Name: Utilizzando Enhanced fluorescenza verde che esprimono proteine Escherichia Coli per valutare la fagocitosi dei macrofagi peritoneali del Mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 35 s
Description: Scopri un metodo rapido per valutare la fagocitosi dei macrofagi peritoneali del mouse utilizzando Escherichia coli che esprime EGFP. Questo protocollo riproducibile aiuta a studiare la funzione immunitaria innata e le differenze legate all'età.

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La Fondazione di scienza naturale nazionale della Cina (No. 31800046) e la Fondazione con scienze naturali della provincia di Liaoning (No. 20170540262) sostenuto questo lavoro. Questo lavoro è stato compiuto nei laboratori del centro di ricerca scientifica all'università secondo ospedale di Dalian medica. Gli autori vorrei ringraziare Xiao Lin Sang per la sua assistenza con la citometria a flusso e Bo Qu e Yang Dong-Chuan per la loro assistenza nella produzione video.

Tutte le procedure sono state effettuate nell'ambito degli istituti nazionali di salute orientamenti per la cura e l'uso di animali da laboratorio e i protocolli sono stati approvati dalla cura degli animali e uso Comitato di Dalian Medical University. Sedici mesi (con un peso corporeo di 30-35 g) e otto-settimana-vecchio topo C57BL/6 (specifiche-patogeno-free) maschio (20-25 g) SPF sono stati ottenuti dal centro animale SPF dell'Università medica di Dalian. Tutti i topi sono stati tenuti in custodia degli animali con accesso a cibo e acqua ad libitum. La temperatura è stata mantenuta a 20-24 ° C, umidità era 40% - 70%, e l'illuminazione era 12 h luce/12 h scuro. Gli animali sono stati ammessi raggiunga l'ambiente per almeno 7 giorni prima dell'esperimento.
1. costruzione del plasmide pET-SUMO-EGFP e induzione dell'espressione di EGFP
<ol><li>Sintetizzare il frammento del gene EGFP (una sequenza di bp 717 sintetizzato da un servizio di sintesi del gene personalizzato, vedere Tabella materiali e 1 File supplementari per la sequenza) e amplificare il frammento con il primer forward ( 5'-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3') e reverse primer (5'-CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3'), utilizzando ad alta fedeltà Taq DNA polimerasi.</li>
	<li>Per garantire che i prodotti di reazione a catena (PCR) polimerasi single 3' adenina sporgenze per la clonazione TA nel passaggio successivo, è possibile utilizzare un'estensione di 30 min a 72 ° C dopo l'ultimo ciclo (Vedi 1 File supplementari per le condizioni di PCR). Controllare il prodotto PCR mediante elettroforesi su gel di agarosio.</li>
	<li>Clonare il prodotto di PCR nel vettore animale-SUMO (Vedi Tabella materiali) utilizzando il metodo5 con T4 DNA ligasi di clonazione di TA. Incubare la reazione a temperatura ambiente (20-25 ° C) per 30 min. Il vettore è linearizzato tra nucleotidi 653 e 654 con 1 bp 5 ′ T-sporgenza su ogni filo.</li>
	<li>Trasformare il prodotto di legatura il ceppo BL21 Escherichia coli chimicamente competente come segue: aggiungere 5 µ l (100 ng) del prodotto PCR a 100 µ l di cellule competenti di BL21 via shock termico a 42 ° C per 90 s; mantenere la miscela in ghiaccio per 3 minuti e poi, aggiungere 400 µ l di terreno di brodo (LB) di Lisogenesi preriscaldato a 37 ° C, scuotendolo per 1h a 37 ° C e 120 giri/min.</li>
	<li>Inoculare 100 µ l dei batteri sulla superficie di una piastra di LB-kanamicina (100 µ g/mL) con il lattosio induttore (0,5 mmol/L), producendo il ceppo di espressione di EGFP. Incubare la piastra a 37 ° C durante la notte. Nota: Se la EGFP è espresso con successo, alcune colonie possono essere osservate come incandescente luce verde nel buio.<ol>
