Name: Rilevazione dellattività di dimerizzazione del dominio Ligand-legantesi del recettore degli estrogeni usando lanalisi di due-ibrido dei mammiferi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Scopri l'analisi della dimerizzazione del dominio legante il ligando del recettore degli estrogeni alfa usando l'assay two-hybrid nei mammiferi. Questo metodo semplice rivela l'attività dipendente dal ligando nelle cellule.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori ringraziano la d. ssa Sueyoshi e Wang presso il National Institute di Environmental Health Sciences (NIEHS) per la loro lettura critica del manoscritto e Tanner Jefferson per l'esecuzione di procedure sul video. Questo lavoro è stato supportato dalla 1ZIAES070065 di istituti nazionali di salute Grant (a K.S.K.) dalla divisione di ricerca intramurale del NIEHS.

1. preparazione di plasmidi per il dosaggio di due-ibrido dei mammiferi
<ol><li>Utilizzare i plasmidi seguenti: pG5-Luc, pBIND-ERαEF e patto-ERαEF. Nota: I plasmidi sono disponibili da parte degli autori su richiesta e vengono inviati su carta da filtro. pG5-Luc è il plasmide di reporter che contiene cinque ripetizioni di GAL4 reattivi elementi fusi con l'unità di espressione di luciferase (Figura 1A). pBIND-ERαEF è il plasmide di espressione della proteina per le proteine GAL4DBD-fuse ERα LBD. pBIND-ERαEF contiene un'unità di espressione luciferasi Renilla per normalizzare l'efficienza di trasfezione (Figura 1B). Patto-ERαEF è il plasmide di espressione della proteina per le proteine VP16AD-fuse ERα LBD (Figura 1C). Il diagramma della struttura di proteina espressa da plasmidi è illustrato nella Figura 2.</li>
	<li>Preparare il plasmide DNAs.<ol>
<li>Ritagliare l'area di plasmide-caricato da carta utilizzando forbici pulite e metterlo in una provetta da 1,5 mL. Indossare guanti e utilizzare pinzette pulite per prendere il giornale plasmide-caricato. Aggiungere 100 µ l di tampone Tris-EDTA (TE) (pH 8.0) e agitare bene.</li>
		<li>Aggiungere 1 µ l della soluzione di DNA plasmidico dal passaggio 1.2.1 alla competente Escherichia coli cellule (Vedi Tabella materiali) e tenere il tubo sul ghiaccio per 15 min.</li>
		<li>Cellule competenti di scossa di calore aggiunto il plasmide; Incubare le provette in bagnomaria a 42 ° C per 30 s e, poi, tenerli in ghiaccio per 2 min.</li>
		<li>Aggiungere 250 µ l di brodo super ottima con il mezzo di repressione (SOC) dei cataboliti (temperatura ambiente) per il tubo (s) e la cultura con agitazione a 37 ° C per 30 min.</li>
		<li>Piastra di 100 µ l del colto E. coli su un piatto di brodo (LB) di Luria preriscaldato con 100 µ g/mL ampicillina (piatto di 10 cm di diametro) e coltura a 37 ° C durante la notte.</li>
		<li>Scegli una colonia dalla piastra e aggiungerla in una provetta di 14 mL contenente 2 mL di brodo formidabile (TB) con ampicillina di 100 µ g/mL. Cultura con agitazione a 37 ° C fino a quando il mezzo è vagamente offuscato.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di medium coltivato dal punto 1.2.6 un matraccio di vetro sterilizzati nell'autoclave 250 mL contenente 50 mL di TB con ampicillina di 100 µ g/mL. Cultura con agitazione a 37 ° C per 20-24 h.</li>
		<li>Trasferire la colta e. coli in una provetta conica da 50 mL e centrifugare a 3.450 x g e a temperatura ambiente per 30 min utilizzando il rotore swing-secchio. Eliminare il terreno. Salvare il pellet di e. coli a-80 ° C.</li>
		<li>Aggiungere 3 mL di soluzione di risospensione delle cellule (Vedi Tabella materiali) di e. coli a pellet e sospenderlo completamente. Aggiungere 3 mL di soluzione di lisi delle cellule (Vedi Tabella materiali), mix il tubo dolcemente capovolgendo 10x e tenerlo sul ghiaccio per 5 min (mantenere puntualmente il tempo). Aggiungere 6 mL di soluzione di neutralizzazione (Vedi Tabella materiali), mescolare costantemente il tubo con la spillatura e quindi, tenerlo in ghiaccio per 10 min.</li>
		<li>Centrifugare la provetta a 3.450 x g a 4 ° c per 30 min utilizzando il rotore swing-secchio. Trasferire la soluzione contenente DNA in una nuova provetta conica 50 mL e aggiungere 10 mL di resina purificazione DNA (Vedi Tabella materiali). Sospendere la resina delicatamente.</li>
		<li>Centrifugare la provetta a 625 x g per 1 min utilizzando il rotore swing-secchio. Scartare la soluzione e tenere la resina nella parte inferiore.</li>
		<li>Aggiungere 15 mL di soluzione di lavaggio colonna (acetato di potassio di 80 mM, 8.5 mM Tris-HCl [pH 7.5], 40 µM EDTA e 55% etanolo) nella provetta conica 50 mL e agitare delicatamente per sospendere la resina. Ripetere il passaggio 1.2.11. Nota: La soluzione di lavaggio di colonna deve essere redatto utilizzando pirocarbonato dietilico (DEPC)-acqua trattata o acqua priva di nucleasi.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di soluzione di lavaggio colonna la provetta conica da 50 mL e sospendere la resina con una pipetta da 5 mL. Applicare la resina nella colonna (Vedi Tabella materiali) che è impostata sul collettore di aspirazione. Vuoto, la colonna fino a quando la resina a secco. Aggiungere 6 mL di soluzione di lavaggio di colonna per la colonna e il vuoto.</li>
		<li>Una volta che la resina si asciuga visivamente, staccare il serbatoio dalla colonna. Trasferire la sezione inferiore della colonna (resina) in una provetta da 1,5 mL. Centrifugare la colonna alla massima velocità per 2 minuti con una microcentrifuga per asciugare la resina completamente.</li>
		<li>Trasferire la sezione inferiore della colonna (resina) ad un nuovo tubo di 1,5 mL. Aggiungere 300 µ l di acqua priva di nucleasi alla colonna e attendere che la resina intera è intrisa.</li>
		<li>Centrifugare la colonna alla massima velocità per 1 minuto raccogliere il plasmide DNA contenente soluzione (200-250 µ l).</li>
		<li>Trattare la soluzione contenente DNA con fenolo-cloroformio (1:1), poi con cloroformio come segue.<ol>
<li>Aggiungere lo stesso volume di fenolo-cloroformio (1:1) alla soluzione contenente DNA (200-250 µ l), agitare bene e centrifugare a massima velocità per 2 minuti utilizzando una microcentrifuga. Raccogliere lo strato superiore (soluzione contenente DNA) e aggiungerlo ad un nuovo tubo di 1,5 mL. Ripetere questo passaggio 1x.</li>
			<li>Aggiungere lo stesso volume di cloroformio per la soluzione di DNA contenenti (200-250 µ l), agitare bene e centrifugare a massima velocità per 1 minuto raccogliere lo strato superiore (soluzione contenente DNA) e aggiungerlo a una provetta da 1,5 mL. Nota: L'endotossina (lipopolysaccharide) induce la segnalazione cellulare in alcune cellule. Per evitare tale effetto imprevisto, passaggio 1.2.17 è consigliato, che può ridurre la contaminazione dell'endotossina.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Precipitare il plasmide DNA usando la tecnica di precipitazione dell'etanolo come segue.<ol>
<li>Aggiungere 1/9 del volume di miscela di DNA di acetato di sodio 3 M (pH 5,5) e 20 x del volume di acetato di sodio 3M di etanolo al 100% alla soluzione contenente DNA. Ad esempio, aggiungere 27,8 µ l di acetato di sodio 3 M e 278 µ l di etanolo al 100% a 250 µ l della soluzione del DNA (il volume finale è 555,8 µ l).</li>
			<li>Mantenere la soluzione a-80 ° C per 20 min almeno. Centrifugare a massima velocità per 20 min a 4 ° c. Scartare la soluzione e mantenere il pellet. Aggiungere 200 µ l di etanolo al 75% e sciacquare l'interno del tubo. Centrifugare per 20 min a 4 ° C, gettare la soluzione e mantenere il pellet. Asciugare il pellet di DNA utilizzando un concentratore a vuoto.</li>
			<li>Aggiungere 100-250 µ l di tampone di TE (pH 8.0) al tubo. Dissolva la pallina del DNA e controllare la concentrazione di DNA usando uno spettrofotometro alla lunghezza d'onda di 260 nm. Mantenere la concentrazione di DNA intorno a 0,5 mg/mL.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. mammiferi Two-hybrid Assay
<ol><li>Mantenere le cellule.<ol>
<li>Coltura di cellule di HepG2 carcinoma epatocellulare umano in un 750ml, matraccio di cultura del tessuto di2 di 175 cm con i media privo di rosso fenolo minimi essenziali (MEM), completati con 10% siero bovino fetale (FBS; inattivati), 2 mM L-Glutammina e 1% soluzione di penicillina-streptomicina (antibiotici) per mantenere le cellule.</li>
