Name: Un test di competizione di piatto come una rapida valutazione preliminare di soppressione di malattia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 23 s
Description: Scopri un saggio di competizione su piastra per valutare rapidamente la soppressione di malattie causate da patogeni del suolo come Rhizoctonia solani. Questo metodo semplice ed economico riduce i tempi da tre settimane a soli due-tre giorni.

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Il Vermont Agricultural Experiment Station competitivo Hatch programma VT-HO1609 ha finanziato la ricerca. Lynn Fang ha utilizzato il metodo come parte della sua tesi di M.S. presso University of Vermont6.

1. preparare in anticipo
<ol><li>Coltura fungosa Master (microrganismo da testare)<ol>
<li>Ordinare da American Type Culture Collection, collezione di microbiologia9, dal relativo teleomorfo Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) o MYA 4031.</li>
		<li>In alternativa: Raccogliere locali isolati come fatto dagli autori. Piantine di rosso ravanello (Raphanus sativus) funzionano bene come una pianta di esca; raccogliere suolo da una posizione nota per avere una storia di smorzamento-off o radice marciume causato da r. solani. Seminare i semi nel terreno e isolare dalle lesioni della radice quando le piantine hanno 3 o 4 settimane.<ol>
<li>Rimuovere le piantine dal suolo e sciacquare con acqua corrente. Cercare marrone tessuto nella regione ipocotile tra le foglie e la radice (Figura 1).</li>
			<li>Utilizzare una singola lama di rasoio taglio per tagliare segmenti di 1 cm dell'ipocotile o radice che hanno un colore marrone. Utilizzare pinze sterilizzate a fiamma per immergere i segmenti in soluzione al 10% di candeggina per 1 min, seguito da un risciacquo di s 10 in acqua sterile. Nota: Parte superiore e inferiore di una capsula di Petri sterile sono utili contenitori per questo passaggio.</li>
			<li>Pinze uso fiamma-sterilizzato per trasferire la pianta pezzi all'interno di un tovagliolo di carta per asciugare e quindi posizionare sulla superficie di una piastra Petri con agar (15 g in 1 L) di acqua.</li>
			<li>Posizionare la piastra di Petri all'interno di un contenitore di plastica con un coperchio e incubare a temperatura ambiente (circa 20 ° C). Pulire l'interno del contenitore con etanolo 75% o di candeggina al 10% e lasciare asciugare all'aria prima di inserire il piatto.</li>
			<li>Mantenere gli isolati in stoccaggio a lungo termine su una media minima di farina di mais agar slants (17 g in 1 L) (a 5 ° C).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58767/58767fig1.jpg"> Figura 1: i sintomi della malattia. Terreno contenente r. solani provoca chiazze germinazione e istituzione (a sinistra). Sintomi su semenzali di ravanello si presentano come lesioni marrone presso l'ipocotile (a destra). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58767/58767fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="2"><li>Utilizzare piastre di patata destrosio agar (39 g in 1 L) per inoculo per questa analisi del piatto.<ol>
<li>Stabilire una cultura figlia della cultura di Rhizoctonia su agar patata destrosio con uno o due giorni prima del saggio, per assicurare è ben consolidata sulla piastra di coltura prima del dosaggio. Avviare la cultura figlia trasferendo un piccolo pezzo (10 mm di diametro) di r. solani dalla cultura master al centro di un piatto fresco di agar di patata destrosio (Figura 2). Nota: Lavorare in una cappa a flusso laminare o pulire giù un banco di laboratorio con candeggina o 75% etanolo al 10% per minimizzare il rischio di contaminazione.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Autoclave 25 mL provette con aliquote di 10 mL di acqua distillata (2 x numero di campioni).</li>
</ol>2. preparazione dei campioni per Test
<ol><li>Aggiungere 10 mL di acqua in autoclave in 25 mL provette due campioni indipendenti 0,5 g per ogni campione di compost. Agitare le provette durante la notte.<ol>
<li>Etichettare le provette con numeri di esemplare unico e ogni membro della coppia come un (riferimento) o B (campione).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dopo 24 h, aggiungere 1,5 g di agar pianura a 90 mL di acqua distillata in mLconical due 125 boccette.</li>
	<li>Autoclave entrambi beute con agar e del campione di ogni coppia per 20 min con un'impostazione di scarico lento.</li>
	<li>Dopo l'autoclave, è possibile inserire le beute con agar in bagnomaria a 45 ° C fino a raggiungere equilibrio (circa 30 min). Non mettere qualsiasi fanghi di campione nel bagnomaria fino a quando si sarà raffreddata a 45 ° C.</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58767/58767fig2.jpg"> Figura 2: illustrazione del protocollo. Spine di r. solani sono collocate su piastre di Petri contenente Estratto di acqua di compost. Il diametro della crescita micelia è misurato dopo 1-2 giorni con l'aiuto di un microscopio stereo per migliorare la risoluzione e contrasto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58767/58767fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol start="5"><li>Versare l'impasto di compost A campione (riferimento in autoclave) agar fuso del matraccio agar A. Ricciolo di disperdere compost nell'agar.</li>
	<li>Versare l'impasto di compost B campione (campione vivente) agar fuso del matraccio agar B. Ricciolo di disperdere compost nell'agar.</li>
	<li>Versare il composto di ciascuna beuta in cinque Petri in plastica che sono 100 mm di diametro.</li>
	<li>Lasciare il pernottamento cool piastre così l'agar si indurisce.</li>
</ol>3. aggiungere la sfida di Rhizoctonia
<ol><li>Utilizzando una tecnica asettica, trasferire pezzi di uguali dimensioni di r. solani per ogni coppia di piastre di agar di campione (3-5 mm corkborer funziona bene per stabilire pezzi di dimensioni uguali). Prendete pezzi della Colonia dal margine esterno della Colonia per assicurare micelio attivamente sta crescendo. Nota: Lavorare in una cappa a flusso laminare o pulire giù un banco di laboratorio con candeggina o 70% etanolo al 10%.</li>
	<li>Incubare le piastre a temperatura ambiente per 1-2 giorni fino a quando la crescita di Colonia raggiunge circa a metà strada al bordo delle piastre A.</li>
</ol>4. misura r. solani crescita
<ol><li>Misurare il raggio del micelio in ogni piatto per la più vicina 1 mm con un righello trasparente piatto usando un microscopio stereo con illuminazione trasmessa. Nota: Illuminazione in campo scuro o obliquo renderà più facile da vedere e misurare le ife trasparente. A questo punto, zone di inibizione sarà visibile intorno ai frammenti di compost nella piastra B se il compost è soppressivo.</li>
	<li>Registrare il raggio a tre posti per piastra e calcolare una media dei tre a servire come misura rappresentativa.</li>
	<li>Sottrarre la media delle piastre B dalle piastre A. Se B &lt; un poi ci sono microbi nelle piastre di B che sono soppressive al r. solani patogeno.</li>
	<li>Dividere il raggio medio per il numero di giorni di sfida per esprimere unità della relativa soppressione come un tasso, micelio mm al giorno.</li>
</ol>

