Name: Terapia genica ispirato Polycation rivestimento per la protezione di nanostrutture di DNA Origami (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Scopri una tecnica di rivestimento con policazioni per proteggere le nanostrutture DNA origami dalla degradazione enzimatica. Il metodo utilizza chitosano e LPEI per migliorare l'uptake cellulare e le applicazioni diagnostiche.

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Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dal programma di ricerca e innovazione di Horizon 2020 dell'Unione europea sotto la concessione contratto n. 686647. Immagini TEM sono state registrate su un Morgagni operati a 80 kV presso l'impianto di EM di Vienna Biocenter Core strutture GmbH (VBCF). Vorremmo ringraziare Tadija Kekic per assistenza nella progettazione grafica ed Elisa De LIano per progettare la nanostruttura wireframe.

1. preparazione di soluzione Stock Polycation
<ol><li>Soluzione di riserva LPEI<ol>
<li>Aggiungere 10 mg di LPEI in un becher di vetro contenente &lt; 10 mL di H2O.</li>
		<li>Per dissolvere completamente LPEI, aggiungere HCl (32%) fino a raggiungere pH 2.0.</li>
		<li>Regolare il pH a 7.0 con l'aggiunta di NaOH (10 M).</li>
		<li>Regolare il volume per la concentrazione finale di 1 mg/mL.</li>
		<li>Filtrare la soluzione di riserva di LPEI attraverso una membrana da 0,22 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Soluzione di riserva di chitosano<ol>
<li>Sciogliere 16,6 mg di lattato di chitosano oligosaccaride (Mw ~ 5 kDa, 60% oligosaccaride composizione, viene desacetilato agli acidi da chitina del 90%) in 1 mL di acido acetico (10%) mezzi acquosi per preparare una soluzione di riserva con una concentrazione di 10 mg/mL.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. purificazione di nanostrutture di DNA Origami
<ol><li>Mix 100 µ l del campione del DNA origami (in tampone di 5 mM Tris, 1 mM EDTA, 5 mM NaCl (indicata come TB) tra cui 18 mM MgCl2) con il volume equivalente di 22 mM MgCl2 completato TB (100 µ l) in una provetta da 1,5 mL.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l di tampone di purificazione (15% (p/v) 8.000 PEG, 5 mM Tris, 1 mM EDTA e 505 mM NaCl). Mescolare delicatamente dall'inversione del tubo.</li>
	<li>Girare il campione a 16.000 × g a temperatura ambiente (r.t.) per 25 min.</li>
	<li>Scartare il surnatante con attenzione e risospendere il pellet in buffer di 16 mM MgCl2 completato TB. Il surnatante e il pellet contengono fili graffette in eccesso e precipitato DNA origami, rispettivamente.</li>
	<li>Incubare il campione per un giorno a t.a. a 650 giri/min in un thermomixer. Questo passaggio è per completa risospensione di origami di DNA.</li>
</ol>3. elettroforesi su Gel di agarosio al (età)
<ol><li>Aggiungere 1,6 g di agarosio e 80 mL di buffer di x TAE 0,5 (20 mM Tris, 0,5 mM EDTA, acido acetico 10 mM, pH 8) in un becher di vetro per preparare un gel di agarosio al 2%. Forno a microonde per 5 min, agitare il contenuto del becher per 1 min in un bagno d'acqua. µ L 352 di MgCl2 (2,5 M) per preparare il gel con 11 mM MgCl2. Pre-macchia il gel con 10 µ l di macchia gel del DNA.</li>
	<li>Versare la soluzione di gel in una scatola di gel secco e inserire un pettine di elettroforesi del gel. Lasciare solidificare a t.a. per 15-30 min.</li>
	<li>Integrare il buffer in esecuzione (0,5 x tampone TAE) con 11 mM MgCl2.</li>
	<li>Miscelare 10-20 µ l del campione con 20% di 6 x tampone di caricamento (30% (v/v) glicerolo, blu di bromofenolo 0,25% (p/v), 0,25% (p/v) xilene cianolo FF) e caricarlo nei pozzetti del gel dell'agarosi.</li>
	<li>Esegua il gel a 70 V a t.a. per 2.5 - 3 h.</li>
	<li>Visualizzare il gel con uno scanner di UV.</li>
</ol>4. negativo macchia microscopia elettronica di trasmissione (nsTEM)
<ol><li>Applicare 5 µ l di nanostruttura diluita o il polyplex su una griglia di Scarica a bagliore di TEM Cu400 rivestita di carbonio. Lasciate assorbire per ca. 1 min.</li>
	<li>Scolare il liquido in eccesso dal bordo della griglia di un pezzo di carta da filtro.</li>
	<li>Applicare 5 µ l di soluzione acquosa dell'acetato di uranile 2% e attendere per 1 min.</li>
	<li>Utilizzare il bordo di carta da filtro per svuotare completamente il liquido in eccesso dal bordo della griglia.</li>
	<li>Lasciare asciugare completamente prima di iniettare il TEM la griglia.</li>
</ol>5. Polyplex formazione
Nota: Esempio illustrativo per la preparazione di un polyplex composto da DNA origami e chitosano a rapporti N/P 0.01-8.