		<li>Coltura le cellule in un 5% CO2-completati, incubatore 37 ° C fino a quando le cellule sono circa 90% confluenti. Nota: Per ridurre l'attività estrogenica sfondo, privo di rosso fenolo mezzo dovrebbe essere usato per tutti gli esperimenti M2H. Questo passaggio deve essere eseguito all'interno di un armadietto di sicurezza pulito panca/biologico. Le cellule devono essere mantenute dopo la cellula di mammiferi generale cultura protocollo7.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare le celle per la transfezione. Nota: I seguenti passaggi procedurali dovrebbero essere eseguiti all'interno l'armadietto di sicurezza pulito panca/biologico. Le cellule sono coltivate/incubati in un 5% CO2-completati, incubatore 37 ° C in questo passaggio ogni volta.<ol>
<li>Replate le cellule confluenti del 90% per le piastre a 24 pozzetti; Sciacquare le cellule 1 x con tampone fosfato salino (PBS).</li>
		<li>Aggiungere 7 mL di soluzione di tripsina-EDTA 0,05% per il matraccio di cultura e immergere le cellule per 1-2 min, mantenendo il matraccio di cultura in un banco pulito a temperatura ambiente. Rimuovere una parte della soluzione di tripsina-EDTA e lasciare 1-2 mL di soluzione in un matraccio di cultura. Incubare la beuta di cultura nell'incubatrice per 1-2 min.</li>
		<li>Smack il fondo del matraccio per staccare le cellule e controllare le cellule sotto il microscopio. Nota: Se le cellule sono ancora attaccate al pallone, incubare per un altro 1-2 min e, quindi, ripetere il passaggio 2.2.3.</li>
		<li>Sospendere le celle in rosso fenolo-free MEM supplementato con 10% FBS carbone-spogliato (inattivati), 2 mM L-Glutammina e soluzione di penicillina-streptomicina 1%. Nota: Carbone-spogliato FBS deve essere utilizzato per ridurre l'effetto di estrogeno endogeno derivato del siero.</li>
		<li>Contare il numero di cellulare e le cellule in una piastra a 24 pozzetti ad una densità di 1.2 x 105 cellule/pozzetto di semi. Assegnare tre pozzetti per ogni punto di dati (triplice copia).</li>
		<li>Le cellule della coltura durante la notte. Continua al passo 2.4.1.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparare una miscela di DNA per la transfezione. Nota: Il seguente plasmide DNAs transfected in un pozzetto: 100 ng di plasmide del reporter di pG5-Luc, 50 ng di plasmidi di espressione di proteine di fusione di GAL4DBD (pBIND) e 50 ng di plasmidi di espressione di proteine di fusione VP16AD (patto).<ol>
<li>Per analizzare l'attività di dimerizzazione ERα LBD ligando-dipendente, preparare le seguenti combinazioni (Figura 3). Combinazione (i): pBIND-hERαEF, pG5-Luc + patto e pG5-Luc + pBIND-mERαEF + patto. Combinazione (ii): patto-hERαEF, + pBIND-mERαEF e pG5-Luc, pG5-Luc + pBIND-hERαEF + patto-mERαEF. (Iii) combinazione: patto-hERαEF, + pBIND e pG5-Luc, pG5-Luc + pBIND + patto-mERαEF. Nota: Combinazione (i) rappresenta il livello basale sperimentale di umano ERα LBD e mouse ERα LBD, rispettivamente. Se il risultato indica un livello straordinariamente elevato con il ligando da solo, questo metodo è irrealizzabile per l'utilizzo con tale ligando (ad es., dietilstilbestrolo [DES]). Combinazione (ii) rappresenta i livelli di dimerized umano ERα LBD e dimerizza mouse ERα LBD, rispettivamente. (Iii) combinazione rappresenta controlli negativi; utilizzare questo set solo quando l'esperimento è eseguito per la prima volta a valutare il livello di fondo del sistema.</li>
		<li>Prima della miscelazione, calcolare il totale importo del DNA richiesto in base il numero di pozzetti per la transfezione. Per gli esperimenti condotti in triplici copie e in punti cinque dati, mescolare il seguente plasmide DNAs in tubi di due 1.5 µ l per combinazioni (i) e (ii): pG5-Luc, 5 (punti dati) x 3 (pozzi) x 100 ng = 1.500 ng (15 µ l); pBIND-mERαEF, 5 (punti dati) x 3 (pozzi) x 50 ng = 750 ng (7,5 µ l); Patto (per combinazione i) o patto-mERαEF (per combinazione ii), 5 (punti dati) x 3 (pozzi) x 50 ng = 750 ng (7,5 µ l). Nota: La concentrazione di ogni soluzione di DNA del plasmide è 0,1 µ g / µ l.</li>
		<li>Precipitare la miscela di DNA usando la tecnica di precipitazione dell'etanolo. Aggiungere 1/9 del volume di miscela di DNA di acetato di sodio 3 M (pH 5,5) e 20 x del volume di acetato di sodio 3M di etanolo al 100% per la miscela di DNA. Quindi, il tubo di vortice. Nota: ad esempio, aggiungere 3,4 µ l di acetato di sodio 3 M e 34 µ l di etanolo al 100% per i 30 µ l di miscela di DNA plasmidico esemplificato al punto 2.3.2. Questo passaggio consente di mantenere una condizione di transfezione invariabile, e non è necessario eseguire questo passaggio in una cappa di sicurezza biologica.</li>
		<li>Mantenere la miscela durante la notte a-20 ° C. E centrifugare a massima velocità per 20 min a 4 ° C. Scartare la soluzione (il pellet è invisibile). Aggiungere 120 µ l di etanolo al 75% per il tubo; quindi, sciacquare l'interno del tubo. Centrifugare per 20 min a 4 ° C. Scartare la soluzione e asciugare la miscela di DNA utilizzando un concentratore a vuoto per 30 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire la transfezione. Nota: La procedura seguente deve essere eseguita in un banco pulito o una cappa di sicurezza biologica.<ol>
<li>La mattina seguente, sciacquare le cellule seminate in una piastra a 24 pozzetti (dal punto 2.2.6) 2x con 0,5 mL di PBS (temperatura ambiente).</li>
		<li>Aggiungere a caldo (37 ° C) fresco privo di rosso fenolo MEM supplementato con 10% carbone-spogliato FBS (inattivati) e 2 mM L-glutammina senza antibiotici ad ogni pozzetto (medio di 0,5 mL/pozzetto). Mantenere le cellule in un 5% CO2-completati, incubatore a 37 ° C.</li>
		<li>Sospendere la miscela di DNA del plasmide secchi (dal punto 2.3.4) nel mezzo dell'Aquila di Dulbecco modificato (DMEM) (nessun siero, fenolo rosso-libero, senza glutamina; 13 µ l/pozzetto). Calcolare la quantità di DMEM dal numero di pozzetti per la transfezione. Nota: 15 pozzi per combinazione (i) x 13 µ l = 195 µ l e 15 pozzi per combinazione (ii) x 13 µ l = 195 µ l.</li>
		<li>Sospendere il reagente di transfezione (Vedi Tabella materiali; 1,5 µ l/pozzetto) in DMEM (12,5 µ l/pozzetto) in un'altra provetta da 1,5 mL. Calcolare la quantità di reagente di transfezione e DMEM dal numero di pozzetti per la transfezione. Nota: 30 [15 pozzi per combinazione] (i) e 15 per combinazione (ii) x 1,5 µ l di reagente di transfezione + 30 x 12,5 µ l di DMEM = 420 µ l.</li>
		<li>Aggiungere una quantità uguale del mezzo di reagente di transfezione (dal punto 2.4.4) ad ogni provetta (dal punto 2.4.3). Incubare le provette per 5-10 min a temperatura ambiente. Nota: 200 µ l di transfezione reagente medium + 195 µ l di miscela (i) DNA di combinazione = 395 µ l e 200 µ l di terreno di reagente di transfezione + 195 µ l di miscela (ii) del DNA di combinazione = 395 µ l. È importante aggiungere un volume uguale di medie di reagente di transfezione di tubi di combinazione (i) e (ii). Non è necessario utilizzare il mezzo in questo passaggio.</li>
		<li>Aggiungere la miscela combinata (dal passaggio 2.4.5) in ciascun pozzetto (25 µ l/pozzetto) della piastra 24 pozzetti (dal punto 2.4.2) e incubare le cellule per 6 h al 5% CO2-completati, incubatore a 37 ° C.</li>
		<li>Rimuovere il mezzo di transfezione dalla piastra a 24 pozzetti. Aggiungere a caldo (37 ° C) fresco privo di rosso fenolo MEM supplementato con 10% carbone-spogliato FBS (inattivati), 2 mM L-Glutammina, soluzione di 1% di penicillina-streptomicina e ligando (sospesa a etanolo) (medio di 0,5 mL/pozzetto). Coltura delle cellule per 16-18 h in 5% CO2-completati, incubatore a 37 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>Raccogliere i campioni.<ol>
<li>Sciacquare le cellule con 1 mL di PBS e, quindi, aggiungere 100 µ l di tampone di lisi passiva: 1x (Vedi Tabella materiali).</li>
		<li>Agitare vigorosamente le piastre a 24 pozzetti con un miscelatore vortex per staccare le cellule.</li>
		<li>Congelare le piastre (lisati) 1x di azoto liquido o salvarli a-80 ° C prima dell'analisi. Immediatamente prima del saggio, agitando vigorosamente le piastre su un agitatore fino a quando sono a temperatura ambiente. Nota: Questo processo impedisce irregolare che appaiono valori anomali di attività luciferasica.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire un'analisi di dual-luciferase.<ol>