<ol><li>Gonzalez Garcia, G., Onco, M. A. P., Susan, V. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review.+Biology+and+systematics+of+the+form+genus+Rhizoctonia%5BTitle%5D)+AND+%22Spanish+Journal+of+Agricultural+Research%22%5BJournal%5D)">Review. Biology and systematics of the form genus Rhizoctonia.</a> Spanish Journal of Agricultural Research. 4 (1), 55-79 (2006).</li>
<li>Bonanomi, G., Antignani, V., Pane, C., Scala, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+soilborne+fungal+diseases+with+organic+amendments%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Suppression of soilborne fungal diseases with organic amendments.</a> Journal of Plant Pathology. 89, 311-324 (2007).</li>
<li>Noble, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risks+and+benefits+of+soil+amendment+with+composts+in+relation+to+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Australasian+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Risks and benefits of soil amendment with composts in relation to plant pathogens.</a> Australasian Plant Pathology. 40, 157-167 (2011).</li>
<li>Wichuk, K. M., McCartney, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Compost+stability+and+maturity+evaluation+-+a+literature+review%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Civil+Engineering%22%5BJournal%5D)">Compost stability and maturity evaluation - a literature review.</a> Canadian Journal of Civil Engineering. 37, 1505-1523 (2010).</li>
<li>Alfano, G., Lustrato, G., Lima, G., Vitullo, D., Ranalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+composted+olive+mill+wastes+to+predict+potential+plant+disease+suppressiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Control%22%5BJournal%5D)">Characterization of composted olive mill wastes to predict potential plant disease suppressiveness.</a> Biological Control. 3, 199-207 (2011).</li>
<li>Fang, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biological+indicators+of+compost-mediated+disease+suppression+against+the+soilborne+plant+pathogen+Rhizoctonia+solani%22">Biological indicators of compost-mediated disease suppression against the soilborne plant pathogen Rhizoctonia solani</a>. , University of Vermont. M.S. Thesis (2015).</li>
<li>Bonanomi, G., Antignani, V., Capodilupo, M., Scala, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+characteristics+of+organic+soil+amendments+that+suppress+soilborne+plant+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Soil+Biology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Identifying the characteristics of organic soil amendments that suppress soilborne plant diseases.</a> Soil Biology and Biochemistry. 42, 136-144 (2010).</li>
<li>Neher, D. A., Fang, L., Weicht, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ecoenzymes+as+indicators+of+compost+to+suppress+Rhizoctonia+solani%5BTitle%5D)+AND+%22Compost+Science+and+Utilization%22%5BJournal%5D)">Ecoenzymes as indicators of compost to suppress Rhizoctonia solani.</a> Compost Science and Utilization. 25 (4), 251-261 (2017).</li>
<li>American Type Culture Collection. ATCC® Mycology Culture Guide. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx">https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guides/Mycology_Guide.ashx</a> (2018).</li>
<li>Berns, A. E., Phillip, H., Narres, H. -D., Burauel, P., Vereecken, H., Tappe, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+gamma-sterilization+and+autoclaving+on+soil+organic+matter+structure+as+studied+by+solid+state+NMR%2C+UV+and+fluorescence+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Soil+Science%22%5BJournal%5D)">Effect of gamma-sterilization and autoclaving on soil organic matter structure as studied by solid state NMR, UV and fluorescence spectroscopy.</a> European Journal of Soil Science. 59, (2008).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Sappiamo da precedenti ricerche, che alcuni composti sono efficaci a sopprimere r. solani e che gli effetti soppressivi sono dovuto i microbi che vivono nel compost, non le proprietà abiotici di compost6,8. L'uso di autoclave come un mezzo per 'uccidere' microbiota è stata criticata perché interessa la chimica del carbonio di media10. Abbiamo confrontato l'uso di autoclave per filtrazione sotto vuoto tramite carta Whatman n. 1. Tr...

