di base di microscopia cellulare) in anticipo. U. maydis-ha indotto la proliferazione delle cellule di mais e formazione successiva del tumore inizia intorno a 4-5 giorni post infezione. Valutazione quantitativa malattia dipendono dal tessuto e devono essere eseguite da 6 a 14 giorni post infezione. Nota: Cultivar di mais distinte mostrano diversi livelli di suscettibilità all'infezione U. maydis . Mais cvs W23, A188, flint Gaspe, Early Golden Bantam o Va35 mostrano suscettibilità nei confronti di questo agente patogeno e così sono cultivar adatto per studi di Trojan horse.</li>
	<li>Preparazione dell'inoculo U. maydis
	<ol>
<li>Includono il ceppo progenitore SG200 come controllo negativo in tutti gli esperimenti di Trojan horse al fine di stimare gli effetti collaterali sull'infezione dal ceppo transgenico. Qui, usare un ceppo di U. maydis esprimendo una versione non-secreto della proteina di interesse come controllo negativo. Tuttavia, per ragioni di praticabilità (ad es., grandi proiezioni), il ceppo progenitore può essere la scelta più facile del controllo.</li>
		<li>Prima di iniziare l'esperimento, stimare quali importi della cultura di infezione sono necessari. Tenete a mente che l'infezione di ogni pianta richiede 1-1.5 mL di sospensione U. maydis dipendono dal tipo di tessuto mais. Nota: Circa 1 mL di una coltura durante la notte è sufficiente per la diluizione di un OD600 di 0,2 in 20 mL di mezzo YEPSluce e 25 mL di una cultura di U. maydis con un OD600 di 0.8-1.0 sono sufficienti per l'infezione di piante di 13-16.</li>
		<li>Gratta e Vinci U. maydis da un agar PD piastra utilizzando una pipetta Pasteur sterile, inoculare in 5 mL di terreno YEPSluce e lasciare che la cultura crescere a 28 ° C con agitazione costante a 200 giri/min per 16 h.</li>
		<li>Prima dell'infezione, è necessario esaminare la cultura di inoculazione U. maydis da microscopia chiara standard per la corretta crescita e contaminazione batterica a 400 ingrandimenti. Nota: In una cultura adatta, solo il fungo a forma di sigaro è visibile (Figura 2).</li>
		<li>Mescolare 900 µ l di YEPS frescaluce con 100 µ l della coltura durante la notte e misurare il OD600 YEPSluce mezzo come un vuoto nell'analisi spettrofotometro.</li>
		<li>Diluire la cultura pernottamento con mezzo diluce YEPS fresco a un OD600 di 0.2 e lasciare che la cultura crescere a 28 ° C con agitazione costante a 200 giri/min fino a raggiungere la fase di crescita del Mid-log indicato da un OD600 nm di 0.8-1.0. Nota: U. maydis cellule duplicare ogni 2 h in queste condizioni, così il desiderato OD600 è raggiunta dopo 4-5 h di coltivazione.</li>
		<li>Raccogliere le cellule OD600 di 0.8-1.0 di filatura a 3.000 x g per 10 min e scartare il surnatante.</li>
		<li>Lavare il pellet cellulare una volta con ddH2O. A tale scopo, aggiungere un volume di cultura di ddH2O, spin con 3000 x g per 10 min e scartare il surnatante.</li>
		<li>Risospendere il pellet cellulare attentamente in ddH2O utilizzando una pipetta di vetro da 20 mL, aggiustando in questo modo il finale OD600 a 3.0 (per l'analisi di un Trojan horse) o 1.0 (per voto di malattia).</li>
	</ol></li>
	<li>Verifica del Trojan horse: planta secrezione della proteina di fusione mais
	<ol>
<li>Infettare piantine di mais con un Trojan horse ceppo17.</li>
		<li>Eseguire formazione immagine microscopica delle piantine infette alle 2-3 giorni post infezione utilizzando un microscopio confocale a scansione laser. A tal fine, asportare un pezzo rettangolare di foglia 1 cm di sotto del punto di iniezione, posizionare il campione su un vetrino da microscopio e aggiungere una goccia di ddH2O. Per visualizzare la proteina di fusione mCherry, eccitare esemplare a λ = 561 nm ed emissione record a λ = 580-630 nm.</li>
	</ol></li>
	<li>Infezione di foglie di mais adulti
	<ol>
<li>Coltivare piante di mais alla fase di foglie adulte (quando almeno foglia 7 cresce all'interno del gambo). Nota: Questa fase viene raggiunta dopo quattro settimane dopo la semina in serra di 14 h, 28 ° C giorno/10 h, ritmo di notte di 22 ° C utilizzando CV W23. Durata può variare con le condizioni di cultivar e serra di mais.</li>
		<li>Diffondere la cultura di U. maydis (Vedi 3.2.9) in una siringa da 3 mL con ago ipodermico 20 x 1.</li>
		<li>Premere il gambo con attenzione per localizzare il tessuto di meristema nel gambo. La base del meristema può essere distinto da una transizione dal gambo più difficile al tessuto più morbido.</li>
		<li>Contrassegnare il meristema sul gambo con una penna.</li>
		<li>Iniettare 1,5 mL di U. maydis cultura 1 cm sopra il tiro meristem o di un meristema infiorescenza.</li>
		<li>Valuta i sintomi della malattia a 6 e 12 giorni post infezione.</li>
	</ol></li>
	<li>Infezione di nappe
	<ol>
<li>Coltivare piante di mais fino a raggiungere la fase di nappa. Nota: Una cronologia temporale dettagliata sullo sviluppo dell'antera e nappa in mais CV W23 era precedentemente descritti1819. Nappe contenenti pre-meiotic antere sono altamente suscettibili all'infezione U. maydis ; nel mais CV W23 nappe sono le dimensioni di 4-7 cm.</li>
		<li>Premere il gambo con attenzione per localizzare la nappa nel gambo.</li>
