Preparazione di organismi procarioti ed eucarioti mediante essiccazione chimica per analisi morfologica in microscopia elettronica (SEM)

Questo protocollo si concentra su due metodi di essiccazione chimica, hexamethyldisilazane e T-butyl alcohol e la loro applicazione che imaging sia organismi procariotici che eucarioti che utilizzano SEM. Il vantaggio principale di questa tecnica è che non richiede l'uso di attrezzature di essiccazione specializzate come un essiccatore a punti critico per preparare campioni per l'analisi. Questo protocollo descrive i metodi per l'uso della disidratazione chimica e l'analisi SEM di tre tipi di organismi, ma sarebbe ampiamente applicabile all'esame di molti tipi di organismi e tessuti.

A dimostrare la procedura sarà Madison Koon, una studentessa universitaria del mio laboratorio. Per iniziare, preparare i cianobatteri mediante fissazione notturna. Quindi, trasferirli in un impianto di filtrazione da 10 mL contenente un filtro in policarbonato da 25 mL.

Sigillare l'avambraccio e l'imbuto del carro di filtrazione con tappi di gomma per contenere la coltura nell'imbuto. Dopo aver rimosso entrambi i tappi, rimuovere il fissatore aspirapolvere delicatamente sul pallone di filtrazione. Per preparare euglenoidi di alghe uni cellali, fissarli aggiungendo 3 gocce di tetrossido di osmio al 4% direttamente alla coltura che è stata precedentemente trasferita in un impianto di filtrazione da 10 mL.

Dopo un'incubazione di 30 minuti, rimuovere entrambi i tappi e rimuovere il fissatore aspirando delicatamente sul pallone di filtrazione. Lavare gli euglenoidi fissi tre volte con 5 ml di tampone fosfato 0,1 M pH 7,0 a temperatura ambiente per dieci minuti ciascuno mantenendo il pallone e l'imbuto chiusi con i tappi per tenere il lavaggio. Dopo aver rimosso entrambi i tappi, rimuovere ogni lavaggio sottovuoto delicato sul pallone di filtrazione.

Per disidratare il campione mantenendo l'immersione continua, utilizzare una serie di etanolo graduato per dieci minuti in un volume di 5 ml nell'imbuto mantenendo il pallone e l'imbuto chiusi con i tappi per contenere l'etanolo nell'imbuto. Dopo aver rimosso entrambi i tappi sottovuoto delicatamente sul pallone di filtrazione per rimuovere l'etanolo. Trasferire il campione in un piatto di pesatura in alluminio usa e getta contenente appena il 100% di etanolo sufficiente per coprire il campione.

Per eseguire l'essiccazione chimica degli euglenoidi utilizzando la TBA, sostituire prima la soluzione di etanolo al 100% nella piastra di alluminio con una soluzione da 1 a 1 di TBA e 100%etanolo per venti minuti. Quindi, sostituire la soluzione da 1 a 1 con 100%TBA per venti minuti e ripetere il processo due volte. Rimuovere tba e sostituire con appena sufficiente fresco 100%TBA per coprire il campione.

Posizionare il piatto a quattro gradi celsius per dieci minuti per congelare la TBA. Trasferire il campione in un essiccatore sottovuoto con confezioni di gel congelato per mantenere la TBA congelata. Utilizzare una pompa rotante per evacuare e mantenere il vuoto per consentire al campione di asciugarsi per sublimazione sottovuoto del TBA congelato per almeno tre ore.

Per montare i cianobatteri negli euglenoidi, etichettare il fondo di uno stub di montaggio in alluminio da 25 mm per indicare ciò che viene posizionato sopra. Quindi posizionare ogni filtro su una linguetta adesiva in carbonio fissata nella parte superiore dello stub. Per preparare Drosophila melanogaster, immergere le mosche anestetizzate in 1 mL di fissatore per due ore a quattro gradi celsius, assicurandosi che siano completamente sommerse.

Utilizzare una pipetta di vetro per rimuovere il fissatore. Lavare il campione fisso di Drosophila in un tubo di microcentrifugo da 1,5 ml tre volte con 1 ml di tampone fosfato da 0,1 M, pH 7,2 a temperatura ambiente per dieci minuti. Utilizzare una pipetta di vetro per rimuovere ogni lavaggio, facendo attenzione a non rimuovere il campione.

Quindi, disidratare il campione in un tubo di microfugo in un volume di 1 ml utilizzando una serie di etanolo graduato per dieci minuti ciascuno. Utilizzare una pipetta di vetro per rimuovere ogni lavaggio, facendo attenzione a non rimuovere il campione. Conservare il campione nel tubo di microcentrifugo da 1,5 ml con appena il 100% di etanolo sufficiente a coprirlo.

