Name: Flash nanoprecipitazione per lincapsulamento di composti idrofobi e idrofili in nanoparticelle polimeriche (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Scopri la tecnica di flash nanoprecipitazione per incapsulare composti idrofobi e idrofilici in nanoparticelle polimeriche. Questo metodo scalabile è ideale per sistemi di drug delivery e applicazioni terapeutiche.

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Quest'opera è stata sostenuta da finanziamenti da Optimeos Life Sciences, della National Science Foundation (CBET 1605816), il Bill e Melinda Gates Foundation (BMGF, OPP1150755) e la National Science Foundation Graduate Research Fellowship (DGE-1656466) assegnato a K.D.R.

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

L'incapsulamento di composti idrofobici, quale la vitamina E, come al punto 1 del protocollo, è stato ampiamente descritto9,14,28. Relativamente monodisperse particelle sono prodotte perché la scala di tempo di miscelazione è più breve rispetto alla scala di tempo per l'aggregazione e la crescita delle particelle. In particolare, la soluzione di solvente/antisolvente mista rapidamente diventa omogenea, che consente di nucleazione si verifichi in modo uniforme. Assembly del copolimero a blocchi alla superficie della particella quindi fornisce stabilizzazione sterica che ferma la crescita delle particelle5. Poiché il tempo di miscelazione in aula (turbolenza) è una funzione delle portate di aspirazione a CIJ o il MIVM, c'è un tasso di ingresso, che si verifica dopo la transizione a miscelazione turbolenta, dove la dimensione delle particelle è essenzialmente costante13. Questo fornisce ulteriore robustezza al processo come alcuni lotto a variazione di portata di aspirazione (cioè, siringa depressione velocità) può essere tollerata senza alcun impatto significativo per la dimensione finale di NP, come si vede dalla Figura 3. Velocità di aspirazione più lento o irregolare può causare le particelle più grandi o più polidispersi distribuzioni, come si è visto per esempio la mancata accensione. FNP è stata estesa anche per incapsulare idrofili composti in nanoparticelle di inverso nanoprecipitazione Flash. Questi invertito le nanoparticelle possono quindi essere utilizzati per creare microparticelle o rivestire con PEG per creare nanoparticelle dispersibile in acqua25. I principi di montaggio rimangono gli stessi, anche se c'è la complessità aggiunta di reticolazione il nucleo di particelle. Ciò è necessario per la stabilizzazione della particella in un ambiente acquoso. In generale, un rapporto di 1:1 carica rispetto al blocco Poliacido è sufficiente, anche se le interazioni ioniche possono essere promosso da regolazione del pH mediante l'aggiunta di una base19. In questo protocollo, è stato descritto solo il primo passo del processo di forma invertita NPs.
Oltre a miscelazione veloce, formulazione di successo di FNP o iFNP è circoscritta ai casi in cui diverse condizioni possono essere incontrato9,14. Primo, tutti flusso ingressi deve essere miscibile. Mentre emulsioni sono stati utilizzati per produrre NPs, FNP richiede una fase di soluzione uniforme nel mixer. In secondo luogo, il componente di nucleo deve essere quasi insolubile alle condizioni di solvente nel mixer (per la CIJ, una miscela 50/50 in volume) di guidare veloce nucleazione. In caso contrario, una parte significativa rimarrà unencapsulated o precipiterà dopo ulteriore diluizione con antisolvente. Il MIVM può abilitare antisolvente maggiore contenuto nella camera di miscelazione per limitazioni di solubilità del materiale di nucleo indirizzi. Spesso è utile generare le curve soprasaturazione dai dati di solubilità in funzione della composizione solvente per guidare la progettazione di processo9. Figura 6 Mostra le curve rappresentative per i due composti. Bassa soprasaturazione presso i meriti di condizioni camera miscelazione operanti a diverse composizioni, in genere utilizzando il MIVM. Superiore soprasaturazione privilegia la nucleazione del componente core rispetto alla crescita delle particelle ma una mancata corrispondenza in tempo di assemblaggio del materiale del nucleo e lo stabilizzatore può provocare grandi aggregati di terapeutico. D'Addio e Prud'homme hanno esaminato l'applicazione di tali curve di sovrasaturazione nel dettaglio9. Infine, il BCP deve essere sciolto molecolarmente nel flusso del solvente e il flusso di antisolvente deve essere selettivo per un isolato. Il BCP deve essere sufficientemente anfifilici per fornire sia una solvophobic forza dal blocco compresso per ancorare lo stabilizzatore sulla superficie della particella e per il blocco di solvatato conferire stabilità sterica della particella motrice. Solventi diversi da quelli descritti nel protocollo possono essere utilizzati fino a quando si incontrano questi vincoli.
Pratica con funzionamento manuale siringa può migliorare il tasso di successo durante la selezione. Come notato sopra, operazione sopra il passaggio a condizioni di miscelazione omogenee, turbolente significa che piccole variazioni di portata sono tollerate nel processo28. Scala-fino a risultati flussi pompa-driven, controllati dal computer in guadagni anche maggiore di coerenza a causa dei tassi di flusso di ingresso riproducibile. In qualsiasi momento durante la post-elaborazione delle particelle, ispezione visiva o analisi DLS possono indicare la presenza di grandi aggregati che può essere a causa di instabilità incidentali di polvere o particelle. Quando necessario, il flusso può essere filtrato con un diametro dei pori filtro appropriato. In assenza di aggregati, che abbiamo trovato meno di 5% della massa è in genere persi quando si filtrano le nanoparticelle rivestite con PEG se la dimensione del filtro nominale è maggiore la distribuzione granulometrica. Quando si filtrano gli aggregati, determinazione sperimentale della massa persa durante il processo è necessario. Quantificazione della perdita di massa può avvenire in due modi. La massa di solidi totali in un dato volume può essere determinata dall'analisi termogravimetrica prima e dopo filtrazione per identificare la portata del cambiamento (Vedi Informazioni supplementari sezione 2). In alternativa, le particelle possono essere recuperati (ad esempio, mediante liofilizzazione) e disciolto in un buon solvente. La concentrazione del materiale del nucleo può quindi essere misurata direttamente mediante una tecnica appropriata come spettrofotometria ultravioletto-visibile o cromatografia.