		<li>Contrassegnare la punta e la base della nappa sul fusto mediante una penna.</li>
		<li>Diffondere la cultura di U. maydis (Vedi 3.2.9) in una siringa da 3 mL con ago ipodermico 20 x 1.</li>
		<li>Iniettare 1,5 mL di inoculo intorno la nappa. Per garantire un'equa distribuzione dell'inoculo, posizionare lentamente 0,5 mL ciascuno presso la punta, la parte centrale e la base della nappa segnata con la penna.</li>
		<li>Valuta i sintomi della malattia a 10 giorni post infezione.</li>
	</ol></li>
	<li>Infezione delle orecchie Nota: lo sviluppo di tessuto orecchio differisce in distinte cultivar di mais e condizioni di serra e devono essere attentamente osservato prima dell'inoculazione. Orecchie a partire da superare sete sono altamente suscettibili all'infezione U. maydis .<ol>
<li>Diffondere la cultura di U. maydis (Vedi 3.2.9) in una siringa da 3 mL con ago ipodermico 20 x 1.</li>
		<li>Iniettare l'ago di inoculazione nello spazio tra le foglie di buccia più profondamente possibile senza danneggiare l'orecchio.</li>
		<li>Versione 1,5 mL di inoculo intorno all'orecchio.</li>
		<li>Rimuovere la siringa plus ago e massaggiare accuratamente pannocchia per distribuire la soluzione U. maydis ugualmente.</li>
		<li>Valuta i sintomi della malattia alle 14 giorni post infezione.</li>
	</ol></li>
	<li>Confermare la vitalità dell'inoculo U. maydis
	<ol>
<li>Goccia di 10 µ l di inoculo su una piastra di agar carbone PD e incubare a temperatura ambiente per 2 giorni. Nota: Se la rispettiva cultura U. maydis è in grado di filamenti di forma, micelio bianco, lanuginoso diventa visibile (Figura 5)</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Kämper, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+from+the+genome+of+the+biotrophic+fungal+plant+pathogen+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insights from the genome of the biotrophic fungal plant pathogen Ustilago maydis.</a> Nature. 444, 97-101 (2006).</li>
<li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+compatibility+in+the+Ustilago+maydis%2Fmaize+pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Establishment of compatibility in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Journal of Plant Physiology. 165, 29-40 (2008).</li>
<li>Matei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+to+make+a+tumour%3A+cell+type+specific+dissection+of+Ustilago+maydis-induced+tumour+development+in+maize+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">How to make a tumour: cell type specific dissection of Ustilago maydis-induced tumour development in maize leaves.</a> New Phytologist. , (2018).</li>
<li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+a+maize+plant%3A+transcriptional+and+metabolic+changes+induced+by+the+fungal+biotroph+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Reprogramming a maize plant: transcriptional and metabolic changes induced by the fungal biotroph Ustilago maydis.</a> The Plant Journal. 56, 181-195 (2008).</li>
<li>Doehlemann, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pep1%2C+a+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis.%2C+is+required+for+successful+invasion+of+plant+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Pep1, a secreted effector protein of Ustilago maydis., is required for successful invasion of plant cells.</a> PLOS Pathogens. 5, e1000290(2009).</li>
<li>Redkar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+effector+protein+of+Ustilago+maydis+guides+maize+leaf+cells+to+form+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">A secreted effector protein of Ustilago maydis guides maize leaf cells to form tumors.</a> The Plant Cell. 27, 1332-1351 (2015).</li>
<li>Djamei, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+priming+by+a+secreted+fungal+effector%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Metabolic priming by a secreted fungal effector.</a> Nature. 478, 395-398 (2011).</li>
<li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+secreted+Ustilago+maydis+effector+promotes+virulence+by+targeting+anthocyanin+biosynthesis+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A secreted Ustilago maydis effector promotes virulence by targeting anthocyanin biosynthesis in maize.</a> eLife. 3, e01355(2014).</li>
<li>Mueller, A. N., Ziemann, S., Treitschke, S., Assmann, D., Doehlemann, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compatibility+in+the+Ustilago+maydis-maize+interaction+requires+inhibition+of+host+cysteine+proteases+by+the+fungal+effector+Pit2%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Compatibility in the Ustilago maydis-maize interaction requires inhibition of host cysteine proteases by the fungal effector Pit2.</a> PLOS Pathogens. 9, e1003177(2013).</li>
<li>Ziemann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+apoplastic+peptide+activates+salicylic+acid+signalling+in+maize%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">An apoplastic peptide activates salicylic acid signalling in maize.</a> Nature Plants. 4, 172-180 (2018).</li>
<li>Juárez-Montiel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corn+smut+%28%27Huitlacoche%27%29+as+a+new+platform+for+oral+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The corn smut ('Huitlacoche') as a new platform for oral vaccines.</a> PLoS One. 10, e0133535(2015).</li>