Rhizoctonia rappresenta un vasto complesso di funghi, di cui Donk Thanatephorus cucumeris (Frank) (anamorph = Rhizoctonia solani Kühn) è l'agente patogeno che causa marciume radicale e smorzamento-off1. Rhizoctonia solani è un agente patogeno aggressivo e un saprofita che può sopravvivere come sclerozi sotto condizioni ambientali1. Di conseguenza, ha una distribuzione globale e possono causare malattie su vasta gamma di ospiti della pianta tra cui Solanaceae, Fabaceae, Asteraceae e Brassicaceae causando gravi perdite economiche.
Compost ha la capacità di agenti di biocontrollo per determinati patogeni di pianta2del porto. Tuttavia, non tutti i composti sono uguali né colpiscono tutti gli agenti patogeni allo stesso modo3. Carbonio a base di legno ha lignina superiore ai rapporti di cellulosa di fieno o paglia-carbonio basata compost. R. solani preferisce prontamente disponibile carbonio trovato in paglia. Al contrario, funghi di controllo biologico, come Trichoderma spp., sono più efficaci quando il carbonio è meno prontamente disponibile. Benefici funghi e batteri in compost possono sopprimere la malattia delle piante attraverso la competizione, antagonismo o che regolano la crescita della pianta3. Il dosaggio proposto rileva principalmente antagonismo creato da produzione di antibiotici, ecoenzymes o chelanti che sono dannosi per l'agente patogeno.
Pianta le analisi biologiche sono un gold standard per determinare se il compost favorire o scoraggiare la crescita della pianta4. Tuttavia, le analisi biologiche pianta sono richiede molto tempo (settimane o mesi) per completare che può essere più di quanto desiderato e richiede più lavoro per estrarre piante con radici per quantificare la gravità degli apparati radicali. In modo paragonabile robusto, ma più veloce analisi (giorni) sarebbe l'ideale per i programmi di controllo di qualità. L'obiettivo di questa carta è di dimostrare un test relativamente rapido e accurato per predire soppressivo potenziale di compost. Il metodo è stato modellato dopo Alfano et al. 5 con due eccezioni, compost estratti sono stati diluiti e agar di acqua è stato usato al posto di agar di patata destrosio (PDA). R. solani cresce rapidamente su agarizzati di acqua semplice considerando che PDA promosso la crescita di batteri e altri funghi che hanno contaminato la cultura6.
Questa analisi del piatto serve come un indicatore di soppressione che si applica a una gamma di agenti patogeni della pianta che sopravvivere nel suolo come saprofiti, tra cui r. solani7, primi arruginisce Alternaria, Fusarium, Phytophthora putrefazione di radice e marciume radicale Pythium. L'analisi di concorrenza del piatto è utile per lo screening di una gamma di prodotti di compost per contenente la comunità di microbi che fungono da agenti di controllo biologico degli agenti patogeni del suolo. Il dosaggio è stato uno degli indicatori più coerenti della soppressione della malattia in compost commerciale prodotti6,8. I prodotti sono stati scelti per la loro variazione nella ricetta, la maturità e processo di produzione.