<li>Preparare i reagenti per il sistema dual-luciferase assay (Vedi Tabella materiali).<ol>
<li>Per fare il tampone di substrato (LAS) del saggio di luciferasi, aggiungere tutti i tampone del saggio di luciferasi nel substrato luciferase assay che è in una bottiglia di vetro marrone. Salvare il buffer di LAS a-20 ° C. Nota: Il buffer di LAS dovrebbe essere riscaldato a temperatura ambiente prima dell'uso.</li>
			<li>Per fare il tampone del substrato (RLS) Renilla luciferasi, mescolare Renilla luciferasi substrato e buffer di luciferasi Renilla in un rapporto di 01:50. Fanno fresco RLS nel buffer per ogni dosaggio e utilizzare un tubo nero o un tubo all'ombra di carta stagnola. Calcolare la quantità di tampone RLS rendendo un buffer di fresco. Nota: Il buffer RLS dovrebbe essere riscaldato a temperatura ambiente prima dell'uso.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Impostare i reagenti nel lettore di micropiastre.<ol>
<li>Lavare l'iniezione linee 2x con etanolo al 70%; quindi, lavare le 2 linee x con acqua. Nota: Questo è importante per evitare di disturbare i risultati del saggio.</li>
			<li>Set il LAS buffer al P-iniettore linea (prima iniezione) e impostare il buffer RLS alla linea M-iniettore (seconda iniezione). Non mescolare i buffer. Buffer di RLS inibisce l'attività luciferasica.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Applicare 10 µ l di campioni raccolti (dal punto 2.5.3) per la piastra di plastica bianca 96 pozzetti.</li>
		<li>Applicare le seguenti impostazioni per il lettore di micropiastre. Per la P-iniettore, utilizzare un volume di 50 µ l, un ritardo di 2 s e una velocità di 50 µ l/s. Per il M-iniettore, utilizzare un volume di 50 µ l, un ritardo di 2 s e una velocità di 50 µ l/s. impostare un tempo d'integrazione di 15 Set s. la temperatura a 25 ° C.</li>
		<li>Eseguire il lettore di micropiastre.</li>
		<li>Registrare i valori dell'attività luciferasi (IPValue) e i valori dell'attività Renilla luciferasi (IMValue) utilizzando il programma di acquisizione dati (Vedi Tabella materiali).</li>
		<li>Lavare le linee di iniezione dopo la raccolta dei dati (Vedi punto 2.6.2.1).</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire analisi di dati.<ol>
<li>Utilizzare i valori normalizzati (IPValue/IMValue) per l'analisi dei dati.</li>
		<li>Impostare il valore normalizzato di combinazione (i) [patto pG5-Luc + di + pBIND-ERαEF] con il veicolo (ligando 0 nM) come 1 per il calcolo del livello basale e il homodimerized ERα LBD livello. I livelli sono rappresentati come "Attività relativa".</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Arao, Y., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+F+domain+of+estrogen+receptor+%CE%B1+is+involved+in+species-specific%2C+tamoxifen-mediated+transactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The F domain of estrogen receptor α is involved in species-specific, tamoxifen-mediated transactivation.</a> Journal of Biological Chemistry. 293 (22), 8495-8507 (2018).</li>
<li>Brzozowski, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+basis+of+agonism+and+antagonism+in+the+oestrogen+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular basis of agonism and antagonism in the oestrogen receptor.</a> Nature. 389 (6652), 753-758 (1997).</li>
<li>Shiau, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+of+estrogen+receptor%2Fcoactivator+recognition+and+the+antagonism+of+this+interaction+by+tamoxifen%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The structural basis of estrogen receptor/coactivator recognition and the antagonism of this interaction by tamoxifen.</a> Cell. 95 (7), 927-937 (1998).</li>
<li>Yang, J., Singleton, D. W., Shaughnessy, E. A., Khan, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+F-domain+of+estrogen+receptor-alpha+inhibits+ligand+induced+receptor+dimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The F-domain of estrogen receptor-alpha inhibits ligand induced receptor dimerization.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 295 (1-2), 94-100 (2008).</li>
<li>Montano, M. M., Müller, V., Trobaugh, A., Katzenellenbogen, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carboxy-terminal+F+domain+of+the+human+estrogen+receptor%3A+role+in+the+transcriptional+activity+of+the+receptor+and+the+effectiveness+of+antiestrogens+as+estrogen+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The carboxy-terminal F domain of the human estrogen receptor: role in the transcriptional activity of the receptor and the effectiveness of antiestrogens as estrogen antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 9 (7), Baltimore, MD. 814-825 (1995).</li>
<li>Koide, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Regions+within+the+F+Domain+of+the+Human+Estrogen+Receptor+%CE%B1+that+Are+Important+for+Modulating+Transactivation+and+Protein-Protein+Interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Identification of Regions within the F Domain of the Human Estrogen Receptor α that Are Important for Modulating Transactivation and Protein-Protein Interactions.</a> Molecular Endocrinology. 21 (4), 829-842 (2011).</li>
<li>Mitry, R. R., Hughes, R. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMitry%2C+RR+%22Human+Cell+Culture+Protocols%22">Human Cell Culture Protocols</a>. , Humana Press. (2011).</li>
<li>Arao, Y., Coons, L. A., Zuercher, W. J., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transactivation+Function-2+of+Estrogen+Receptor+%CE%B1+Contains+Transactivation+Function-1-regulating+Element%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Transactivation Function-2 of Estrogen Receptor α Contains Transactivation Function-1-regulating Element.</a> Journal of Biological Chemistry. 290 (28), 17611-17627 (2015).</li>
<li>Huang, H. -J., Norris, J. D., McDonnell, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+negative+regulatory+surface+within+estrogen+receptor+alpha+provides+evidence+in+support+of+a+role+for+corepressors+in+regulating+cellular+responses+to+agonists+and+antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Identification of a negative regulatory surface within estrogen receptor alpha provides evidence in support of a role for corepressors in regulating cellular responses to agonists and antagonists.</a> Molecular Endocrinology. 16 (8), Baltimore, MD. 1778-1792 (2002).</li>
<li>Chang, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+the+LXXLL+nuclear+receptor-coactivator+interaction+motif+using+combinatorial+peptide+libraries%3A+discovery+of+peptide+antagonists+of+estrogen+receptors+alpha+and+beta%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissection of the LXXLL nuclear receptor-coactivator interaction motif using combinatorial peptide libraries: discovery of peptide antagonists of estrogen receptors alpha and beta.</a> Molecular and Cellular Biology. 19 (12), 8226-8239 (1999).</li>
<li>Arao, Y., Hamilton, K. J., Coons, L. A., Korach, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogen+receptor+%CE%B1+L543A%2C+L544A+mutation+changes+antagonists+to+agonists%2C+correlating+with+the+ligand+binding+domain+dimerization+associated+with+DNA+binding+activity%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Estrogen receptor α L543A, L544A mutation changes antagonists to agonists, correlating with the ligand binding domain dimerization associated with DNA binding activity.</a> The Journal of Biological Chemistry. 288 (29), 21105-21116 (2013).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Qui, abbiamo descritto il protocollo per il dosaggio di M2H, concentrandosi sulle condizioni di test per rilevare l'attività di omodimerizzazione di ERα LBD come esempio. In generale, il dosaggio di M2H non è popolare per la valutazione delle attività di dimerizzazione ERα LBD ligando-dipendente. Ciò è dovuto il ERα LBD che possiede una funzione di attivazione trascrizionale; la cui attività si disturba, in alcuni casi, i risultati del dosaggio M2H. Tuttavia, come dimostriamo qui, l'analisi di M2H può essere usata per an...