<li>Facoltativamente, selezionare colonie per verificare il frammento inserito EGFP di sequenziamento del DNA. Il primer di sequenziamento del DNA sono: in avanti, 5'-AGATTCTTGTACGACGGTATTAG-3'; inverso, 5'-TAGTTATTGCTCAGCGGTGG-3'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inoculare una colonia positiva in 5 mL di terreno LB con kanamicina di 100 µ g/mL. Incubare a 37 ° C in agitazione incubatore a 120 giri/min per 2 h e poi, aggiungere il lattosio induttore a una concentrazione finale di 0,5 mmol/L e continuare ad agitare per 6 h, inducendo l'espressione di EGFP. Empiricamente, quando scuotendo per 6 h, la densità ottica a 600 nanometro (OD600) può raggiungere 0,7 o superiore.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di terreno di coltura batterico su un vetrino, coprire con un vetrino coprioggetto ed esaminare l'espressione di EGFP sotto un microscopio a fluorescenza invertito. I batteri che esprimono EGFP possono depositare in mezzo a 2-8 ° C per diverse settimane.</li>
</ol>2. isolamento dei macrofagi peritoneali e colture primarie di mouse
<ol><li>Aggiungere 3,5 g di tioglicolato a 100 mL di acqua distillata ed autoclave la miscela di sterilità prima dell'uso. Pompa il mezzo tioglicolato nella siringa sterile da 1 mL nella cappa per l'iniezione peritoneale del mouse. Utilizzare un mouse per siringa per evitare l'infezione. L'uso di tioglicolato può aumentare il numero dei macrofagi. I macrofagi peritoneali residenti possono essere isolati senza tioglicolati, ma con più basso macrofago produce.</li>
	<li>Anestetizzare il mouse usando un metodo approvato dal comitato di uso e cura degli animali locale. Iniettare 1 mL di terreno di 3,5% tioglicolato nella cavità peritoneale del mouse con la siringa da 1 mL, utilizzando un ago di 23 G. Nota: Attraverso l'induzione di anestesia, l'iniezione peritoneale può essere facilmente eseguita e riduce il rischio di lesioni agli organi interni causati da iniezione.</li>
	<li>Mantenere il mouse con acqua e cibo ad libitum per 3 giorni. Monitorare l'assunzione di cibo e peso del corpo dell'animale ogni giorno. Se la perdita di peso del corpo è supera al 10% entro 3 giorni, è possibile escludere l'animale da esperimento.</li>
	<li>Dopo 3 giorni, eutanasia il mouse di dislocazione cervicale dopo l'induzione rapida anestesia di sevoflurane in una scatola chiusa. In alternativa, utilizzare un metodo che è stato approvato dal comitato animale locale di uso e la manutenzione di eutanasia il mouse.</li>
	<li>Mettere il mouse in un piatto (con un diametro di 10 cm) con 75% di etanolo per sterilizzare e trasferire rapidamente alla cappa. Posizionare il mouse su un piatto e pin la zampa anteriore alla scheda per fissare la posizione del mouse.</li>
	<li>Usando una siringa da 5 mL per un 20 G needle, ponendo la smussatura dell'ago fino ad un angolo di 30° - 40°, inietta soluzione fisiologica 5 mL di freddo (4-10 ° C) in tampone fosfato (PBS) al basso addome nella cavità peritoneale del mouse, evitando di perforare l'intestino. Se l'intestino (o qualsiasi altro organo) è forato, il mouse e le celle non più utilizzabile per esperimenti, come questo può attivare le cellule che non sono adatte per colture cellulari primarie.</li>
	<li>Eseguire un leggero massaggio sui due lati dell'addome del mouse. Quindi, aspirare il liquido lentamente e delicatamente. Versare il liquido peritoneale in una provetta da centrifuga 50 mL. Ripetere questi passaggi 2x o 3x.</li>
	<li>Centrifugare le cellule sospese per 10 min a 400 x g in una centrifuga refrigerata (4-8 ° C). Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in medium RPMI 1640 con 10% siero bovino fetale (FBS). Contare le celle. Empiricamente, la densità delle cellule è circa uguale a 5 x 106 cellule/mL quando le cellule sono risospese in 10 mL di terreno.</li>
	<li>Aggiungere 5 x 106 celle in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti per l'analisi di citometria a flusso e 5 x 105 cellule per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti per un microscopio a fluorescenza. Coltura le cellule a 37 ° C in un incubatore a CO2 5% durante la notte. Il terreno di coltura può essere aggiornato dopo 3 h per rimuovere cellule nonadherent perché la maggior parte di questi linfociti. Le cellule aderenti sono principalmente i macrofagi, e possono aderire bene alla plastica tessuto-cultura-trattati.</li>