<li>Sarkari, P., Feldbrügge, M., Schipper, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSarkari%2C+P+%22Gene+Expression+Systems+in+Fungi%3A+Advancements+and+Applications%22">Gene Expression Systems in Fungi: Advancements and Applications</a>. Schmoll, M., Dattenböck, C. , Springer International Publishing. 183-200 (2016).</li>
<li>Monreal-Escalante, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corn+smut-made+cholera+oral+vaccine+is+thermostable+and+induces+long-lasting+immunity+in+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">The corn smut-made cholera oral vaccine is thermostable and induces long-lasting immunity in mouse.</a> Journal of Biotechnology. 234, 1-6 (2016).</li>
<li>Stock, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+unconventional+secretion+of+the+endochitinase+Cts1+to+export+heterologous+proteins+in+Ustilago+maydis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Applying unconventional secretion of the endochitinase Cts1 to export heterologous proteins in Ustilago maydis.</a> Journal of Biotechnology. 161, 80-91 (2012).</li>
<li>van der Linde, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogen+Trojan+horse+delivers+bioactive+host+protein+to+alter+maize+%28Zea+mays%29+anther+cell+behavior+in+situ%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogen Trojan horse delivers bioactive host protein to alter maize (Zea mays) anther cell behavior in situ.</a> The Plant Cell. 30, 528-542 (2018).</li>
<li>Bösch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+the+plant+pathogen+Ustilago+maydis+to+study+fungal+biology+and+plant+microbe+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of the plant pathogen Ustilago maydis to study fungal biology and plant microbe interactions.</a> Journal of Visualized Experiments. , e54522(2016).</li>
<li>Chavan, S., Smith, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+efficient+method+for+assessing+pathogenicity+of+Ustilago+maydis+on+maize+and+teosinte+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A rapid and efficient method for assessing pathogenicity of Ustilago maydis on maize and teosinte lines.</a> Journal of Visualized Experiments. 50712, (2014).</li>
<li>Kelliher, T., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emergence+and+patterning+of+the+five+cell+types+of+the+Zea+mays+anther+locule%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Emergence and patterning of the five cell types of the Zea mays anther locule.</a> Developmental Biology. 350, 32-49 (2011).</li>
<li>Egger, R. L., Walbot, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+Zea+mays.+tassel+development+and+correlation+with+anther+developmental+stages+as+a+guide+for+experimental+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Maydica%22%5BJournal%5D)">Quantifying Zea mays. tassel development and correlation with anther developmental stages as a guide for experimental studies.</a> Maydica. 60, M34(2015).</li>
<li>Holliday, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHolliday%2C+R+%22Bacteria%2C+Bacteriophages%2C+and+Fungi%3A+Volume+1%22">Bacteria, Bacteriophages, and Fungi: Volume 1</a>. King, R. C. , Springer US. 575-595 (1974).</li>
<li>Doehlemann, G., Reissmann, S., Aßmann, D., Fleckenstein, M., Kahmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+linked+genes+encoding+a+secreted+effector+and+a+membrane+protein+are+essential+for+Ustilago+maydis-induced+tumour+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Two linked genes encoding a secreted effector and a membrane protein are essential for Ustilago maydis-induced tumour formation.</a> Molecular Microbiology. 81, 751-766 (2011).</li>
<li>Banuett, F., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+a+alleles+of+Ustilago+maydis+are+necessary+for+maintenance+of+filamentous+growth+but+not+for+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Different a alleles of Ustilago maydis are necessary for maintenance of filamentous growth but not for meiosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 86, 5878-5882 (1989).</li>
<li>Bortfeld, M., Auffarth, K., Kahmann, R., Basse, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ustilago+maydis+a2+mating-type+locus+genes+lga2+and+rga2+compromise+pathogenicity+in+the+absence+of+the+mitochondrial+p32+family+protein+Mrb1%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">The Ustilago maydis a2 mating-type locus genes lga2 and rga2 compromise pathogenicity in the absence of the mitochondrial p32 family protein Mrb1.</a> The Plant Cell. 16, 2233-2248 (2004).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Ricerca di coltura moderna richiede protocolli per l'analisi molecolare sulla genetica e i livelli della proteina. Accessibilità genetica tramite trasformazione non è disponibile o inefficiente e richiede molto tempo per la maggior parte delle specie coltivate come il mais. Inoltre, affidabili strumenti genetici quali sistemi reporter promotore sono scarse, che rende difficile studiare la funzione della proteina in situ con alta risoluzione spazio-temporale a siti di tessuto distinti. Apoplastico proteine posson...