Per FNP, il residuo 10 vol % solvente organico (ad es., THF) deve essere rimosso dalla dispersione acquosa. Questo può essere fatto da distillazione evaporativo14,29, dialisi30o flusso tangenziale filtrazione31,32. Considerazioni pratiche per ogni fase di lavorazione sono descritti nelle citazioni fornite. Per dialisi, tipiche membrane sono kDa 3,5 o 6-8 kDa cut-off, anche se sono disponibili più opzioni. Questa frequenza di taglio del peso molecolare è sufficiente per la rimozione del solvente quando dializzato per 24 h utilizzando diverse modifiche di vasca. L'uso di filtrazione a flusso tangenziale comporta qualche sviluppo di processo come cura deve essere presa per evitare di indurre aggregazione a causa della polarizzazione di concentrazione sulla superficie di membrana. Abbiamo trovato che ridurre la composizione organica solvente sotto un valore dipendente dal sistema, di solito 2-10% in volume, Elimina l'aggregazione alla superficie della membrana. Dopo l'elaborazione, la concentrazione delle nanoparticelle è prontamente determinata da analisi termogravimetrica (Vedi Informazioni supplementari sezione 2). È spesso desiderabile per trasportare o conservare particelle in una forma altamente stabile. Dispersioni acquose possono semplicemente essere congelati rapidamente utilizzando una miscela di ghiaccio secco/acetone e quindi conservati a-80 ° C. In alternativa, polveri secche possono essere ottenute da liofilizzazione33,34 o spruzzare asciugatura24. Frequentemente, un crioprotettore deve essere aggiunto per ridurre l'aggregazione delle nanoparticelle durante il congelamento o essiccazione. Zuccheri (saccarosio, trealosio, ecc.), poly(ethylene glycol) o ciclodestrine possono essere schermate per efficacia sopra una gamma di concentrazioni di monitoraggio dimensione di DLS35,36,37, 38. Comuni problemi di stabilità di NP durante l'elaborazione sono spesso legate alla separazione di fase o solubilità nel nucleo con conseguente riorganizzazione verso uno stato di energia inferiore in condizioni dove la mobilità è aumentato. Uso di materiali co-nucleo, stabilizzatori alternativi o soluzione esterna modificata composizione può contribuire a migliorare la stabilità14,16,17,39,40, 41.
Come notato sopra, il MIVM consente maggiore antisolvente contenuto nella camera di miscelazione quando è necessario raggiungere alta soprasaturazione. Può anche permettere per la segregazione fisica di specie in due o più flussi quando vincoli reattività o solubilità lo richiedono. Un esempio è la formazione di nanoparticelle di proteina-stabilizzato zein del clofazimine antibiotico24. La clofazimina idrofobo è stato introdotto in un flusso di acetone; Zein è stato introdotto in un flusso acquoso etanolico 60%; caseina, quali complessi con zein, è portato dentro con un flusso di tampone acquoso, e il flusso di quarto è buffer aggiuntivo per aumentare il rapporto di acqua per acetone ed etanolo. Due flussi di solvente sono necessari in quanto clofazimine e zein non sono solubili in un solvente comune. Questo processo non potrebbe essere compiuto in un mixer CIJ due getti. Questa formulazione stabilizzata proteina dimostra inoltre che FNP non è limitato a stabilizzatori BCP. Particelle di Janus sono state prodotte senza stabilizzatore42 e una gamma di stabilizzatori di basso costo sono stati dimostrati per applicazioni orale24. In particolare, copolimeri ad esempio idrossipropilmetilcellulosa possono essere utilizzati al posto di blocco copolimeri24. Materiali di nucleo possono essere fatti più idrofobiche da un certo numero di tecniche. Ione idrofobo abbinamento è stato applicato per incapsulare una vasta gamma di composti che hanno solubilità intermedia43,44,45. Profarmaci estremamente idrofobe sono stati generati e quindi incapsulato46. Gli acidi nucleici sono stati incapsulati tramite complessazione con lipidi cationici47. D'importanza, questi studi hanno dimostrato che FNP può produrre una gamma di composizioni chimiche di superficie delle particelle. Sono stati utilizzati stabilizzatori più ulteriormente, misti contenente una frazione di BCP è stato modificato con un ligando targeting all'estremità della catena. Questo consente un controllo preciso contenuto di legante sulla superficie poiché la composizione delle particelle riflette il flusso di input composizione23,48. Allo stesso modo, è possibile incorporare più componenti principali, tra cui coloranti e nanoparticelle inorganiche3,8.
Nanoprecipitazione Flash è un approccio scalabile a nanoparticelle polimeriche comprende o un idrofobo o un core idrofilo. Se i criteri sopra elencati, generalmente oltre 95% del materiale del nucleo è incapsulato a alta frazione di massa della particella. I tre esempi qui presentati sono stati effettuati a bilancia da banco, che richiedono pochi milligrammi di materiale e di circa 0,5 mL in ogni flusso di aspirazione. Questo consente per screening rapido delle condizioni di particelle per l'ottimizzazione della formulazione. Scale-up di formulazioni di piombo per batch di dimensioni maggiori è una questione di esecuzione del processo più a lungo, che può essere compiuto facilmente attraverso l'uso di pompe a siringa o controllori di flusso. Al contrario, le scale-up di massa aggiunta nanoprecipitazione sfide ben documentato nel mantenimento sufficiente micromixing sul punto di aggiunta e contabilità per l'effetto di cambiare nave geometria49. Si tratta di un ostacolo, poiché è essenziale per la produzione di particelle in modo coerente per soddisfare FDA requisiti50. Tecniche di microfluidica possono anche produrre nanoparticelle uniforme, riproducibile, ma consentono solo la produzione nel range milligrammi. Ad esempio, Karnik et al ha segnalato tassi di produzione di 0,25 mg/min per un rilascio di farmaci studiano51. Ulteriore scalabilità implica, generalmente, parallelizzazione al capitale elevato costo12. Con FNP, è semplice per produrre 1 grammo di nanoparticelle a 600 mg/min con una pompa a siringa e alcune rifiniture per collegare agli ingressi mixer. Di conseguenza, FNP rappresenta sia uno strumento di screening accessibile su scala di laboratorio, nonché un approccio scalabile alla produzione di NP per lavoro traslazionale.