</ol>3. test di fagocitosi macrofago utilizzando il microscopio a fluorescenza
<ol><li>Osservare le cellule al microscopio luminoso-campo per valutare la vitalità cellulare e la densità delle cellule.</li>
	<li>Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra a 24 pozzetti. Aggiungere 100 µ l di terreno di coltura fresco e 10 µ l di sospensione batterica (circa 2 x 107 cellule) in ogni pozzetto come descritto nella tabella 1. Incubare per 1 h a 37 ° C, 5% CO2 incubator.</li>
	<li>Lavare delicatamente 3 x x-5 con 500 µ l di PBS freddo per pozzetto per lavare noninternalized batteri.</li>
	<li>Incubare le cellule con formaldeide 4% in PBS a temperatura ambiente per 30 min.</li>
	<li>Lavare le cellule fisse 3 x con PBS (500 µ l/pozzetto).</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l di fluorescenza falloidina 633 tingere coniugato soluzione di lavoro (Vedi Tabella materiali) a macchiare la F-actina. Conservare in luogo buio, umido (60-80%) a temperatura ambiente per 60 min. Sciacquare le celle 3 x con PBS (500 µ l/pozzetto) per rimuovere qualsiasi falloidina in eccesso. Dalla macchiatura della F-actina, il citoplasma può essere schematizzata e aiutare a distinguere i batteri interiorizzati.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l di soluzione di lavoro di DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) (1 µ g/mL) per macchiare il nucleo delle cellule ed incubare per 5 minuti in un luogo buio, umido, a temperatura ambiente. Sciacquare 1x con PBS (500 µ l/pozzetto) e 1 x con lo stesso volume di acqua distillata. Quindi, le cellule sarà pronte per l'osservazione al microscopio di fluorescenza invertito.</li>
</ol>4. test di fagocitosi macrofago mediante citometria a flusso
<ol><li>Per ridurre al minimo gli errori sperimentali e fare una corretta interpretazione dei risultati, impostare i gruppi e tubi per l'esperimento di controllo come indicato nella tabella 2.<ol>
<li>Per il gruppo di controllo, che verrà posizionato sul ghiaccio (gruppo 4 della tabella 2), rimuovere il supporto dalla piastra 6 pozzetti e lavarlo 1x con PBS. Quindi, aggiungere 1 mL di EDTA freddo 70mm nel pozzo per staccare le cellule e trasferirli al tubo di citometria a flusso. Aggiungere 50 µ l di sospensione batterica nel tubo e posizionarlo sul ghiaccio per 1h.</li>
		<li>Per gli altri gruppi, rimuovere il terreno di coltura. Aggiungere 1 mL di medium fresco in ogni pozzetto. Aggiungere 50 µ l di sospensione batterica nei pozzetti secondo l'impostazione di gruppo, come descritto in tabella 2. Quindi, posizionare la piastra 6 pozzetti a 37 ° C, 5% CO2 incubatrice per 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per placare la fluorescenza di noninternalized e. coli, aggiungere 200 µ l di soluzione di acqua di cristallo viola (CV) 0,8% nel pozzo e ondeggiare poco, evitando così un risultato falso positivo dall'associazione che esprimono EGFP Escherichia coli alla superficie della macrofagi ma non interiorizzato. Lavare le cellule 3 x con PBS per rimuovere qualsiasi residuo CV.</li>
	<li>Quindi, aggiungere 1 mL di EDTA freddo 70mm nel pozzo per staccare le cellule e trasferirli al tubo di citometria a flusso.</li>
	<li>Centrifugare le provette a 400 x g per 5 min e scartare il surnatante.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l di PBS per risospendere le cellule. Aggiungere 5 µ l di anticorpo F4/80-PE-coniugato (un antigene di superficie espresso sui macrofagi del mouse) in tubi o isotipo uso IgG2a-PE, in base all'impostazione di gruppo. Vortex brevemente e incubare i campioni in ghiaccio per 5-10 minuti al buio.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di PBS in ogni provetta e centrifugare a 400 x g per 5 min, scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare con 200-300 µ l di PBS per l'analisi di citometria a flusso. Eseguire ogni tubo e acquisire i dati per almeno 10.000 eventi delle cellule F4/80+ .</li>
</ol>