L'agente patogeno biotrophic Ustilago maydis è l'agente causativo del mais smut malattia1. Essa colpisce tutte le parti aeree di mais con conseguente grandi tumori che contengono spore melanized, nero. A livello globale, U. maydis è stimata per causare una perdita annua di circa il 2% di rendimento di mais, mentre i tumori sono apprezzati come una prelibatezza gastronomica in Messico. Infezione di pianta è iniziata da un appressorium che secerne enzimi lisante parete cellulare per penetrare il primo strato di cellule epidermiche mais. Da un sito di infezione primaria, U. maydis cresce intracellulare e intercellularmente, invadendo la cella di uno o due strati ogni giorno1,2. Risultati di successo infezione nell'ipertrofia di pianta che si trasforma in tumori visibili su cinque giorni post infezione1,3,4. Durante tutte le fasi di infezione, i hyphae fungosi invaginano la membrana di citoplasma pianta senza alcun contatto diretto con l'host citoplasma1,2. Lo spazio di apoplasmic stretto tra le ife d'infezione e la membrana del plasma di pianta è considerato il sito interattivo di ospite/patogeno, chiamato la zona di interazione biotrophic. Al fine di superare il sistema immunitario innato di pianta, U. maydis secerne una matrice di proteine effettrici nel biotrophic interazione zona1. Alcuni effettori sono presi dalle cellule vegetali, mentre altri rimangono nel biotrophic interazione fuso5,6,7,8. Uno apoplastico effector è UmPit2, che interagisce con le proteasi apoplastico mais per impedire il rilascio del peptide ZmZIP1 da ZmPROZIP da apoplastico proteasi attività9,segnalazione10.
Negli ultimi decenni, U. maydis è diventato non solo un modello per la genetica fungina nell'interazione pianta-patogeno, ma anche uno strumento prezioso in biotecnologie a causa di un ciclo di vita ben compresa, facile accessibilità genetica e l'espressione eterologa di secreto proteine11,12,13. Segnali per entrambi secrezione di proteine convenzionali e non convenzionali sono stati determinati che consente il controllo delle modifiche di posttranslational14. Recentemente, U. maydis è stato usato come uno strumento di Trojan horse per studiare piccole, secreto mais proteine in situ15. L'approccio di Trojan horse è stato usato con successo per analizzare la funzione della proteina secreta, piccola ZmMAC1 che si occupa dello sviluppo dell'antera. ZmMAC1 induce la divisione periclinal di cellule pluripotenti e specifica di destino delle cellule delle cellule neonata15. Con lo stesso metodo, la funzione biologica del mais danni-associated peptide ZmZIP1 è stata rivelata. U. maydis che secerne il mais che zmzip1 ha provocato alterato tumore formazione10. Così, il Trojan horse approccio rappresenta un prezioso itinerario alternativo alla proteina in situ studi ad alta risoluzione spazio-temporale che non richiedono la generazione di linee di trasformazione mais stabile né infiltrazione del tessuto con heterologously proteine espresse e purificate. In particolare, la strategia di Trojan horse permette la secrezione di tutta la proteina eterologa in mais apoplasto e confronto diretto di infetti contro cellule vegetali non infetti all'interno del tessuto stesso.
Questo protocollo illustra i passaggi principali per la generazione di un ceppo di Trojan horse U. maydis per studiare una proteina di interesse. Comprende ulteriori informazioni precise sulle procedure di infezione di tre tipi differenti del tessuto mais (foglie adulte, nappe e orecchie) con U. maydis, che è un prerequisito per studiare la funzione della proteina e progressione di spatiotemporal infezione in questi tessuti bersaglio. Ulteriori specificazioni non sono determinato su mais l'amplificazione del gene e microscopiche imaging tecniche, dal momento che questi passaggi sono specifici per la destinazione e strumento-dipendente. Così, questo protocollo è rivolto a utenti esperti di tecniche di biologia molecolare standard.

