Terapia genica ispirato Polycation rivestimento per la protezione di nanostrutture di DNA Origami

La stabilizzazione biologica delle nanostrutture del DNA è essenziale per le future applicazioni in vivo, come la somministrazione mirata di farmaci. Tuttavia, il DNA viene degradato nel corpo da vari enzimi. Qui presentiamo una tecnica di rivestimento che protegge le nanostrutture di DNA dalla degradazione enzimatica.

I principali vantaggi sono che il nostro rivestimento comprende composti non tossici che sono già utilizzati negli organismi viventi e che la funzionalizzazione della superficie rimane possibile. Questa funzionalizzazione è importante per incorporare sensori molecolari per il riconoscimento del bersaglio e interruttori per il rilascio del carico di droga. I rivestimenti di policatione aumentano significativamente l'assorbimento cellulare delle strutture di origami di DNA incapsulate, quindi questo metodo può aprire la porta per le applicazioni degli origami di DNA nella diagnostica e nella terapia.

L'assorbimento cellulare è richiesto anche per potenziali applicazioni di somministrazione genica della nanotecnologia del DNA. Ritengo che il metodo sia abbastanza semplice e possa essere facilmente padroneggiato. Per iniziare, misurare la concentrazione di origami di DNA purificati.

Utilizzare due microlitri di tampone TB come vuoto per calibrare lo spettrofotometro ultravioletto. E poi misurare la concentrazione di origami di DNA a 260 nanometri. Quindi calcolare le quantità di fosfati nella soluzione di origami del DNA purificato, usando la formula due, come descritto nel manoscritto.

Preparare 15 microlitri della struttura degli origami di DNA includendo un nanomolo di fosfato, utilizzando il tampone tb per la diluizione. Aggiungere 13,2 microlitri a TB a 1,8 microlitri di chitosano. E aggiungere 15 microlitri della soluzione chitosana a 15 microlitri degli origami di DNA per sviluppare un poliplex chitosano di origami di DNA con un rapporto N/P di otto.

Continuare a preparare polilessi di diversi rapporti N/P, utilizzando calcoli come descritto nel manoscritto. Preparare 80 millimetri di tubo per il gel di agarosio al 2%. Aggiungere 352 microlitri di cloruro di magnesio molare 2.5 e quindi pre-macchiarlo con 10 microlitri di macchia di gel di DNA.

Versare la soluzione di gel in una scatola di gel asciutta. Inserire un pettine per elettroforesi in gel e lasciarlo solidificare a temperatura ambiente per 15-30 minuti. Nel frattempo integrare il tampone di corsa con cloruro di magnesio millimolare da 11 millimolare.

Mescolare da 10 a 20 microlitri di ciascun campione con il 20% del buffer di caricamento 6X. Caricare i campioni nei pozzi di gel di agarosio, incluso un origami di DNA nudo come controllo. Far funzionare il gel a 70 volt a temperatura ambiente per due ore e mezza o tre ore.

Quindi utilizzare uno scanner UV per visualizzare il gel. Per eseguire un test di protezione della DNasi I, aggiungere quattro microlitri di ogni poliplex rispetto a diversi rapporti N/P, 1,5 microlitri di tampone 10X DNasi I, 8 microlitri di TB e 1,5 microlitri di DNasi I a un tubo PCR separato da 2 millilitri. Quindi incubare lo stesso a 37 gradi Celsius in un termociclo per 24 ore.

Per digerire la DNasi I, aggiungere due microlitri da 20 milligrammi per millilitri proteinasi K e incubare per 30 minuti a 37 gradi celsius in un termociclo. Quindi, per svelare le nanostrutture del DNA di base aggiungere 3,6 microlitri da 50 milligrammi per millilitro 40 kilodalton di solfato di dextran. Quindi utilizzare questi campioni e origami di DNA fresco come controllo per eseguire l'elettroforesi del gel di agarosio come descritto in precedenza.

Asportare la banda corrispondente ai campioni caricati dal gel. Per estrarre gli origami di DNA, utilizzare una colonna di estrazione del congelamento della compressione e seguire le istruzioni del produttore e continuare con l'imaging di microscopia elettronica a trasmissione della macchia negativa come descritto nel manoscritto. Mescolare 6,5 microlitri di 36 nanomolari HRP-NR purificati con 6,5 microlitri di policazioni di varie concentrazioni.

Per preparare un poliplex con rapporti N/P di uno, due, quattro, 10 e 20, preparare un gruppo vuoto mescolando 6,5 microlitri di acqua distillata con 6,5 microlitri di policationi di varie concentrazioni corrispondenti ai rapporti N/P di uno, due, quattro, 10 e 20. Quindi aggiungere 12,5 microlitri di ciascuna di queste soluzioni preparate a un pozzo separato di una piastra di 96 poggi. Quindi aggiungere 72,5 microlitri di tampone HEPES ad ogni pozzo e mescolare.

Aggiungere 10 microlitri di 15 millimolare ABTS e quindi 5 microlitri di un perossido di idrogeno millimolare da 12 millimolare ad ogni pozzo e mescolare tubazione su e giù. Infine, utilizzare un lettore di piastre multimodale per misurare l'assorbanza a 421 nanometri in quattro ore. Dopo aver analizzato i polilessi usando un saggio di ritardo del gel, ci fu uno spostamento della nanostruttura nuda verso il catodo, probabilmente a causa del controbilanciamento della carica negativa dei gruppi fosfati al momento del legame con i policationi, e dell'aumento delle dimensioni del complesso.

Quando è stata aggiunta una quantità extra di polianioni, come il solfato di dextran, la formazione di poliplex è stata invertita. Il solfato di Dextran con un peso molecolare più elevato si è dimostrato più efficiente rispetto al minor peso molecolare. Dopo aver analizzato i poliplex usando la microscopia elettronica a trasmissione della macchia negativa, le micrografie hanno mostrato nanostrutture di origami di DNA nudi, polilessi lineari di polietilenimina dopo decapsulazione, poliplex chitosani, immagini di origami di DNA nudi e protetti sottoposti a esaurimento di magnesio, degradazione enzimatica e digestione del siero.

In presenza di DNasi I, dopo due ore, le nanostrutture nude sono state completamente digerite, mentre i polilessi lineari in polietilenimina degli origami di DNA incapsulati di chitosano sono rimasti intatti in presenza di 10 unità per millilitro DNasi I.I polietilenimina lineare i polilessi proteggono le nanostrutture del DNA in modo più efficiente rispetto al chitosano. Quando il rapporto N/P del poliplex è aumentato, la digestione del DNA era inferiore. Dopo l'enzima di rivestimento, o dopo origami di DNA più funzionalizzati, con poli plessi lineari di polietilenimina e chitosano a varianti rapporti N/P, non è stata osservata alcuna interferenza notevole con l'attività enzimatica.

D'altra parte, la cinetica dell'enzima HRP è cambiata radicalmente dopo il legame con gli origami del DNA. È importante iniziare con strutture origami di DNA ben purificate. Esiste un filamento più stabile che può anche legarsi alle policazioni.

Sono difficili da separare dai poliplex di origami del DNA. Le nostre molecole di rivestimento sono utilizzate anche in applicazioni di terapia genica. Ciò significa che le nanostrutture del DNA possono essere utilizzate in futuro per alterare il genoma degli organismi viventi.

Per la colorazione del gel di agarosio, di solito vengono utilizzate molecole che intercalano il DNA e sono potenzialmente mutagene. Si prega di seguire le istruzioni di sicurezza del laboratorio quando si macchia il DNA.