Dalla fine del 1990, c'è stato un aumento costante del numero di studi clinici che impiegano nanomateriali1,2. Il crescente interesse riflette la promessa dei nanomateriali per migliorare la biodisponibilità di farmaci idrofobici e consentire una destinazione preferenziale all'interno del corpo3. Nanoparticelle polimeriche (denominate nanoparticelle o NPs qui) rappresentano una quota crescente di questa classe di materiali2. NPs hanno raccolto interesse perché essi hanno proprietà altamente sintonizzabile come dimensione, composizione e funzionalizzazione superficiale4. Quando applicato per la somministrazione di farmaci poco solubili, NPs hanno frequentemente una struttura core-shell dove il terapeutico è incapsulato nel nucleo idrofobo e il guscio è costituito da un pennello di polimeri idrofili. Un modo semplice per generare questa struttura impiega un anfifilici diblock Copolimero (BCP) costituito da un blocco idrofobico degradabile, che fa parte del nucleo delle particelle, e bloccare un poly(ethylene glycol) idrofile (PEG), che costituisce il pennello di polimero e comunica la stabilizzazione sterica4,5.
Nanoprecipitazione è una comune tecnica di montaggio per nanoparticelle polimeriche perché è semplice e non energia intensivo6. Nella sua forma più semplice, nanoprecipitazione comporta aggiunta mediante pipetta di componenti NP in un solvente organico come acetone a un volume in eccesso di acqua agitata. Il cambiamento in solvente e una soluzione acquosa diluita provoca la precipitazione della componente core insolubile. Lo stabilizzatore assembla su questa superficie di particella crescente, regia di adsorbimento del blocco idrofobico compresso7,8,9,10. Una distribuzione uniforme delle particelle si ottiene quando il solvente e acqua mescolare velocemente per formare una soluzione omogenea. Miscelazione che è più lenta rispetto la nucleazione e assemblaggio dei risultati componenti in una più grande, più polidispersi particella abitanti. Anche se facilmente accessibile per un semplice test, l'approccio di batch agitata si traduce in ampia variabilità a causa di un'incoerenza di miscelazione e non è suscettibile di scalabilità6,11. Microfluidica è emersi come un altro viale di produzione NP che possa essere eseguiti continuamente. Questo mezzo di produzione è stato recentemente rivisto da Ding et al. 11 . Un approccio comune utilizza flusso laminare, messa a fuoco per ridurre la scala di lunghezza solvente a valori inferiori al micron. Miscelazione dell'antisolvente si verifica per diffusione, così piccolo flusso dimensioni sono cruciali per garantire particelle uniformi11,12. Parallelizzazione di multiple microfluidici alloggiamenti per scale-up è problematico per grossi volumi di produzione.
Le condizioni di miscelazione rapide che favoriscono la nanoprecipitazione uniforme in microfluidica, alternativamente, possono essere prodotto in ristretti, flussi turbolenti. Flash nanoprecipitazione (FNP) impiega speciali geometrie di miscelazione per ottenere queste condizioni sotto la portata volumetrica maggiore rispetto a possibili con microfluidica. Flussi di ingresso immettere una camera di miscelazione in condizioni turbolente che portano alla generazione dei vortici, in modo che il solvente/anti-solvent lamelle formano la scala di lunghezza di diffusione11,13. Così, si ottiene la miscelazione uniforme su una scala di tempo più breve di nucleazione e crescita di terapeutico. La geometria ristretto del mixer non consentono flusso bypassando della regione dove si verifica la dispersione di energia turbolenta e l'intero sistema sperimenta la stessa storia di processo13. Nucleazione si verifica in modo uniforme nella camera di miscelazione e crescita delle particelle procede fino al fermato dall'Assemblea del BCP sulla superficie9,14. Il flusso misto contenente particelle stabili quindi può essere diluito con ulteriori antisolvente per sopprimere Ostwald maturazione delle particelle15,16,17.
Un miscelatore del getto (CIJ) incidente confinati è il più semplice mixer design per FNP e consente la miscelazione dei due flussi in modo scalabile e continuo, come indicato in Figura 1A13. Un multi-ingresso Vortex (MIVM) è stato sviluppato per attivare fino a quattro ingressi di flusso diverso mentre ancora realizzando la rapida micromixing necessaria per la formazione di particelle uniformi, come mostrato nella Figura 1B18. FNP consente lo screening di formulazione semplice che può essere facilmente tradotto alla produzione su scala commerciale. Grazie alla natura continua del processo, batch di dimensioni maggiori non richiedono nuove navi ma piuttosto più tempi di esecuzione, traduzione semplice abilitazione alla produzione di chilogrammo-scala nello stesso treno attrezzature.