Recettore degli estrogeni (ERα) è un regolatore della trascrizione di ligando-dipendenti estrogenici. La sequenza dell'amminoacido ERα è altamente conservata tra le specie. A causa di più alta omologia tra umani ed ERα il mouse, la funzione di questi recettori è pensata come identici, e l'attività differenziale di sostanze estrogeniche (ad es., tamoxifene) in quelle specie è causato da differenze della specie in metabolismi chimici piuttosto che dalle differenze strutturali di ERα. ERα è altamente conservata strutture di dominio che sono comuni tra la superfamiglia dei recettori nucleari (NR), designato ai domini di F. E dominio o dominio di legame al ligando (LBD) include la tasca di ligand-legantesi e la funzione di attivazione trascrizionale 2, denominata AF-2. Il dominio di F è localizzato immediatamente adiacente al dominio E ed è il dominio più variabile tra la NRs. Anche tra umani e mouse ERα, omologia del dominio di F è notevolmente inferiore a quello di altri domini1. Il LBD-ligando di ERα migliora la dimerizzazione della proteina ERα per associare l'elemento specifico di DNA estrogeno-rispondente direttamente per regolare la trascrizione genica di ligando-dipendenti (classica azione di ERα). Studi cristallografici hanno rivelato il posizionamento differenziale dell'elica 12 (AF-2 core domain) con estradiolo (E2) - o 4-idrossi-tamoxifen (4OHT) - associato LBD dimeri2,3. Il dominio di ERα F (45 aminoacidi) collegare elica 12 direttamente. Tuttavia, non c'è nessuna informazione per quanto riguarda l'effetto di questa estensione di 45 aminoacidi (dominio F) dall'elica 12 sulla dimerizzazione di ERα LBD. In questo studio, dimostriamo il contributo del dominio F per la specie-4OHT-dipendente ERα LBD omodimerizzazione usando un'analisi di (M2H) due-ibrido dei mammiferi.
Il dosaggio di M2H è un metodo per dimostrare le interazioni proteina-proteina in cellule di mammifero introducendo le tre differenti plasmide DNAs: due plasmidi di espressione della proteina, che esprimono la fusione di dominio (DBD) GAL4 DNA-legantesi ERα LBD e VP16AD fusione ERα LBD, e un GAL4RE-fuse luciferasi espressione del reporter del. Quando la fusione GAL4DBD ERα LBD e la fusione di VP16AD ERα LBD interagire (fare un dimero) nelle cellule, questo complesso della proteina si lega per il GAL4RE e, quindi, attiva l'espressione di gene di luciferase attraverso la funzione di transattivazione di VP16AD-dipendente. Il livello di LBD omodimerizzazione può essere valutato con l'attività luciferasica.
Il dosaggio di lievito due-ibrido (Y2H) è un metodo alternativo basato sullo stesso principio che utilizza lievito come l'ambiente host. Utilizzando il sistema di Y2H i rapporti precedenti hanno dimostrato che F-dominio-troncato umano ERα LBD aumenta reclutamento di coactivator di E2-dependent, concludendo che il dominio di F previene E2-mediata trascrizione4. Questo risultato è coerente con altri rapporti che hanno dimostrato l'attività trascrizionale attenuato di F-dominio-troncato ERα umano in cellule di mammiferi5,6. Recentemente, il nostro studio, utilizzando il sistema M2H, ha dimostrato che l'attività di reclutamento di coactivator E2-dipendente di umano ERα LBD è diminuito del troncamento del dominio di F in cellule di mammiferi ed è coerenza con la trascrizione attività1. Queste osservazioni suggeriscono che il ruolo fisiologico di interazione proteina-proteina differisce in un modo specifico del tipo di cella e contesto. Il dosaggio di M2H può dimostrare attività di interazione proteina-proteina nello stesso contesto cellulare che viene utilizzato per determinare l'attività trascrizionale. Ciò fornisce un vantaggio del dosaggio M2H rispetto alla Y2H o altre analisi di interazione proteina-proteina in vitro .
Ci rimangono domande per quanto riguarda i meccanismi molecolari dell'attività agonista parziale di modulatori dei recettori selettivi dell'estrogeno (SERMs)(ad esempio, 4OHT) per regolare la trascrizione ERα-mediata. Analisi di M2H ERα LBD-based possono essere applicate per studiare il meccanismo dell'attività agonista parziale di SERMs in vari tipi di cellule di mammifero.