<table><tbody><tr><td>pallone conico in vetro a collo stretto autoclavabile</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-040D</td><td></td></tr><tr><td>Provette in vetro autoclavabili</td> da 125 ml <td>Fisher Scientific</td><td>14-925J</td><td>25 ml agar</td></tr><tr><td>granulato disidratato</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0145-17-0</td><td>500 g quantità</td></tr> guanti <tr><td>resistenti al calore</td><td>Fisher Scientific</td><td>MEMGG1314WL</td><td>diverse marche disponibili</td></tr><tr><td>Parafilm (strisce da 2-3 cm di larghezza)</td><td>Fisher Scientific</td><td>PM992 13-374-16</td><td>Piastre di Petri monouso in polistirene da 5 o 10 cm</td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>R80116</td><td>è disponibile in buste da 20/ea o in confezioni da 500</td></tr><tr><td>agar destrosio di patate disidratato</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0013-15-8</td><td>è disponibile in quantità da 100, 500 e 2000 grammi</td></tr><tr><td>Shaker reciproco da banco</td><td>Thomas Scientific</td><td>1227Y31</td><td>altri modelli funzioneranno</td></tr><tr><td>a bagnomaria</td><td>ThermoScientific</td><td>S37363</td><td>5L</td></tr><tr><td>righello trasparente per uso generale, piatto, almeno 10 cm</td><td>Qualsiasi</td><td></td><td>uso regola metrica</td></tr><tr><td>ATCC cultura</td><td>Tipo americano Collezione di colture</td><td>ATCC 10154</td><td>teleomorfo Thanatephorus cucumeris (Frank) (ATCC 10154) o MYA 4031;</td></tr><tr><td>nastro da laboratorio</td><td>Fisher Scientific</td><td>15935</td><td>autoclavabile e rimovibile, 1" di larghezza preferito</td></tr><tr><td>marcatore resistente all'acqua</td><td>ufficio o fornitura scientifica</td><td>Sharpie punta fine</td><td>scrivere il numero del campione su nastro</td></tr></tbody></table>

un test di competizione di piatto come una rapida valutazione preliminare di soppressione di malattia

A Plate Competition Assay As a Quick Preliminary Assessment of Disease Suppression

L'obiettivo era quello di sviluppare e ottimizzare analisi biologica un semplice, conveniente ed efficace per rilevare capacità soppressive di malattia di un compost specifico contro terricole fungo Rhizoctonia solani. R. solani è un agente patogeno di una vasta gamma di ospiti della pianta in tutto il mondo. Il fungo sopravvive in terreni come un saprofito e cresce rapidamente su agarizzati di semplice acqua. L'analisi del piatto è un metodo rapido per confrontare il compost per la loro capacità di rallentare la crescita di r. solani. L'analisi inoltre correla bene con soppressione di altri patogeni fungini terricole che sopravvivono come saprofiti nel suolo come primi arruginisce Alternaria, Fusarium, Phytophthora putrefazione di radice e marciume radicale Pythium.

Composto finito dovrebbe essere stabile e maturo, due termini che vengono spesso utilizzati in modo intercambiabile, quindi può essere confezionato e trasportato in modo sicuro e non causa effetti negativi durante il suo utilizzo finale4. Stabilità è una resistenza alla decomposizione e viene in genere determinato utilizzando gli indici di attività microbica. Misure generali di respirazione microbica possono misurare la stabilità di compost ma non necessar...