Idrofili composti quali peptidi e proteine ('biologici') possono anche essere incapsulati in una processo chiamato inversa Flash nanoprecipitazione (iFNP). La tecnica richiede un anfifilici BCP dove un isolato è idrofobo e l'altro è un Poliacido19. Il passo iniziale prevede la miscelazione rapida di un flusso di dimetil solfossido (DMSO) contenente il biologico e il BCP contro un solvente lipofilico come diclorometano o cloroformio. Questo provoca la formazione di particelle stabilizzato con il pennello di blocco idrofobico. Qui, una tale architettura, sono definita un NP 'invertita'. Il nucleo contiene Poliacido, che è poi ionicamente reticolati utilizzando un cationi polivalente. Questo stabilizza le particelle per la trasformazione in un ambiente acquoso sotto forma di microparticelle o nanoparticelle rivestite con PEG di tecniche che sono state segnalate nella letteratura19,20,21.
Questo protocollo può essere impiegato per la produzione su scala di laboratorio di nanoparticelle core-shell polimeriche incapsulando composti idrofiliche o idrofobiche. Le sottosezioni del protocollo forniscono istruzioni sull'uso di entrambe le classi miscelatore - CIJ e il MIVM. Il lettore dovrebbe essere in grado di adattare il protocollo per i componenti principali del romanzo e riproducibile generare nanoparticelle di una dimensione desiderata utilizzando il mixer appropriato per gli ingressi di flusso. Tre formulazioni di esempio utilizzando FNP e iFNP sono presentate di seguito. Due impiegano il mixer CIJ e uno richiede il MIVM15,22. La prima formulazione dimostra incapsulamento di un modello idrofobi composto da FNP. La seconda formulazione dimostra incapsulamento di un modello idrofila composto da iFNP in un mixer CIJ. La formulazione finale viene fornito un esempio di incapsulamento di proteina di iFNP utilizzando un MIVM. Il protocollo per questa terza formulazione descrive l'uso di una piccola scala, palmare MIVM chiamato 'μMIVM'. Il mixer design è più piccolo per consentire per lo screening di formulazione semplificata, ma il comportamento di ridimensionamento è ben compreso e il mixer non è un dispositivo di microfluidica22. La sezione finale del protocollo include alcune note su scale-up di formulazioni di piombo identificati nello screening. Queste formulazioni sono destinate a fornire punti di accesso per il processo di apprendimento e di conseguenza utilizzare non degradabili poli (stirolo)-basato su polimeri. Stabilizzatori alternativi sono stati descritti nella letteratura, con un numero di opzioni commerciali biocompatibile disponibili14,23,24.

<table><tbody><tr><td>Miscelatore a getti a impatto confinato</td><td>NA</td><td>NA Vedere</td><td>le informazioni supplementari per i disegni tecnici. Testo di revisione per la convalida del nuovo miscelatore</td></tr><tr><td>Raccordo Luer</td><td>Idex Health & Science</td><td>P-604</td><td>Assemblare sull'ingresso del miscelatore CIJ o MIVM con filettature corrispondenti</td></tr><tr><td>Raccordo a spina</td><td>Idex Health & Science</td><td>P-309</td><td>Montaggio sui lati del miscelatore CIJ (punto di accesso alla guarnizione dalla perforazione)</td></tr> <tr><td>Raccordo di uscita - CIJ</td><td>Idex Health & Science</td><td>P-205</td><td>Assemblare con ghiera e tubo sull'uscita della camera CIJ</td></tr><tr><td>Ghiera di uscita - CIJ</td><td>Idex Health & Science</td><td>P-200</td><td>Assemblare con raccordo di uscita (estremità larga a filo con tubo)</td></tr><tr><td>Tubo di uscita - CIJ</td><td>Idex Health & Scienza</td><td>1517</td><td>Utilizzare un tagliatubi per pulire le estremità. Assicurarsi che il tubo aggiuntivo non penetri nella camera di miscelazione</td></tr><tr><td>Tetraidrofurano (THF)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T425-4</td><td>Utilizzare THF privo di stabilizzanti per evitare i limiti di solubilità del BHT. I perossidi possono interferire in alcune applicazioni.</td></tr><tr><td>Siringa Norm-ject (3 ml)</td><td>VWR</td><td>53548-017</td><td></td></tr><tr><td>Vitamina E (&alfa;-tocoferolo)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>90669-50G-F</td><td>Conservare a freddo</td></tr><tr><td>poli(stirene-b-glicole etilenico), PS1.6k-b-PEG5k</td><td>Polimero Fonte</td><td>P13141-SEO</td><td>Altre dimensioni dei blocchi accettabili a seconda dell'applicazione</td></tr><tr><td>poli(stirene)1.8k</td><td>Fonte polimerica</td><td>P2275-S</td><td>Esempio di materiale del nucleo idrofobico</td></tr><tr><td>Fiala di scintillazione</td><td>DWK Lifesciences</td><td>74504-20</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe di plastica Luer-slip, 1 ml (confezione da 100)</td><td>National</td><td>S7510-1</td><td></td></tr><tr><td>Maltodestrina DE 4-7</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>419672-100G</td><td></td></tr><tr><td>acido poli(stirene-b-acrilico), PS5k-b-PAA4.8k</td><td>Fonte di polimero</td><td>P5917-SAA</td><td>Altre dimensioni dei blocchi accettabili a seconda dell'applicazione</td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D159-4</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrotrato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223506-25G</td><td>Igroscopico.</td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di ammonio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC423300250</td><td></td></tr><tr><td>Albumina da albume d'uovo di gallina (Ovoalbumina, OVA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5503-1G</td><td></td></tr><tr><td>Multi-Inlet Vortex Mixer</td><td>NA</td><td>NA Vedere</td><td>le informazioni supplementari per i disegni tecnici. Testo di revisione per la convalida del nuovo miscelatore</td></tr><tr><td>Raccordo di uscita - MIVM</td><td>Idex Health & Science</td><td>P-942</td><td>Combinazione con ghiera</td></tr><tr><td>Tubo di uscita - MIVM</td><td>NA</td><td>NA</td><td>Fit to ghiera ID.</td></tr><tr><td>O-ring (MIVM)</td><td>C.E. Conover</td><td>MM1.5 35.50 V75</td><td>Ordinare la parte di consumo sfusa. Garantire la compatibilità con i solventi se si utilizza una fonte alternativa.</td></tr><tr><td>Supporto per mixer</td><td>NA</td><td>NA Vedi</td><td>Markwalter & Prud'homme for design.17</td></tr></tbody></table>