Per eseguire l'essiccazione chimica delle mosche utilizzando HMDS, sostituire prima la soluzione di etanolo al 100% con una soluzione da 1 a 2 di HMDS e 100%etanolo per venti minuti. Quindi sostituire la soluzione con una soluzione da 2 a 1 di HMDS e 100%etanolo per venti minuti. Infine, sostituire questa soluzione con 100%HMDS per venti minuti e quindi ripetere il processo una volta.

Trasferire il campione che si trova in un tubo di micro centrifuga da 1,5 ml e HMDS in un piatto di pesatura in alluminio usa e getta. Sostituire 100%HMDS con appena sufficiente 100%HMDS fresco per coprire l'esempio. Posizionare il campione all'interno della piastra di alluminio direttamente in una cappa chimica per asciugare con un coperchio sciolto come una scatola per evitare che i detriti cadano sul campione e lasciare asciugare per 12-24 ore.

Per montare Drosophila, etichettare il fondo di uno stub di montaggio in alluminio. Utilizzare pinzette di precisione per posizionare le mosche essiccate nella posizione desiderata su una linguetta adesiva in carbonio fissata nella parte superiore di uno stub sotto un microscopio sezionato. Applicare adesivo conduttivo argento intorno ai bordi esterni degli stub.

Utilizzare uno stuzzicadenti per collegare la vernice argentata alle mosche, garantendo la conducibilità, assicurandosi che la vernice non tocchi l'area di imaging desiderata. Posizionare gli stub in una scatola portatubi, quindi posizionare la scatola portatubi aperta in un essiccatore e lasciare asciugare la vernice argentata per almeno tre ore. Per preparare l'apparato di rivestimento dello sputter, eseguire da 4 a 5 vampate di gas argon.

A seconda dei campioni da patilevare, impostare il timer su impostazioni diverse come descritto nel manoscritto. Sputter rivestire gli stub seguendo le istruzioni dei produttori. Infine, campioni di immagini utilizzando un microscopio elettronico a scansione che include un rivelatore di elettroni secondario con impostazioni che dipendono dal campione utilizzato.

Una preparazione riuscita dei cianobatteri per SEM utilizzando questo protocollo ha prodotto immagini in cui sono visibili dettagli della cellula, tra cui forma e consistenza della superficie, nonché una tovaglia di mucillagine e proiezioni dalle cellule. L'immagine SEM di una specie filamentosa di acqua dolce del Colorado mostra una lucentezza visibile della mucillagine. L'immagine SEM di un batterio d'acqua dolce dell'Ohio rivela singole cellule che a volte formano colonie tenute insieme da un sottile strato di mucillagine.

Le sporgenze filamentose si estendono dalle singole cellule. Immagini di specie filamentose sconosciute provenienti da un estuario ad alta salinità nelle acque costiere del Texas mostrano cellule individuali e divisorie. La SEM è stata utilizzata per visualizzare le strisce pellicle di due diverse specie euglenoidi.

Quando si confrontano Monomorphina e Aenigmatica con Monomorphina pseudo pyrum, la disposizione elicoinica visibile delle strisce pellicle che emergono all'estremità posteriore per formare una coda, aiuta in filogenesi alla terminazione. Le immagini SEM dei normali occhi drosophila mostrano una serie ordinata di setole e lenti, ma l'espressione delle proteine associate al morbo di Alzheimer crea il fenotipo oculare ruvido. I geni che sopprimono o migliorano il fenotipo oculare ruvido possono svolgere un ruolo fisiologico nella progressione della malattia.

Ecco esempi di potenziali cadute di pozzi da evitare, incluso un esempio della struttura compressa dell'occhio da tecnica di essiccazione impropria e carica elettronica da una codifica dello sputter insufficiente che appare durante l'acquisizione dell'immagine. I protocolli qui descritti utilizzavano organismi che molto con rispettata complicità, eppure tutti sono suscettibili all'analisi SEM per raccogliere informazioni utili e morfologiche che sono fondamentali per le scoperte scientifiche che abbracciano molte sotto discipline della biologia. Non dimenticare che lavorare con alcol T-Butile, Hexamethyldisilazane e tetrossido di osmio può essere pericoloso e le misure di sicurezza appropriate dovrebbero sempre essere osservate per proteggere gli utenti, in particolare gli studenti che maneggieranno queste sostanze chimiche.