<table><tbody><tr><td>pG5-Luc</td><td>Promega</td><td>E249A</td><td>Componente del sistema a due ibridi di mammifero CheckMate</td></tr><tr><td>pBIND</td><td>Promega</td><td>E245A</td><td>Componente del sistema a due ibridi di mammifero CheckMate</td></tr><tr><td>pACT</td><td>Promega</td><td>E246A</td><td>Componente del sistema a due ibridi di mammifero CheckMate</td></tr><tr><td>One Shot TOP10 E. coli chimicamente competente</td><td>Invitrogen</td><td>C404010</td><td></td></tr><tr><td>Rotore per centrifuga</td><td>SORVALL</td><td>75006445</td><td></td></tr><tr><td>secchi oscillanti</td><td>SORVALL</td><td></td> Soluzione di risospensione cellulare 75006441 <td></td></tr><tr><td>(CRA)</td>Soluzione di lisi cellulare <td>Promega</td><td>A7112</td><td></td></tr><tr><td>(CLA)</td>Soluzione di neutralizzazione <td>Promega</td><td>A7122</td><td></td></tr><tr><td>(NSA)</td>Soluzione di lavaggio della colonna <td>Promega</td><td>A7131</td><td></td></tr><tr><td>(CWB)</td><td>Promega</td><td>A8102</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Midipreps Resina per purificazione del DNA</td><td>Promega</td><td>A7701</td><td></td></tr><tr><td>Wizard Midicolumns</td><td>Promega</td><td>A7651</td><td></td></tr><tr><td>MEM, senza glutammina, senza rosso fenolo</td><td>Gibco</td><td>51200038</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina (200 mM)</td><td>Gibco</td><td>A2916801</td><td></td></tr><tr><td>0,5% Tripsina-EDTA (10x)</td><td>Gibco</td><td>15400054</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (100x)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>BenchMark siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-106</td><td>Carbone inattivato a caldo</td></tr><tr><td>: destrano stripping siero fetale bovino</td><td>Gemini-Bio</td><td>100-119</td><td>DMEM inattivato a caldo</td></tr><tr><td>, glucosio alto, senza glutammina, senza fenolo rosso</td><td>Gibco</td><td>31053028</td><td>per trasfezione</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668027</td><td></td></tr><tr><td>Lisi passiva 5X Tampone</td><td>Promega</td><td>E1941</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di analisi reporter a doppia luciferasi</td><td>Promega</td><td>E1980</td><td></td></tr><tr><td>Lettore di micropiastre SpectraMax L</td><td>Dispositivi</td><td></td><td></td>molecolari</tr> Software <tr><td>SoftMax</td><td>Pro</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rilevazione dell'attività di dimerizzazione del dominio ligand-legantesi del recettore degli estrogeni usando l'analisi di due-ibrido dei mammiferi