flash nanoprecipitazione per l'incapsulamento di composti idrofobi e idrofili in nanoparticelle polimeriche

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

La formulazione di un composto terapeutico in nanoparticelle (NPs) in grado di conferire proprietà uniche. Per farmaci scarsamente solubili in acqua, NP formulazioni possono migliorare la biodisponibilità e modificare la distribuzione del farmaco all'interno del corpo. Per farmaci idrofili come peptidi o proteine, incapsulamento all'interno dei criteri di rete può anche fornire protezione da meccanismi di clearance naturale. Ci sono alcune tecniche per la produzione di NPs polimerici che sono scalabili. Flash nanoprecipitazione (FNP) è un processo che utilizza ingegnerizzato miscelazione geometrie per produrre NPs con distribuzioni di dimensione stretta e sintonizzabile dimensioni comprese tra 30 e 400 nm. Questo protocollo fornisce istruzioni sulla produzione di nanoparticelle polimeriche core-shell di una dimensione di destinazione utilizzando FNP su scala di laboratorio. Il protocollo può essere implementato per incapsulare sia idrofiliche o idrofobiche composti con solo lievi modifiche. La tecnica può essere facilmente impiegata in laboratorio a scala di milligrammo per formulazioni di schermo. Piombo hits possono direttamente essere scalato per grammo e chilogrammo scala. Come un processo continuo, scalabilità coinvolge più miscelazione processo eseguita tempo anziché traduzione alle navi nuove di processo. NPs prodotto da FNP è altamente caricati con terapeutico, sono dotate di una fitta boscaglia di polimero stabilizzante e hanno una riproducibilità di misura di ± 6%.

Screening delle formulazioni di NP con FNP è rapido e richiede piccole quantità di materiale (nell'ordine di 1-10 mg). Il protocollo FNP per incapsulare composti idrofobici, quale la vitamina E (passaggio 1) provoca una dispersione di NP stabile, limpida o leggermente opalescente. Diffusione dinamica della luce (DLS) fornisce un mezzo robusto per caratterizzare la dimensione delle particelle. Come mostrato nella Figura 3, il processo produce NPs con un basso polidispersità in modo riproducibile. L'indice di polidispersione tipico (PDI) è inferiore a 0,20, che indica un relativamente monodisperse popolazione. Il PDI viene ottenuto dalla funzione di autocorrelazione ed è spesso implementato in software dello strumento. È un rapporto del secondo al primo istante, dove i valori di 0.1 sono generalmente ottenuti di particelle monodisperse26. Per le quattro vitamina E/p-b-PEG formulazione replicati segnalati, il valore era 0.12 ± 0.02 e il diametro medio era 107 ± 7 nm. Un tipico "cilecca" a causa di una depressione irregolare delle siringhe o più lenta velocità di depressione è anche segnalato nella Figura 3. La polidispersità era inalterata, ma la dimensione era leggermente più grande (135 nm). Inclusi in questo esempio, le nuove metriche per dimensione delle particelle sono 113 ± 14 nm. Un tiro mancato si traduce in periodi di tempo dove la camera contiene un solo tipo di flusso singolo. È importante che l'intero flusso sperimenta la stessa storia di processo e volumi relativi dei flussi organici e acquosi all'interno del mixer. Senza uno stabilizzatore, viene prodotta una soluzione opaca con aggregati visibili. La funzione di autocorrelazione DLS per questo esempio è non monotone e non decade senza intoppi, come si vede nella Figura 3 rientranza.
Controllo delle dimensioni delle particelle di FNP è dimostrato nella Figura 4, dove variando la quantità relativa del materiale di nucleo – poly(styrene)1,8 k in questo caso – e PS -b-PEG stabilizzatore è provocato da dimensioni di particelle che hanno variato da 49-152 nm. Queste dimensioni delle particelle sono state generate con flussi THF contenente una concentrazione di massa totale del nucleo e stabilizzatore di 20 mg/mL, dove il 25%, 50% o 75% della massa è stato il materiale del centro di poly(styrene). La polidispersità delle nanoparticelle era sempre meno di 0.15. Ampia discussione degli effetti di parametro sulla dimensione delle particelle prodotte da FNP può essere trovata nella letteratura10. Il caricamento può essere ottimizzato tenendo costante il volume di solvente e variando i relativi volumi delle soluzioni stock core e stabilizzatore. Allo stesso modo, la concentrazione di massa totale può essere variata attraverso la preparazione di soluzioni di riserva a valori diversi da 10 mg/mL. In determinate condizioni, è possibile osservare una popolazione micella vuota da DLS27. Questo non ha alcun effetto dannoso diverso da quello di ampliare la distribuzione granulometrica misurato. Quando le dimensioni sono simili, questo può manifestarsi come un vasto picco singolo piuttosto che due picchi separati.