<ol><li>Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+murine+peritoneal+macrophages+to+carry+out+gene+expression+analysis+upon+Toll-like+receptors+stimulation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation.</a> Journal of Visualized Experiments. 98, e52749(2015).</li>
<li>Iskander, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sepsis%3A+multiple+abnormalities%2C+heterogeneous+responses%2C+and+evolving+understanding%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding.</a> Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).</li>
<li>Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+severe+sepsis+in+older+patients%3A+from+epidemiology+to+evidence-based+management%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management.</a> Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).</li>
<li>Bicker, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+assay+to+measure+phagocytosis+of+live+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria.</a> Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).</li>
<li>Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Universal+TA+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Issues+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Universal TA cloning.</a> Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).</li>
<li>Chen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triggering+receptor+expressed+on+myeloid+cells-2+protects+against+polymicrobial+sepsis+by+enhancing+bacterial+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+and+Critical+Care+Medicine%22%5BJournal%5D)">Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance.</a> American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).</li>
<li>Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Macrophage+Early+and+Late+Endosomes+by+Latex+Bead+Internalization+and+Density+Gradient+Centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).</li>
<li>Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+to+determine+the+engulfment+of+apoptotic+cells+by+macrophages+using+pHrodo+succinimidyl+ester%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester.</a> Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).</li>
<li>Weingart, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+labels+influence+phagocytosis+of+Bordetella+pertussis+by+human+neutrophils%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils.</a> Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).</li>
<li>Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+flow+cytometric+method+to+evaluate+phagocytosis+of+pHrodo+BioParticles%28R%29+by+granulocytes+in+multiple+species%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species.</a> Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).</li>
<li>Ninkovic, J., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+fluorometric+technique+for+assessment+of+macrophage+phagocytosis+and+actin+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52195(2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

La procedura descritta in questo protocollo è abbastanza semplice e lineare. Una delle fasi critiche è di indurre l'espressione di EGFP su e. coli. Di solito, quando un gene da eucarioti, come EGFP, è progettato per esprimere nei procarioti come e. coli, c'è un rischio che la proteina si forma aggregati inattivi (corpi di inclusione), che cambia la struttura nativa e l'attività della proteina. Utilizzando il vettore animale-SUMO e costruendo il plasmide di animali-SUMO-EGFP, la proteina di fusione di EG...

Saggi di fagocitosi del macrofago sono spesso utilizzati per studiare la funzione immunitaria innata. La risposta immunitaria innata può indicare la suscettibilità all'infezione. Linee cellulari del macrofago sono ampiamente utilizzate negli studi di immunologia. Tuttavia, il passaggio prolungato può causare la perdita del gene e compromesse funzioni immuni in queste linee cellulari. Così, i macrofagi peritoneali primari sono l'oggetto ideale in cui studiare la funzione delle cellule1.