Detecting the Ligand-binding Domain Dimerization Activity of Estrogen Receptor Alpha Using the Mammalian Two-Hybrid Assay

Recettore degli estrogeni (ERα) è un regolatore della trascrizione di ligando-dipendenti estrogenici. La sequenza della proteina ERα è altamente conservata tra le specie. Si è pensato che la funzione dell'essere umano e il mouse ERαs è identico. Dimostriamo l'effetto differenziale 4-idrossi-tamoxifen (4OHT) il mouse e attività dimerizzazione del dominio (LBD) del ligand-legantesi ERα umana usando l'analisi di (M2H) due-ibrido dei mammiferi. Il dosaggio di M2H in grado di dimostrare l'efficienza delle attività di omodimerizzazione LBD in cellule di mammifero, che utilizzano la transfezione di due plasmidi di espressione della proteina (GAL4 DNA-binding dominio [DBD] fusione LBD e VP16 transactivation dominio [VP16AD] fusione LBD) e un Elemento Gal4-sensible a reagire (GAL4RE) fuso plasmide del reporter di luciferase. Quando la fusione GAL4DBD LBD e la fusione di VP16AD LBD fanno un dimero nelle cellule, questo complesso della proteina si lega per il GAL4RE e, quindi, attiva un'espressione di gene della luciferasi attraverso l'attività di trascrizione dipendente VP16AD. L'attivazione di 4OHT-mediata luciferasi è maggiore nelle cellule HepG2 che sono state trasfettate con i plasmidi della espressione di proteina fusione ERα LBD di mouse rispetto nelle cellule del plasmide transfettata espressione umane del proteina fusione ERα LBD. Questo risultato suggerisce che l'efficacia del mouse 4OHT-dipendente attività omodimerizzazione ERα LBD è superiore umano ERα LBD. In generale, l'utilizzo del dosaggio M2H non è ideale per la valutazione dell'attività di dimerizzazione LBD recettore nucleare, perché agonistiche ligandi che permettono di migliorare il livello basale dell'attività LBD e che impedisce la rilevazione di attività di dimerizzazione LBD. Abbiamo trovato che 4OHT non migliora l'attività basale ERα LBD. Che è un fattore chiave per essere in grado di determinare e rilevare l'attività di dimerizzazione di LBD 4OHT-dipendente per con successo usando l'analisi M2H. Analisi di M2H ERα LBD-based possono essere applicate per studiare l'attività agonista parziale dei modulatori del recettore estrogeno selettivo (ad esempio, 4OHT) in vari tipi di cellule di mammifero.

Figura 3 Visualizza la combinazione di possibili risposte la combinazione (i) e combinazione (ii) plasmide-transfettati. I risultati sperimentali sono riportati nella Figura 4. L'attività della combinazione (i) (pG5-Luc + pBIND-mERαEF + patto) Mostra di stimolazione di 10 nM E2 (Figura 4A), perché la LBD ERα contiene il dominio di transattivazione ligando-dipendente funzionale, AF-2....

Presentiamo un metodo per analizzare la 4-idrossi-tamoxifen-dipendente dell'estrogeno recettore alfa ligand-legantesi dominio dimerizzazione attività usando l'analisi di due-ibrido dei mammiferi.

Rilevazione dell'attività di dimerizzazione del dominio Ligand-legantesi del recettore degli estrogeni usando l'analisi di due-ibrido dei mammiferi

Estrogen receptor alpha (ER&#945;) is an estrogenic ligand-dependent transcription regulator. The sequence of ER&#945; protein is highly conserved among ...