Il mixer CIJ stesso utilizzabile anche per incapsulare idrofili composti di iFNP, come esemplificato nel passaggio 2 del protocollo. Le particelle prodotte nella formulazione segnalata sono circa 65 nm con un basso polidispersità 0,08. La distribuzione delle dimensioni può essere visto in Figura 5A (linee tratteggiate). L'effetto di reticolazione i residui di acido carbossilico PAA sulla stabilità delle particelle è dimostrata dall'analisi DLS in un solvente forte come il DMSO, come mostrato in figura 5B. La funzione di autocorrelazione per pozzo-reticolato particelle dovrebbe iniziare nei pressi di un valore di 1 e goccia acutamente a 0 in un momento caratteristico che è correlato alla dimensione delle particelle (linea continua). Particelle che si gonfiano estesamente o sciogliere non sono reticolate e mostrano il segnale minimo autocorrelazione (linea tratteggiata). Per iFNP, non riuscite prove si manifestano in modi simili come descritto per FNP sopra. Aggregati visibili possono essere visto o forma di funzione di autocorrelazione DLS scadente può essere osservato. Il MIVM può essere utilizzato per FNP o iFNP quando più di due flussi di ingresso sono necessari a causa di vincoli di sistema quali solubilità o incompatibilità chimica. Una versione su piccola scala di MIVM (il μMIVM) con il suo stand mixer è illustrata nella Figura 2. Come con la CIJ, questo mixer può essere utilizzato per incapsulare composti idrofobo o idrofilo22. Nel passaggio 3, è stato descritto un protocollo per l'incapsulamento di una proteina idrofila, OVA, da iFNP. La distribuzione granulometrica è mostrata in Figura 5A (linea continua). La dimensione è di circa 125 nm con un PDI di 0,16. Un protocollo generale per funzionamento con pompa siringa alle scale più grandi è fornito nel passaggio 4.
<img alt="Il diagramma di miscelazione solvente-antisolvente, l'impostazione di tempra, produce l'illustrazione delle nanoparticelle." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: montaggio miscelatore e flusso interno modello schemi. Miscelatore di getti (CIJ) (A) i confinati che interferisce con siringhe allegate è posizionato sopra il bagno di tempra. Nella foto non sono un ancoretta nel flaconcino di vasca di tempra e un piatto di mescolare. La geometria di miscelazione è raffigurata nella vista espansa mostrando le insenature di due stream che incidono nel centro della camera. (B) un vortice di multi-ingresso mixer (il μMIVM) è mostrato con siringhe in vetro e posizionato nello stand sopra una vasca di tempra. La piastra mobile e gli arresti meccanici sono stati tagliati dalla foto. La vista espansa mostra schematicamente la camera di vortice e i canali di ingresso. (C), A rappresentazione schematica di NPs di core-shell prodotto da FNP. Sfere rosse rappresentano la terapeutica che, combinato con il blocco di polimero compresso blu, costituiscono il nucleo di NP. Il blocco di polimero giallo costituisce lo strato di pennello impartendo stabilizzazione sterica per NPs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Diagramma di configurazione del reometro con componenti etichettati per la miscelazione della geometria nei test sui materiali." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: μMIVM terminologia e componenti per l'assemblaggio. Il μMIVM richiede uno stand mixer per abilitare uniforme depressione delle quattro siringhe. In questo caso, le altezze di stantuffo della siringa devono essere uniformi per garantire la miscelazione coerente. In alternativa può essere gestito utilizzando pompe a siringa. Lo stand mixer con componenti con etichettate è mostrato a sinistra della figura. Sulla destra è il mixer smontato con l'o-ring al posto del disco di geometria miscelazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Grafico dell'intensità normalizzata rispetto al diametro NP; riquadro tempo di correlazione; risultati dell'analisi delle particelle." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: Particella dimensioni distribuzione delle nanoparticelle polimeriche contenenti un nucleo di vitamina E e stabilizzato da PS -b-PEG. Diffusione dinamica della luce (DLS) fornisce distribuzioni di dimensione ponderati per intensità che indicano la distribuzione del diametro di NP. Le curve sono la media delle analisi triplice copia per ogni prova e hanno state riscalate per produrre altezze dei picchi massimi identici. La replica di quattro (linee continue) indica l'alta riproducibilità del metodo (deviazione standard = 7 nm). È incluso anche un rappresentante misfire (linea tratteggiata), ad esempio velocità di siringa più lenta o irregolare depressione delle due siringhe, che si traduce in un più grande diametro della particella. La deviazione standard delle dimensioni NP tra cui la mancata accensione era 14 nm. (Inserto) Senza il PS -b-PEG stabilizzatore, si formano grandi aggregati di micron-scala (o goccioline, nel caso di un olio come vitamina E). La funzione di autocorrelazione di liste di distribuzione di una corsa senza lo stabilizzatore (linea tratteggiata) è mostrata insieme con un rappresentante autocorrelazione da una replica di nanoparticelle (linea continua). La funzione di autocorrelazione indica un numero di tempi caratteristici per il campione di controllo, che indica una popolazione polidispersi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Distribuzione granulometrica delle nanoparticelle; grafico; intensità normalizzata rispetto al diametro NP per le percentuali del nucleo." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: controllo di dimensione delle particelle di FNP attraverso variando i rapporti relativi del nucleo materiale per stabilizzatore. Le distribuzioni di dimensioni ponderati per intensità di tre formulazioni con un nucleo di poly(styrene) stabilizzato di PS -b-PEG sono raffigurati. La concentrazione di massa totale in THF è stata di 20 mg/mL e l'antisolvente era acqua. Le formulazioni sono state preparate in un mixer CIJ. La frazione della massa composta del materiale del nucleo è elencata nella legenda. Ad esempio, il campione di 25% nucleo contenuto 5 mg/mL poly(styrene) e 15 mg/mL PS -b-PEG. Le dimensioni medie per il 25% (linea continua), 50% (linea tratteggiata) e carichi di nucleo del 75% (misto dash linea) erano 49 nm, 96 nm e 152 nm, rispettivamente. Tutti i PDI valori erano meno di 0.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="analisi del diametro NP; grafico (A), studio temporale di correlazione; grafico (B), diffusione dinamica della luce." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: caratterizzazione di NPs invertito in un miscelatore CIJ o μMIVM. (A), DLS curve è la media delle analisi triplice copia per ogni formulazione. La linea tratteggiata indica la distribuzione di dimensione delle particelle di MD k 3 fatto nel mixer CIJ, mentre la linea continua è la granulometria delle particelle OVA fatte nella μMIVM. (B) la forza di reticolazione può essere valutata da DLS facendo uso di DMSO come il diluente. La funzione di autocorrelazione DLS indica la forza di reticolazione attraverso il valore iniziale di autocorrelazione e l'osservazione di una transizione pulita su un valore pari a zero. La linea tratteggiata rappresenta la funzione di autocorrelazione per una particella con nessun crosslinker mostrando un debole segnale iniziale e un tempo di decadimento ampia. La linea continua rappresenta l'autocorrelazione dopo l'aggiunta di un reticolante forte (in questo caso, tetraetilenpentammina), che mostra un forte segnale iniziale e una scala cronologica definita decadimento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Grafico della sovrasaturazione rispetto al solvente organico; peptide B, analisi della solubilità dei boscalidi, dati scientifici." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58757/58757fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figura 6: soprasaturazione, S, in funzione dei relativi rapporti di miscelazione di solvente organico all'acqua. (A) confronto di sovrasaturazione massima raggiungibile per (○) boscalid, un pesticida e (■) peptide B, un peptide di sette-residuo modello. Il flusso organico contiene boscalid ad una concentrazione di 230 mg/mL e peptide B a 200 mg/mL, le loro concentrazioni di saturazione. C'è una sovrasaturazione massima che dipende da ogni ingrediente farmaceutico attivo (API) / solvente sistema. (B) quando la concentrazione di boscalid nel flusso organico è diminuito di 20 volte, le condizioni in cui vengono raggiunti soprasaturazione e nanoprecipitazione diventano limitate. Questa figura è ristampata con il permesso da Elsevier9. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58757/58757fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Flash nanoprecipitazione (FNP) è un approccio scalabile per produrre nanoparticelle core-shell polimeriche. Formulazioni su scala di laboratorio per l'incapsulamento di terapeutica idrofila o idrofoba sono descritti.