<table><tbody><tr><td>Siringa da 2 ml&nbsp;</td><td>B. Braun</td><td>4606027V</td><td></td></tr><tr><td>23 G x 1 1/4 ago ipodermico</td><td>B. Braun</td><td>4657640</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone&nbsp;</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>cDNA da mais</td><td></td><td></td><td>da tessuto di mais che esprime il gene dell'interrest</td></tr><tr><td>Carbone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>05105</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td></td><td></td> a scansione laser confocale <td>utilizzare attrezzature disponibili localmente</td></tr><tr><td>Cuvetta (10 mm x 4 mm x 45 mm)</td><td>Sarstedt</td><td>67742</td><td></td></tr><tr><td>Incubatrice-agitatore impostato a 28 &deg; C, 200 giri/min</td><td></td><td></td><td>utilizzare l'attrezzatura disponibile localmente</td></tr><tr><td>Microscopio ottico con ingrandimento</td><td></td><td></td> 400 volte <td>utilizzare l'attrezzatura disponibile</td></tr> <tr><td>localmenteNco I</td><td>NEB</td><td>R0193</td><td></td></tr><tr><td>p123-PUmpit2-SpUmpit2-Zmmac1-mCherry-Ha</td><td></td><td></td><td>si prega di contattare l'autore corrispondente&nbsp;</td></tr><tr><td>Pipetta Pasteur (vetro, punta lunga)</td><td>VWR</td><td>14673-043</td><td></td></tr><tr><td>pCR-Blunt-II-TOPO</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K280002</td><td>può essere sostituita con altri vettori di clonazione di base come pENTR o pJET</td></tr><tr><td>Destrosio di patata Agar&nbsp;</td><td>VWR</td><td>90000-745</td><td></td></tr><tr><td>Sharpie pen</td><td></td><td></td><td>utilizza apparecchiature disponibili localmente</td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td></td><td></td><td>utilizza apparecchiature disponibili localmente</td></tr><tr><td>Ssp I</td><td>NEB</td><td>R0132</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligasi</td><td>NEB</td><td>M0202</td><td></td></tr><tr><td>TRIS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><<tr><td>em>Xba I</td><td>NEB</td><td>R0145</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito&nbsp;</td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzando ustilago maydis come un trojan horse per in situ consegna di mais proteine