Un protocollo per l'analisi di un concorso di piastra identificare se un compost specifico è probabile contenere batteri e funghi che sopprimono la crescita di Rhizoctonia solaniè presentato.

Un test di competizione di piatto come una rapida valutazione preliminare di soppressione di malattia

The goal was to develop and optimize a simple, affordable, and effective bioassay to detect disease suppressive ability of a specific compost against ...

Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande chiave relative al controllo biologico degli agenti patogeni delle piante trasportate dal suolo. Il gold standard per testare materiali come il compost è quello di avere un saggio biologico vegetale per testare se è tossico per le piante. Tuttavia, ci vogliono tre settimane.Questo metodo può essere eseguito in circa due o tre giorni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice, conveniente ed efficace. Questo saggio è un rapido screening di compost specifico per sopprimere la crescita di Rhizoctonia solani.Tuttavia, questo saggio può anche essere usato contro altri patogeni vegetali nati sul suolo, come Fusarium, Pythiums e Phytophthoras. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché si cura di isolare e mantenere una cultura pura di un fungo evitando la contaminazione. A dimostrare la procedura di isolamento sarà Taylor Readyhough, una studentessa laureata del mio laboratorio.Emma Wright, una studentessa universitaria del mio laboratorio, dimostrerà il saggio del concorso. Per cominciare, seminare semi di ravanello rosso nel terreno noto per avere una storia di malattia causata da R.solani. Dopo tre o quattro settimane, rimuovere le piantine dal terreno e sciacquarle con acqua del rubinetto.Usando una lama di rasoio, tagliare segmenti di un centimetro dell'ipocotile e della radice che hanno un colore marrone. Quindi, utilizzare le forcep sterilizzate a fiamma per immergere i segmenti in una soluzione di candeggina al 10% per un minuto. Dopo questo, sciacquare i segmenti in acqua sterile.Quindi, utilizzare le forcep sterilizzate a fiamma per trasferire i segmenti su un tovagliolo di carta. Asciugare i segmenti e trasferirli in una piastra di Petri con agar d'acqua. Posizionare la piastra di Petri all'interno di un contenitore con un coperchio e incubare i segmenti a temperatura ambiente.Per stabilire una cultura figlia, trasferisci uno dei segmenti al centro di un piatto fresco di agar destrosio di patate. Successivamente, autoclave provette da 25 millilitri contenenti 10 millilitri di acqua. Aggiungere due campioni da 0,5 grammi di ciascun campione di prova a un paio di provette autoclavate con 10 millilitri di acqua sterile e scuotere le provette durante la notte.Dopo 24 ore, aggiungere 1,5 grammi di agar semplice e 90 millilitri di acqua distillata a un paio di fiasche coniche. Dopo aver autoclavato i contenitori, posizionarli in un bagno d'acqua Celsius di 45 gradi per 30 minuti. Quindi, versare il campione di riferimento autoclavato e il campione vivente nell'agar fuso.Versare le miscele da ogni pallone in cinque piastre di Petri. Per proteggere i microbi indigeni, è importante non aggiungere il compost mentre l'agar è troppo caldo. Pertanto, lasciare raffreddare l'agar a 45 gradi Celsius prima di aggiungere il compost.Usando la tecnica aseptica, trasferire pezzi di R.solani ad ogni coppia di piastre campione. Quindi, incubare le piastre a temperatura ambiente per uno o due giorni. Infine, utilizzare un righello chiaro e piatto e un microscopio stereo per misurare il raggio del micelio in ogni piastra al millimetro più vicino.In questo protocollo, gli estratti di compost viventi hanno soppresso la crescita di R.solani significativamente più dei campioni autoclavati, dimostrando che l'effetto era microbico e non a base di nutrienti. La soppressività è misurata come una riduzione della crescita rispetto al controllo autoclavato. La crescita non è stata influenzata dalla durata di maturazione o polimerizzazione del compost.La crescita è stata significativamente influenzata dal metodo del compost e dagli ingredienti delle ricette, in particolare con vermicompost, processi di windrow e ricette con corteccia di legno duro. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica può essere un candidato per la certificazione commerciale del compost per le proprietà soppressive della malattia.

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