Anche se la risposta immunitaria innata è stata pensata per essere intatto nel corpo invecchiato, può fare diminuire la capacità fagocitica rispetto a che nel giovane corpo2,3. Qui, ci dimostrerà un metodo per valutare la fagocitosi dei macrofagi peritoneali dai giovani (otto-settimana-vecchio) e anziani (16 mesi) mouse utilizzando che esprimono EGFP e. coli, che è conveniente, veloce ed economicamente fattibile.
L'uso di un ceppo che esprimono EGFP e. coli è uno dei vantaggi di questo test perché questi batteri sono stabili e visualizzare un segnale di fluorescenza forte, anche dopo i macrofagi sono stati risolti in paraformaldeide al 4% (p/v). Inoltre, utilizzando il che esprimono EGFP e. coli, i ricercatori non devono ulteriormente colorazione dopo fagocitosi, che consente di risparmiare tempo. Inoltre, i macrofagi sono immunoresponsive per e. coli , antigene di superficie, rendendo il e. coli più adatto per il test di fagocitosi di utilizzando i funghi che esprimono EGFP o branelli della fluorescina-etichettati.
Con che esprimono EGFP e. coli, un test di fagocitosi può essere facilmente compiuto in 2h e misurato da entrambi microscopia fluorescenza e citometria di flusso, a seconda della finalità del ricercatore. Poiché questo metodo misura direttamente la capacità fagocitica, i risultati sono più riproducibili rispetto ad altri metodi indiretti.
Questo metodo è stato convalidato anche in una linea cellulare RAW 264.7 e cellule mononucleari del sangue periferico umano4. Il testo riportato di seguito fornisce le istruzioni dettagliate per l'esecuzione di questo test e vengono evidenziati i passaggi critici che i ricercatori possono modificare per soddisfare le esigenze dei loro esperimenti.

<table><tbody><tr><td>BD FACSCantometro a flusso II</td><td>BD Biosciences-Biotina</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>anti-topo CD16/32 Anticorpo</td><td>Biolegend</td><td>Cat101303</td><td></td></tr><tr><td>Champion pET SUMO Sistema di espressione proteica</td><td>Invitrogen</td><td>K300-01</td><td></td></tr><tr><td>Servizio di sintesi genica personalizzato</td><td>Takara Biotech.</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>DAPI(4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dicloridrato)</td><td>ThermoFisher</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>F4/80-PE anticorpo di topo per FACS</td><td>Biolegend</td><td>Cat123110</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMI3000 B&nbsp; Microscopio invertito</td><td>Leica Microsystems-PE</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Rat IgG2a, controllo dell'isotipo</td><td>Biolegend</td><td>Cat400507</td><td></td></tr><tr><td>Falloidina 633 colorante a fluorescenza soluzione di lavoro coniugata</td><td>AAT Bioquest</td><td>Cat23125</td><td></td></tr><tr><td>Terreno tioglicolato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9032</td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzando enhanced fluorescenza verde che esprimono proteine escherichia coli per valutare la fagocitosi dei macrofagi peritoneali del mouse

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Questo manoscritto descrive un metodo semplice e riproducibile per eseguire un test di fagocitosi. La prima parte di questo metodo prevede la costruzione di un vettore di animali-SUMO-EGFP (SUMO = piccolo ubiquitina-come modificatore) e che esprimono una maggiore proteina di fluorescenza verde (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). Che esprimono EGFP e. coli è coincubated con i macrofagi per 1h a 37 ° C; il gruppo di controllo negativo viene incubato in ghiaccio per la stessa quantità di tempo. Quindi, i macrofagi sono pronti per la valutazione. I vantaggi di questa tecnica includono i passi semplici e diretti, e fagocitosi possono essere misurata con entrambi microscopio di fluorescenza e cytometer di flusso. Il che esprimono EGFP e. coli sono stabili e visualizzare un segnale di fluorescenza forte anche dopo i macrofagi sono fissati con paraformaldeide. Questo metodo non è solo adatto per la valutazione delle linee cellulari del macrofago o macrofagi primari in vitro ma adatto anche per la valutazione della fagocitosi di granulociti e monociti in cellule mononucleari del sangue periferico. I risultati mostrano che la capacità fagocitica dei macrofagi peritoneali dai giovani topi (otto-settimana-vecchio) è superiore a quella dei macrofagi dai topi invecchiati (16 mesi). In sintesi, questo metodo misura la fagocitosi del macrofago ed è adatto per studiare la funzione del sistema immunitario innato.