Using Ustilago maydis as a Trojan Horse for In Situ Delivery of Maize Proteins

Ispirato a Homer´s Trojan horse mito, abbiamo progettato il patogeno mais Ustilago maydis per trasportare proteine secrete nel mais apoplasto permettendo l'analisi fenotipica in vivo. Questo metodo non si basa sulla trasformazione mais ma sfrutta genetica microbica e capacità secretiva di agenti patogeni. Nel presente documento, esso permette di ispezione di in vivo consegnato proteine secrete con alta risoluzione spazio-temporale a diversi tipi di siti d'infezione e tessuti. La strategia di Trojan horse possa essere utilizzata per integrare transitoriamente mais fenotipi di perdita-de-funzione, per caratterizzare funzionalmente domini proteici, per analizzare gli effetti della proteina fuori bersaglio, o per studiare l'iperdosaggio proteina-gioco, che lo rende un potente strumento per studi della proteina nel sistema raccolto del mais. Quest'opera contiene un protocollo preciso su come generare un ceppo di Trojan horse seguito da protocolli standardizzati infezione per applicare questo metodo a tre tipi di mais differenti del tessuto.

Costrutti per U. maydis Trojan horse esperimenti sono clonati nel plasmide p123-PUmpit2-SpUmpit2-gene di interesse-mCherry-Ha. Il mais gene di interesse è fusa ad un reporter di fluorescenza mCherry e un epitopo HA-tag. L'espressione della proteina di fusione è sotto il controllo del promotorepit2 U. maydis Um che specificamente si attiva durante l'infezion...

Questo lavoro descrive la clonazione di un ceppo di Trojan horse Ustilago maydis per la consegna in loco delle proteine secrete mais in tre diversi tipi di tessuti mais.

Utilizzando Ustilago maydis come un Trojan Horse per In Situ consegna di mais proteine

Inspired by Homer&#180;s Trojan horse myth, we engineered the maize pathogen Ustilago maydis to deliver secreted proteins into the maize apoplast ...