Quindi questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sulla capacità dei ligandi estrogenici di regolare l'alfa del recettore degli estrogeni e i meccanismi dei modulatori selettivi del recettore degli estrogeni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è un metodo semplice. Dimostra l'attività di dimerizzazione del dominio dimerizzazione del dominio del recettore degli estrogeni dipendente dal ligando nelle cellule.A dimostrare la procedura sarà Tanner Jefferson, uno studente postdoc del nostro gruppo. Questo metodo utilizza tre diversi plasmidi per rilevare l'attività di dimerizzazione del dominio di legame del recettore degli estrogeni nelle cellule. pG5-Luc è il plasmide reporter luciferasi per rilevare l'efficacia dell'attività di dimerizzazione.Il recettore degli estrogeni del topo pBIND alpha EF è un fattore di trascrizione galattosio-responsive GAL4 DNA legato a un principale plasmide di espressione del dominio alfa ligando del topo fuso che si lega all'elemento reattivo GAL4 sul reporter pG5-Luc. PACT mouse estrogen receptor alpha EF è un virus herpes simplex transactivating segment protein VP16 dominio di attivazione fuso mouse estrogeno recettore alfa ligando legame dominio espressione plasmide che non si lega direttamente al giornalista pG5-Luc. Quando è presente il ligando corretto, le proteine derivate dal recettore degli estrogeni del topo pBIND alfa EF e dal recettore degli estrogeni del topo pACT alfa EF plasmidi si legano attraverso il dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni.L'efficienza della dimerizzazione è determinata dall'attività della luciferasi. Il passo più importante è controllare l'attività del recettore degli estrogeni del topo pBIND alfa proteina derivata da EF. L'attività del recettore degli estrogeni derivato da pBIND alfa ligando legare il dominio in ogni ligando senza il recettore degli estrogeni pACT alfa EF plasmide deve essere valutata prima di analizzare l'attività di dimerizzazione del dominio legante del recettore degli estrogeni dipendente dal ligando.Inizia aggiungendo le combinazioni plasmide appropriate in due tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri per combinazione. Preparare le due combinazioni della miscela di DNA. Il primo tubo contiene pG5-Luc, recettore pBIND-estrogeno-alfa EF e plasmidi pACT vuoti.Il secondo tubo contiene i pG5-Luc, il recettore pBIND-estrogeno-alfa EF e i plasmidi pACT-recettore-estrogeno-alfa EF. Per far precipitare il DNA, aggiungere un 1/9 del volume della miscela di DNA di tre acetati di sodio molare e un volume di acetato di sodio molare 20X del 100% di etanolo alla miscela di DNA in ogni tubo e vortice dei tubi. Conservare le miscele a 20 gradi Celsius durante la notte prima di centrifugare alla massima velocità la mattina successiva.Scartare i supernaganti e rimescolare i pellet invisibili in 120 microlitri di 75% di etanolo per tubo, facendo attenzione a risciacquare qualsiasi DNA attaccato all'interno dei tubi. Dopo una seconda centrifugazione nelle stesse condizioni, scartare i supernatanti e asciugare il DNA in un concentratore sottovuoto per 30 minuti. Per la trasfezione, lavare due volte le cellule carcinoma epatocellulari umane preparate con 0,5 millilitri di PBS a temperatura ambiente per pozzo per lavaggio e nutrire le cellule con 0,5 millilitri di MEM fresco privo di fenolo di 37 gradi Celsius, integrato con siero bovino fetale inattivato al carbone del 10% e due L-glutammina millimolare.Successivamente, sospendere la miscela di DNA plasmide essiccato e il reagente di trasfezione nel volume appropriato di DMEM per numero di pozzi in singoli tubi di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Aggiungere un volume uguale di mezzo reagente di trasfezione a ciascun tubo di miscela di DNA plasmide sospeso da DMEM. Dopo un'incubazione da cinque a 10 minuti a temperatura ambiente, aggiungere 25 microlitri di miscela di DNA ai pozzi sperimentali appropriati della piastra di coltura cellulare del carcinoma epatocellulare umano a 24 porri per una trasfezione di sei ore nell'incubatore di coltura cellulare.E alla fine dell'incubazione, sostituire il mezzo di trasfezione con 0,5 millilitri di MEM fresco privo di fenolo di 37 gradi Celsius integrato con FBS inattivato al calore 10% spogliato di carbone, due l-glutammina millimolare, 1%penicillina streptomicina e ligando per pozzo e riportare le cellule nell'incubatrice di coltura cellulare per altre 16-18 ore. La mattina dopo, lavare le cellule con un millilitro di PBS per pozzo e attaccare le cellule da ogni pozzo con 100 microlitri di tampone dilisi passiva per pozzo e scuotere vigorosamente con un miscelatore a vortice. Quindi congelare i liscimi cellulari in azoto liquido.Il giorno del doppio test della luciferasi, agitare i lisati su uno shaker fino a quando la piastra raggiunge la temperatura ambiente e trasferire 10 microlitri di lisato in singoli pozzi di una piastra di plastica bianca da 96 po '. Quindi leggi l'attività della luciferasi di ogni campione di lisato cellulare su un lettore di micropiatte. Il trattamento del recettore degli estrogeni del topo pBIND alfa EF e pACT plasmidi cellule trasfette con 10 estradiolo nanomolare stimola l'attività luciferasi in quanto il dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni contiene il dominio funzionale di transattivazione dipendente dal ligando, AF-2.Una e 10 concentrazioni nanomolare, tuttavia, inducono l'attività della luciferasi nelle cellule trasfette con la combinazione di pBIND e pACT recettore degli estrogeni del topo alfa EF plasmidi, suggerendo la fattibilità di questa procedura per valutare l'attività di dimerizzazione del dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni fino a un nanomolare del trattamento estradiolo. Il trattamento con 4-idrossi-tamoxifene non provoca attività luciferasi nel recettore degli estrogeni del topo pBIND alfa EF e cellule transfette plasmidali pACT, suggerendo che la funzione AF-2 del recettore degli estrogeni alfa non è attivata da questo ligando. Fino a 10 concentrazioni nanomolare, tuttavia, induce l'attività della luciferasi nelle cellule trasfette con la combinazione di pBIND e recettore degli estrogeni del topo pACT alfa EF plasmidi, suggerendo che questa procedura è fattibile per valutare l'attività di dimerizzazione del dominio di legame del recettore degli estrogeni alfa ligando fino a 10 nanomolare del trattamento con 4-idrossi-tamoxifene.L'attività dalla combinazione di pBIND e pACT mouse estrogen receptor alpha ligand binding domain expression plasmidi con 4-idrossi-tamoxifene è significativamente superiore alla combinazione di pBIND e pACT umano recettore degli estrogeni alfa ligando legame dominio espressione plasmidi. Ciò indica che l'attività di omodimerizzazione dipendente da 4 idrossi-tamoxifene del dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni del topo è più potente del dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni umani. Inoltre, l'attività di omodimerizzazione dipendente da 4-idrossi-tamoxifene del dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni del topo contenente un dominio F umano è significativamente inferiore a quella del dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni del topo di tipo selvatico.Al contrario, l'attività di omodimerizzazione dipendente da 4-idrossi-tamoxifene del dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni umani contenente un dominio F del topo è significativamente superiore a quella del dominio di legame alfa ligando del recettore degli estrogeni umani di tipo selvatico. Ciò suggerisce che il dominio F ha un'influenza sull'attività di omodimerizzazione del dominio alfa ligando legante alfa legante 4-idrossi-tamoxifene dipendente dalle specie. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di testare l'attività basale del dominio di legame del DNA GAL4 che lega il ligando alfa del recettore degli estrogeni fuso legare l'attività del dominio con il ligando.Tale attività dovrebbe essere la stessa del trattamento del veicolo.