Il vettore di animali-SUMO utilizza un modificatore di ubiquitin-come piccolo per consentire l'espressione di proteine native in Escherichia coli. Fusione di SUMO può significativamente aumentare la solubilità EGFP, permettendo così di essere individuati facilmente. Se l'espressione di EGFP correttamente è indotta da lattosio, colonie verde possono essere osservate nel buio (Figura 1A). Puntini verdi, che rappresentano il che esprimono EGFP e. co...

Qui, presentiamo un protocollo per valutare la fagocitosi dei macrofagi peritoneali del mouse usando una maggiore fluorescenza verde Escherichia coliche esprimono proteine.

Utilizzando Enhanced fluorescenza verde che esprimono proteine Escherichia Coli per valutare la fagocitosi dei macrofagi peritoneali del Mouse

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Questo protocollo ha dimostrato un metodo semplice e producibile per valutare la capacità di fagocitosi dei macrofagi usando Escherichia coli che esprime EGFP. Ciao, mi chiamo Jun-Yu del Secondo Ospedale della Dalian Medical University. Oggi vi mostreremo un facile e visualizzeremo il modo di valutare la fagocitosi del macrofago che può essere facilmente eseguita entro due ore.Questo metodo è stato ampiamente utilizzato nello studio della funzione immunitaria innata. Si ritiene che la funzione immunitaria innata sia rimasta intatta negli anziani. Quindi oggi isoliamo i macrofagi peritoneali dai topi anziani e giovani e vediamo la capacità fagocitica di questi due gruppi.Beh, cominciamo. In primo luogo, sintetizzare il frammento genico EGFP e clonare il frammento usando dna polimerasi Taq ad alta fedeltà. Quindi ligare il prodotto PCR nel vettore sumo pET.In terzo luogo, trasformare i prodotti di legatura nel ceppo E.coli e indurre EGFP ad esprimere con lattosio. Questi E.coli che esprimevano L'EGFP servivano come marcatore per il saggio di fagocitosi. Successivamente, un peritoneo macrofagi del topo fu isolato e coltivato.Quindi, gli E.coli che esprimevano l'EGFP furono coincubati con i macrofagi per un'ora a 37 gradi centigrei. Dopo la fase di tempra, i macrofagi erano pronti per la valutazione sia dal microscopio a fluorescenza che dal citometro a flusso. Sintetizzare il frammento genico EGFP e amplificare il frammento con un primer avanti e indietro usando dna polimerasi Taq ad alta fedeltà.Per garantire che i prodotti PCR avessero singoli sporgenze adenine a tre estremità per la clonazione dell'AT nel passaggio successivo, si raccomanda un'estensione di 30 minuti a 72 gradi centigrei dopo l'ultimo ciclo. Controllare il prodotto PCR mediante elettroforesi in gel di agarosio. Se il frammento è stato amplificato correttamente, si può osservare una banda di 717 bp sul gel.Clonare il prodotto PCR nel vettore pET SUMO utilizzando il metodo di clonazione TA con T4 DNA ligasi. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 30 minuti. Aggiungere cinque microliter di prodotto PCR in 100 microliter di cellule competenti BL21.Scaldare le cellule a 42 gradi centigrei per 90 secondi, quindi mantenere la miscela sul ghiaccio per tre minuti. Aggiungere 400 microliter di mezzo LB, preriscaldato a 37 gradi centigrei. Tremante di un'ora a 37 gradi centigrei e 120 giri/min.Inoculare i batteri sulla superficie della piastra LB con 100 microgrammi per millilitro kanamicina per schermare l'E.coli trasformato da vettori. Incubare la piastra nel forno a 37 gradi centigrei durante la notte. Il giorno successivo, inoculare una colonia positiva in cinque millilitri di litra di liscivie con 100 microgrammi per millilitro kanamicina.Incubare