Lo studio dei processi sui livelli genetici e proteici è fondamentale nella ricerca sulle colture. Il nostro approccio consente l'ispezione di proteine del labirinto secrete con la massima risoluzione temporale spaziale a diversi lati e tessuti di infezione. Il metodo Trojan Horse esplora utili capacità di secretoria automatizzata.Aggira le trasformazioni del labirinto che richiedono tempo e sfidano e facilita studi dettagliati sulle proteine secrete all'interno del labirinto appelplatz. Informazioni dettagliate sulla corretta infezione di foglie di labirinto aggiunte, nappe e orecchio. E mostra lo studio riuscito della progressione dell'infezione e della funzione proteica nel tessuto bersaglio.A dimostrare la procedura sarà Isabell Fiedler, una studentessa del laboratorio. Per iniziare l'esperimento, graffiare Eumadous da una piastra pediatra usando una pipetta pasteur sterile. Inoculare 5 millilitri di YEPS Light Medium con Eumadous.Fai crescere la cultura a 28 gradi Celsius, con scuotimenti costanti a 200 giri/min per 16 ore. Il giorno dopo mescolare 900 microlitri di luce YEPS fresca con 100 microlitri della cultura notturna. Misurate l'OD-600 utilizzando YEPS Light Medium come vuoto nell'analisi dello spettrofotometro.Diluire la cultura notturna con yeps light medium fresco a un OD-600 di 2. Lascia che la cultura cresca a 28 gradi Celsius con scuotimenti costanti a 200 giri/min, fino a raggiungere la fase di crescita del tronco medio, indicata da un OD-600 da 8 a 1,0. Dopo l'incubazione, raccogliere le cellule facendole girare a 3000 volte chi per 10 minuti.Scartare il supernatante. Quindi, lavare la pilette cellulare una volta con 1 volume di coltura di DDH2O. Ruotare le cellule a 3000 volte chi per 10 minuti e scartare il supernatante.Quindi, sospendere attentamente la pilette cellulare in DDH2O, utilizzando una pipetta di vetro da 20 millilitri. Regolando così l'OD-600 finale a 3.0 per un test trojan horse o 1.0 per la valutazione della malattia. Coltiva le piante di labirinto in uno stadio di foglie adulte, dove almeno la foglia 7 cresce all'interno del gambo.Successivamente, trasferire la cultura Eumadous in una siringa da 3 millilitri con un ago ipodermico bi uno calibro 20. Premere attentamente il gambo per localizzare il tessuto stelo specchio. La base dello specchio può essere distinta per una transizione dal gambo più duro al tessuto più morbido.Contrassegnare lo stelo dello specchio sul gambo usando una penna. Iniettare 1,5 millilitri di coltura eumadosa 1 centimetro sopra il gambo shoot mirror o il gambo specchio infiorescenza. Una volta che le piante di labirinto raggiungono lo stadio della nappa, premere attentamente il gambo per localizzare la nappa nel gambo.Contrassegnare la punta e la base della nappa sullo stelo usando una penna. Trasferire la coltura eumadosa in una siringa da 3 millilitri con un ago ipodermico bi uno da 20 gauge per iniettare un totale di 1,5 millilitri dell'inoculo intorno alla nappa. Per assicurare un'equa distribuzione dell'inoculo, posizionare lentamente 5 millilitri sulla punta, al centro e alla base della nappa contrassegnata con la penna.Trasferire la cultura Eumadous in una siringa da 3 millilitri con ago ipodermico bi uno calibro 20. Iniettare l'ago di inoculazione nello spazio tra le foglie della buccia il più profondamente possibile senza ferire l'orecchio, quindi rilasciare 1,5 millilitri dell'inoculo intorno all'orecchio. Quindi, rimuovere la siringa e l'ago e massaggiare accuratamente la sfera per distribuire equamente la soluzione Eumadous.Far cadere 10 microlitri di inoculo su una piastra di coclea di carbone PD. Quindi incubare a temperatura ambiente per 2 giorni. Hyphae secendo ZM Mach1 sono circondati da segnale fluorescente e ciliegio.Al contrario, le ife non secrenti mostrano solo un segnale fluorescente nel citoplasma fungino. Una localizzazione impropria della nappa o una distribuzione iniqua dell'inoculo può causare nappe non infette o solo un'infezione parziale della nappa rispetto alla distribuzione uniforme. Il ceppo di progenestere del cavallo di patogeno solo SG-200, coltivato su coclea di carbone PD, forma filamenti di lanugine bianca sul piatto come mostrato.Mentre il ceppo Eumadous FB1 richiede l'accoppiamento prima della formazione infettiva dei filamenti. Dopo l'infezione, la possibile risposta di segni la proteina epatica cavallo di può essere analizzata utilizzando vari metodi tra cui valutazioni della malattia o imaging microscopico. Per molti agenti patogeni, la trasformazione e la secrezione sono ben comprese e possono essere esplorate in modo simile.Pertanto, consentono lo studio dell'host, che non è suscettibile alla trasformazione.

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Research

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JoVE Journal

Genetics

Genetica

Fonte: Beernink, B. M. et al. Agroinoculazione diretta di piantine di mais tramite iniezione con cloni infettivi del virus del mosaico della coda di volpe e del virus del mosaico della canna da zucchero. J. Vis. Esp. (2021)Questo video dimostra la somministrazione mediata da Agrobacterium di cloni virali ricombinanti nelle piantine di mais per il silenziamento genico. Descrive il processo di infezione da Agrobacterium , la diffusione sistemica del virus e i cambiamenti fenotipici guidati...