detecting-ligand-binding-domain-dimerization-activity-estrogen

Research

Ricerca

JoVE Journal

Cancer Research

Ricerca sul cancro

Questo video descrive un test reporter basato su cellule per determinare l'attività estrogenica di composti di origine vegetale. Un composto con attività estrogeno-simile imita il suo legame con i recettori degli estrogeni e guida a valle la trascrizione genica dell'enzima reporter. L'enzima reporter genera bioluminescenza in una reazione, indicando l'attività estrogenica del composto.

Saggio dell'attività del recettore degli estrogeni-reporter per lo screening dell'attività estrogenica dei fitoestrogeni

Ketoconazolo lega e antagonizza Pregnane X Receptor (PXR) attivazione. Di lievito di alta schermi di throughput di mutanti PXR definiscono una regione unica per l'associazione ketoconazolo. Questo metodo genetico a base di lievito scopre interazioni recettore nucleare nuovi con leganti che associano con siti di legame di superficie.

Reverse lievito sistema Two-ibrida per identificare mammiferi Nuclear Receptor residui che interagiscono con leganti e / o antagonisti

Molecular segnalazione sia attraverso gli estrogeni e microRNA sono fondamentali nello sviluppo del cancro al seno e la crescita. Estrogeni attiva i recettori degli estrogeni, che sono fattori di trascrizione. Molti fattori di trascrizione in grado di regolare l'espressione dei microRNA, e microRNA regolati dagli estrogeni possono essere profilato utilizzando diverse tecniche su larga scala.

Profiling di microRNA regolati dagli estrogeni in cellule di carcinoma mammario

Questo protocollo descrive l'etichettatura del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) sulle cellule di fibroblasti COS7 e la successiva microscopia ottica ed elettronica correlativa di cellule intere allo stato idratato. L'etichetta conteneva punti quantici fluorescenti. Il protocollo può essere utilizzato per studiare la stechiometria dell'EGFR a livello di singola molecola.

Studiare la Stechiometria di Epidermal Growth Factor Receptor in cellule intatte con correlativa Microscopia

Questo articolo presenta una schermata di estrogeno ottimizzato lievito per quantificare ligandi in prodotti di cura personale (PCPs) che legano l'alfa recettori dell'estrogeno (ERα) e/o beta (ERβ). Il metodo incorpora due opzioni di substrato colorimetrico, una sei giorni incubazione refrigerata per uso nei corsi di laurea e gli strumenti statistici per l'analisi dei dati.

Rilevamento di ligandi estrogenici nei prodotti di cura personale utilizzando un lievito estrogeno schermo ottimizzato per il laboratorio di insegnamento universitari

Qui, vi mostriamo come utilizzare un dosaggio di legatura di prossimità (PLA) per visualizzare MST1/MST2 eterodimerizzazione in celle fisse con alta sensibilità.

Rilevamento di eterodimerizzazione di isoforme della proteina usando un'analisi in Situ vicinanza legatura

La creazione di sistemi di dimerizzazione delle proteine indotta chimicamente con l'affinità e la specificità desiderate per ogni piccolo ligando molecolare avrebbe molte applicazioni biologiche di rilevamento e attuazione. Qui, descriviamo un metodo efficiente e generalizzabile per l'ingegneria de novo di sistemi di dimerizzazione chimicamente indotti attraverso la selezione graduale di una libreria di anticorpi combinatori combinatori e di foragi.

Creazione di sistemi di dimerizzazione delle proteine altamente specifici indotta chimicamente mediante la selezione stepwise di phage di una biblioteca combinatoria di anticorpi a dominio singolo

Abbiamo ottimizzato un recettore degli estrogeni disponibile in commercio β reporter per lo screening di alimenti primati umani e non umani per l'attività estrogenica. Abbiamo convalidato questo saggio mostrando che la soia alimentare umana estrogenica nota si registra in alto, mentre altri alimenti non mostrano alcuna attività.

Screening per fitoestrogeni utilizzando un recettore degli estrogeni a base cellulare β test reporter

L'ibridazione in situ a fluorescenza di RNA a singola molecola (smFISH) è un metodo per quantificare con precisione i livelli e la localizzazione di specifici RNA a livello di singola cellula. Qui riportiamo i nostri protocolli di laboratorio convalidati per l'elaborazione a banco umido, l'imaging e l'analisi delle immagini per la quantificazione di RNA a singola cellula di specifici RNA.

Analisi a singola cellula di alleli trascrizionalmente attivi mediante FISH a singola molecola

Presentiamo un test ELISA sandwich convalidato utilizzando nuovi anticorpi monoclonali anti-HER2. Questo test consente una quantificazione precisa della proteina HER2 legata alle cellule e rilasciata da cellule in coltura in vitro e altri campioni, inclusi sangue e tessuti.

Saggio immunochimico convalidato per la determinazione completa del recettore 2 del fattore di crescita epidermico umano rilasciato e legato alle cellule

Scopri l'analisi della dimerizzazione del dominio legante il ligando del recettore degli estrogeni alfa usando l'assay two-hybrid nei mammiferi. Questo metodo semplice rivela l'attività dipendente dal ligando nelle cellule.

Rilevazione dellattività di dimerizzazione del dominio Ligand-legantesi del recettore degli estrogeni usando lanalisi di due-ibrido dei mammiferi (Video) | JoVE Journal

Rilevazione dell'attività di dimerizzazione del dominio Ligand-legantesi del recettore degli estrogeni usando l'analisi di due-ibrido dei mammiferi

Esplora altri video