Flash nanoprecipitazione per l'incapsulamento di composti idrofobi e idrofili in nanoparticelle polimeriche

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

La nanoprecipitazione flash, o tecniche FNP qui dimostrate offrono una piattaforma scalabile e diretta per incapsulare composti idrofobici o idrofili all'interno di nanoparticelle polimeriche. Per chiarezza, la tecnica utilizzata per incapsulare i biologici è chiamata nanoprecipitazione flash inversa, o IFNP. I principi sottostanti sono invariati, ma la struttura della nanoparticella risultante è diversa.Generalmente, i nuovi utenti hanno bisogno di pratica per azionare in modo coerente le siringhe di ingresso quando fanno manualmente piccoli lotti di nanoparticelle. Volumi maggiori possono essere prodotti con pompe per siringhe controllate dal computer. Il nostro protocollo fornisce anche dettagli sulla post-elaborazione delle soluzioni di nanoparticelle, che è spesso fondamentale per un'applicazione riuscita di una formulazione.Prima di iniziare il processo, controllare i raccordi del miscelatore CIJ e assicurarsi che il tubo di uscita non sia crimpato. Quindi, riempire due siringhe Luer senza gomma in polipropilene da cinque millilitri con due o tre millilitri di acetone o un altro solvente detergente. Bloccare le siringhe negli adattatori di ingresso e impostare l'assemblaggio su un contenitore di rifiuti.Premere costantemente i pistoni per inviare il solvente attraverso la camera di miscelazione nel corso di pochi secondi. Quindi, rimuovere le siringhe e asciugare la miscela con un flusso di gas azoto. Successivamente, per iniziare a preparare il flusso di ingresso del solvente, pipettare 0,25 millilitri di una soluzione di vitamina E da 10 milligrammi per millilitro, in tetraidrofurano privo di stabilizzatori, in un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri.Quindi, pipetta 0,25 millilitri di una soluzione di 10 milligrammi per millilitro di uno stabilizzatore di copolimero a blocchi in THF nello stesso tubo. Vortice la miscela per cinque-10 secondi, quindi centrifugarla a mille G per cinque-10 secondi per recuperare il liquido che aderisce al tappo. Preparare un tubo di centrifuga da 1,5 millilitri contenente 0,525 millilitri di acqua deionizzata come anti solvente.Quindi, pipettare quattro millilitri di acqua deionizzata in una fiala a scintillazione da 20 millilitri per fare il bagno di tempra. Posizionare una piccola barra di agitazione nel flaconcino. Posizionare il miscelatore CIJ pulito sopra il bagno di tempra in un rack o in un blocco di provetta su una piastra di agitazione.Iniziare a mescolare il bagno di tempra a circa il 75% della velocità massima possibile. Quindi, montare un ago con punta smussata su una siringa senza gomma di polipropilene millilitro e redigere l'anti-solvente. Espellere con cura le bolle d'aria dalla siringa, quindi rimuovere e smaltire l'ago.Regolare lo stantuffo in modo che il liquido venga appena alla fine della siringa. Quindi, attaccare la siringa a una delle entrate CIJ. Disegnare la miscela di solvente in una seconda siringa nello stesso modo e attaccarla all'altra insenatura.Per formare le nanoparticelle, deprimere simultaneamente entrambi i pistoni con un movimento uniforme liscio in meno di 0,5 secondi. È fondamentale deprimere le siringhe rapidamente, uniformemente e senza intoppi. Non dovresti colpire improvvisamente le siringhe, ma dovresti iniziare il movimento già a contatto con la parte superiore delle siringhe.Successivamente, impostare il miscelatore CIJ sul contenitore dei rifiuti, senza rimuovere le siringhe per garantire che il volume di attesa non si scarichi nella dispersione. Rimuovere la barra di agitazione dal flaconcino a scintillazione e capovoltarla. Quindi, rimuovere e scartare il solvente e le siringhe anti-solvente.Pulire il mixer prima della successiva prova di nanoprecipitazione flash. Per preparare un campione per l'analisi dinamica dello scattering della luce, pipettare 100 microlitri della dispersione in una cuvetta. Aggiungere 900 microlitri di solvente da bagno di tempra e mescolare bene tubazione prima di iniziare l'analisi del campione.Per iniziare a assemblare la micro MIVM, posizionare l'O-ring nel disco della geometria di miscelazione. Allineare i fori nel disco di miscelazione con i pioli sul disco superiore e adattarli insieme, facendo attenzione a non spostare l'O-ring. Allentare il raccordo del tubo di uscita nel ricevitore inferiore, quindi avvitare i dischi collegati nel ricevitore.Adattare una chiave inglese ai pioli del disco superiore e stringere l'assieme. Stringere il raccordo del tubo di uscita in modo che si sieda saldamente contro la faccia inferiore del disco della geometria di miscelazione. Assicurarsi che i raccordi della siringa sul disco superiore siano aderenti.Sollevare la piastra mobile sul supporto del miscelatore per tenerla fuori mano, quindi posizionare il miscelatore