Somministrazione mediata da agrobatterio di cloni virali ricombinanti nelle piantine di mais per silenziamento genico

Viene descritto l'uso di un metodo di iniezione dell'ago per inoculare il mais e le piante teosinte con l'agente patogeno biotrofico Ustilago maydis.  Il metodo di inoculazione dell'iniezione dell'ago facilita la somministrazione controllata dell'agente patogeno fungino tra le foglie della pianta in cui l'agente patogeno entra nella pianta attraverso la formazione di appresoria. Questo metodo è altamente efficiente, consentendo inoculazioni riproducibili con U. maydis.

Un metodo rapido ed efficiente per valutare la patogenicità dei maydis di Ustilago sulle linee di mais e teosinte

Descriviamo una strategia di sostituzione genica robusta per manipolare geneticamente il fungo fuliggine Ustilago maydis. Questo protocollo spiega come generare mutanti di delezione di indagare fenotipi infezione. Può essere esteso per modificare geni in qualsiasi modo desiderato, per esempio, aggiungendo una sequenza codificante un tag proteina fluorescente.

La manipolazione genetica del patogeno per le piante<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; Per studiare Fungal Biology and Plant Microbo Interazioni

Qui presentiamo un protocollo per analizzare Aspergillus flavus crescita e produzione di aflatossina in chicchi di mais che esprime una proteina di antimicotica.  Usando un ceppo che esprimono GFP a. flavus abbiamo controllato l'infezione e la diffusione del fungo nei kernel maturo in tempo reale. Il test è rapido, affidabile e riproducibile.

Inibizione di crescita di Aspergillus flavus e produzione di aflatossina nel mais transgenici che esprimono la α-amilasi inibitore da Dolichos lablab L.

I geni morfogenici delle piante possono essere utilizzati per migliorare la trasformazione genetica dei genotipi recalcitranti. Descritto qui è un protocollo di trasformazione genetica mediata agrobatterica(QuickCorn) per tre importanti linee pubbliche di mais.

Agrobacterium- Trasformazione dell'embrione immaturo mediato delle linee inbrete di mais recalcitranti utilizzando geni morfogenici

Viene presentato un protocollo di iniezione (agroiniezione) a base di Agrobacterium per l'inoculazione del virus del mosaico a coda di volpe e dei virus del mosaico della canna da zucchero in piantine di mais. L'inoculazione in questo modo porta a infezioni virali, silenziamento genico indotto da virus di geni marcatori e sovraespressione virale di GFP.

Agroinoculazione diretta di piantine di mais per iniezione con cloni infettivi del virus del mosaico della coda di volpe ricombinante e virus del mosaico della canna da zucchero

Qui, presentiamo un protocollo ad alto rendimento per trasfettare transitoriamente milioni di protoplasti di mais per testare grandi librerie di plasmidi nelle cellule di mesofillo del mais.

Trasfezione scalabile dei protoplasti mesofilli di mais

sequenziamento cella singola è uno strumento sempre più popolare e accessibile per affrontare le modifiche genomiche ad alta risoluzione. Forniamo un protocollo che utilizza un'unica sequenza cella per identificare il numero di copia alterazioni in singole cellule.

Rilevamento di Copy Number Alterazioni Utilizzando Sequencing Single Cell

Viene presentata una strategia per generare mutazioni nei geni istonici nella loro posizione endogena in Saccharomyces cerevisiae.

Mirata<em&gt; In Situ</em&gt; mutagenesi dell&#39;istone geni in germogliamento lievito

Qui descriviamo la consegna del microRNA usando un virus ricombinante adeno-associato sierotipo 9 in un modello murino di una malattia neuromuscolare. Una singola somministrazione periferica nei topi ha provocato la sovraespressione di miRNA sostenuta nel muscolo e motoneuroni, offrendo l'opportunità di studio miRNA funzione e potenziale terapeutico in vivo.

Consegna sistemica di MicroRNA usando ricombinanti Virus Adeno-associato sierotipo 9 per trattare malattie neuromuscolari in roditori

Scopri il metodo Trojan Horse per la consegna in situ di proteine nel mais usando Ustilago maydis. Questa tecnica consente di studiare l'infezione e le funzioni proteiche con alta risoluzione spaziale e temporale nei tessuti vegetali.

Utilizzando Ustilago maydis come un Trojan Horse per In Situ consegna di mais proteine

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