nell'incubatrice di scuotimento a 37 gradi centigrees a 120 giri/min per due ore. Quindi aggiungere il lattosio induttore a una concentrazione finale di 0,5 millimoli per litro e continuare a tremare per sei ore, inducendo espressione EGFP. Empiricamente, quando si tremano sei ore, l'OD600 può raggiungere 0,7 o superiore.Infine, utilizzando il microscopio a fluorescenza per verificare l'estensione dell'espresso EGFP. Aggiungere 10 microliter del mezzo di coltura batterica a uno scivolo. Quindi coprire con un foglietto di copertura.Esaminare l'espressione di EGFP al microscopio a fluorescenza. Aggiungere 3,5 grammi di tioglicollato in 100 millilitri di acqua distillata. Sterilizzare in autoclave prima dell'uso.Aspirare il mezzo tioglicollato nella siringa sterile da un millilitro nel cappuccio. Un topo per siringa per evitare l'infezione. Iniettare un millilitro di mezzo tioglicollato al 3,5% nella cavità peritoneale del topo utilizzando un ago calibro 23 e mantenere il topo con acqua e ad libitum alimentare per tre giorni.Dopo tre giorni, eutanasiare il topo con la lussazione cervicale dopo aver introdotto rapidamente l'anestesia da sevoflurane in una scatola chiusa. Quindi, mettere il topo in un piatto con il 75% di etanolo per sterile e trasferire rapidamente nel cappuccio. Posizionare il mouse sulla piastra e fissare la zampa anteriore sulla tavola per fissare la posizione del mouse.Utilizzando una siringa da cinque millilitri con un ago calibro 20, iniettare cinque millilitri di PBS freddo all'addome inferiore nella cavità peritoneale del topo, evitando di forare l'intestino. Eseguire un massaggio delicato su due lati dell'addome del mouse. Quindi aspirare il fluido addominale delicatamente e lentamente.Erogare il fluido peritoneale in un tubo di centrifuga da 50 millilitri. Ripetere questi passaggi due o tre volte. Centrifugare le cellule sospese per 10 minuti a 400 g in quattro-otto centigradi.Scartare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare nel mezzo RPMI 1640 con siero bovino fetale al 10%. Aggiungere cinque milioni di cellule in ogni pozzo della piastra a sei pozzi per il saggio di citometria del flusso e 500.000 cellule per pozzo in una piastra da 24 porri per microscopio a fluorescenza. Coltura delle cellule a 37 gradi centigrees in un incubatore di anidride carbonica del 5% durante la notte.Il mezzo di coltura può essere aggiornato dopo tre ore per rimuovere le cellule non aerenti perché la maggior parte di questi erano linfociti. Osservare le cellule al microscopio a campo luminoso per valutare la vitalità cellulare e la densità cellulare. L'immagine mostrata qui era in condizioni normali della cella primaria.Di solito, la densità cellulare del macrofago non era alta, perché la maggior parte delle cellule peritoneali erano linfociti. Rimuovere il mezzo di coltura dal piatto da 24 pozzi. Aggiungere 100 microliter di mezzo di coltura fresco e 10 microliter di mezzo batterico.Quindi incubare la piastra a 37 gradi centigrees in un incubatore di anidride carbonica del 5% per un'ora. Lavare delicatamente con 500 microliter di PBS freddo per pozzo da tre a cinque volte per lavare i batteri non internalizzati. Incubare le cellule con il 4% di formaldeide in PBS a temperatura ambiente per 30 minuti.Lavare le cellule con PBS tre volte. Aggiungere la soluzione di lavoro coniugata phalloidin 633 per macchiare F-actin. Conservare in un luogo buio e umido a temperatura ambiente per 60 minuti.Aggiungere la soluzione di lavoro DAPI per macchiare la cellula nucleare e incubare per cinque minuti in un luogo