assemblato sul supporto, con il tubo di uscita filettato attraverso la piastra di supporto. Quindi, posizionare un tubo di centrifuga da 15 millilitri contenente 5,25 millilitri di cloroformio come bagno di tempra sotto i tubi di uscita. Quindi, disegnare 0,75 millilitri della soluzione A, che è una soluzione di cinque milligrammi per millilitro di ovoalbumina in solfossido di dimetile in 10% di acqua in volume, in una siringa di blocco Luer a tenuta di gas da un millilitro con un ago con punta smussata.Espellere con cura le bolle d'aria, rimuovere l'ago e innescare la soluzione fino alla fine del raccordo Luer. Collegare la siringa a un'ingresso mixer. Ripetere questo processo con 0,75 millilitri ciascuno della soluzione B, che è di sei milligrammi per millilitro di stabilizzatore di copolimero a blocchi in DMSO, e la soluzione C, che è THF.Collegare le siringhe alle entrate del miscelatore in senso orario, in ordine alfabetico. Preparare una siringa a tenuta di gas da 2,5 millilitri contenente 1,85 millilitri di soluzione D, che è cloroformio, e collegarla alla quarta insenatura. Verificare che non vi sia alcuna differenza significativa nell'altezza della siringa.Quindi, afferrare attentamente l'alloggiamento del cuscinetto su ciascun lato della piastra mobile e abbassare lentamente la piastra fino a quando non è a malapena appoggiata uniformemente sopra le siringhe. Per generare le nanoparticelle, deprimere costantemente e senza intoppi la piastra in circa 0,5 a un secondo. Quindi, rimuovere e cappuccio il tubo del bagno di tempra.Smontare e pulire il miscelatore al termine. Per lavorare con volumi maggiori, caricare le soluzioni in siringhe a tenuta di gas e collegare i tubi in politetrafluoroetilene con i raccordi Luer alle siringhe. Innescare le soluzioni fino alle estremità del tubo.Fissare le siringhe in pompe per siringhe e fissare il tubo alle entrate del miscelatore appropriate. Posizionare una piccola fiala di scarto sotto i tubi di uscita per raccogliere il volume di avvio. Preparare il bagno di tempra e tenerlo nelle vicinanze.Contemporaneamente, avviare le pompe e lasciare che circa cinque millilitri di effluenti fluiranno nel flaconcino di scarto. Quindi, inizia a raccogliere le nanoparticelle nel bagno di tempra come al solito. Una piastra di agitazione può essere utilizzata per mescolare il bagno di tempra, se lo si desidera.Quattro repliche di FNP di nanoparticelle polimeriche con un nucleo idrofobico, preparate nel miscelatore CIJ, mostravano un'elevata replicabilità, ed erano relativamente monodisperse, con un diametro medio di 107 nanometri. Un errore rappresentativo a causa della depressione lenta o irregolare della siringa, ha prodotto particelle leggermente più grandi, mentre la polidispersità non è stata influenzata in questo esempio, gli errori possono causare più distribuzioni di polidispersi. La funzione di autocorrelazione DLS decadeva senza intoppi per un campione rappresentativo di nanoparticelle polimeriche.Questo decadimento liscio non è stato osservato quando la formulazione è stata tentata senza lo stabilizzatore del copolimero a blocchi, che produceva invece goccioline di olio su scala micron. La quantità relativa di materiale del nucleo da stabilizzare controllava la dimensione delle particelle, come mostrato qui, in nanoparticelle con un nucleo di polistirolo. Il PDI era inferiore a 0,15 in ogni formulazione.Nanoparticelle con nuclei idrofili dove prodotte dall'IFNP. Le particelle con un nucleo di maltodestrina, preparate nel miscelatore CIJ, avevano un diametro di circa 65 nanometri e avevano un PDI di 0,08. Le particelle con un nucleo di ovoalbumina preparato nella micro MIVM avevano un diametro di circa 125 nanometri e avevano un PDI di 0,16.FNP e IFNP sono potenti strumenti per l'elaborazione delle molecole e delle nanoparticelle. Prima di eseguire entrambe le operazioni, assicurarsi di considerare le solubilità di ciascun componente in tutti i solventi, o miscele di solventi, per garantire un'elevata super saturazione durante la miscelazione. La tecnica di base è semplice, ma padroneggiare i passaggi di depressione della siringa richiede un po 'di pratica.In caso di problemi, prendere in considerazione l'utilizzo di una configurazione della pompa per siringhe come quella mostrata in questo video per migliorare la coerenza. Per molecole idrofile cariche, o molecole con solubilità intermedia, fnp può essere combinato con l'accoppiamento ionico idrofobico per consentire un'incapsulamento efficiente. L'FNP può anche essere usato per incapsulare più composti nello stesso nucleo di nanoparticelle.Consultare il testo e altre risorse della letteratura per imparare a rimuovere al meglio i solventi organici dalle dispersioni delle nanoparticelle nell'applicazione desiderata. Ci sono anche una serie di tecniche per stabilizzare le nanoparticelle durante lo stoccaggio.

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