buio a temperatura ambiente. Risciacquare una volta con PBS e una volta con lo stesso volume in acqua distillata. L'E.coli espresso dall'EGFP visualizzato in verde fungeva da marcatore della fagocitosi.Per ridurre al minimo gli errori sperimentali ed effettuare una corretta interpretazione dei risultati, impostare gruppi e tubi di controllo per l'esperimento elencati nella tabella 2. Per il gruppo di controllo che verrà posizionato sul ghiaccio, rimuovere il mezzo dalla piastra a sei pozzi e lavare con PBS una volta. Quindi aggiungere 70 millimoli per litro di EDTA fredda un millilitro nel pozzo per staccare le cellule e trasferirlo nel tubo di citometria a flusso.Aggiungere 50 microliter di sospensione batterica nel tubo e posizionarlo sul ghiaccio per un'ora. Per gli altri gruppi, rimuovere il mezzo di coltura, aggiungere un mezzo fresco millilitro in ogni pozzo. Aggiungere 50 microliter di sospensione batteriche nei pozzi in base all'impostazione del gruppo descritta nella tabella due.Quindi posizionare la piastra di sei pozzi nell'incubatore di anidride carbonica a 37 gradi centigrees del 5% per un'ora. Per spegnere la fluorescenza dell'E.coli non interiorizzato, aggiungere 200 microliter di soluzione di acqua cristallina allo 0,8% nel pozzo e ondeggiare a breve. Questo passaggio ha lo scopo di evitare risultati falsi positivi da parte dell'associazione EGFP E.coli alla superficie dei macrofagi ma non interiorizzati.Lavare le cellule con PBS tre volte per rimuovere eventuali viola cristallini residui. Quindi aggiungere 70 millimoli per litro di EDTA fredda un millilitro nel pozzo per staccare le cellule e trasferirlo nel tubo di citometria a flusso. Centrifugare i tubi 2.000 giri/min di cinque minuti e scartare il supernatante.Aggiungere 100 microliter di PBS per rimospendare le cellule. Aggiungere cinque microliter di anticorpo coniugato F4 ATP nei tubi o nell'isotipo in base all'impostazione del gruppo. Vortice brevemente e incubare i campioni sul ghiaccio per cinque-10 minuti al buio.Aggiungere un PBS millilitro in ogni tubo e centrifugare 2.000 giri/min di cinque minuti. Scartare il supernatante. Resuspend il pellet cellulare con 200-300 microliter di PBS per l'analisi della citometria a flusso.Eseguire ogni tubo e acquisire dati per almeno 10.000 eventi di celle positive F4/80. Ecco le immagini a fluorescenza dei macrofagi peritoneali dei gruppi giovani e anziani. La fluorescenza rossa rappresenta f-actina.Il verde rappresenta l'E.coli che esprime EGFP, e il blu rappresenta il nucleo macchiato da DAPI. Queste immagini suggeriscono che i macrofagi del giovane topo avessero una capacità fagocitica più forte di quelli del topo invecchiato. Le cellule positive F4/80 ed EGFP indicavano la capacità fagocitica dei macrofagi.Questi risultati sono coerenti con l'andamento dei risultati del microscopio a fluorescenza. Beh, vedete, anche se il numero delle cellule immunitarie innate può essere conservato nel topo invecchiato, la capacità fagocitica è diminuita significativamente rispetto al giovane topo. Molti metodi sono stati impiegati per valutare la fagocitosi macrofagia.Qui dimostriamo un metodo migliorato che è conveniente, rapido ed economicamente fattibile. Con E.coli che esprime EGFP, un saggio di fagocitosi può essere facilmente eseguito e misurato sia dal citometro a flusso che dal microscopio fluorescente secondo le preferite del ricercatore. Anche questo metodo misura direttamente la capacità fagocitica.I risultati sono più riproducibili di altri metodi indiretti.

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