<ol><li>Calcolare il numero delle ammine a polycation utilizzando la formula-1 (tabella 1).</li>
	<li>Misurare la concentrazione di origami di DNA purificato utilizzando uno spettrofotometro ultra violetto a 260 nm. Utilizzare 2 µ l di tampone di TB come il vuoto per tarare la macchina. Calcolare il "nmol di fosfato" utilizzando la formula-2.</li>
	<li>Preparare 15 µ l della struttura di origami del DNA compreso 1 nmol di fosfato.</li>
	<li>Utilizzare formula-3 per calcolare il volume del chitosano, che è necessaria per preparare il polyplex presso N/P 0.01-8. Ad esempio, per preparare il polyplex a 8 N/P, è necessaria la 1,8 µ l del chitosano (0,8 mg/mL) (N/P è 8, nmol di fosfato è 1, peso molecolare di chitosano è 5.000 g/mol, concentrazione della soluzione di riserva di chitosano è 0,8 mg/mL e il numero delle ammine per chitosano è 28). Aggiungere 13,2 µ l di TB a 1,8 µ l di chitosano (0,8 mg/mL). Aggiungere 15 µ l di soluzione di chitosano (0,8 mg/mL) a 15 µ l di DNA origami dal punto 5.3 per ottenere un DNA origami-chitosano polyplex con NP 8. Il polyplex è formata spontaneamente.</li>
	<li>Ripetere il passaggio 5.4 per preparare polyplexes a diversi rapporti di N/P.</li>
	<li>Eseguire un'età come descritto nel passaggio 3 (Figura 1A). Includere l'origami di DNA nudo come controllo.</li>
	<li>Immagine il polyplex come descritto nel passaggio 4 (Figura 2). Formula-1) numero di gruppi amminici a polycation <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq1.jpg"> Formula-2) mole di fosfato =<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq2.jpg"> Formula-3) Volume (µ l) di policationi =<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq3.jpg">
</li>
</ol>6. decapsulation con Destrano solfato
<ol><li>Calcolare il numero di gruppi solfato al solfato di destrano utilizzando la formula-4 (tabella 2).</li>
	<li>Calcolare il volume di Destrano solfato necessario per il decomplexation di polyplex presso un predefiniti A / rapporto P utilizzando formula-5. L'A / P carica rapporto è il rapporto tra i gruppi di solfato di polyanion (A) per i gruppi fosfato (P) del origami del DNA. Una quantità eccedente di Destrano solfato è necessaria per un efficiente decomplexation della polyplexes (ad es. 500-1.000). Ad esempio, per decomplex il polyplex preparato nella sezione 5 (polyplex contiene 1 nmol di fosfato) presso A / P 1.000, 3,6 µ l di Destrano solfato 40 kDa (50 mg/mL) è necessario (A / P è 1.000, nmol di fosfato è 1, il peso molecolare del solfato di destrano è 40.000 g/mol la concentrazione della soluzione stock di Destrano solfato è 50 mg/mL e numero di solfato è 220). Aggiungere 3,6 µ l di solfato di destrano (50 mg/mL) per il polyplex dal punto 5.4 e mescolare bene.</li>
	<li>Se si lavora con un polyplex chitosano, aggiungere NaOH per facilitare il processo di decomplexation. Aggiungere NaOH per una concentrazione finale di 10 mM. Saltare questo passaggio per LPEI polyplexes.</li>
	<li>Eseguire un'età come descritto nel passaggio 3 (Figura 1B). Includere un origami di DNA nudo e polyplex come controllo. Formula-4) numero di gruppi solfato per polyanion = <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq4.jpg"> Formula-5) Volume (µ l) di solfato di destrano =<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/58771/58771eq5.jpg">
</li>
</ol>7. stabilità verso svuotamento di Mg
<ol><li>Lavare 20 µ l di un origami di DNA o il corrispondente polyplex (tra cui 2 nmol fosfato) con 4 x 600 µ l di tampone di Mg da zero (5 mM Tris, 1 mM EDTA e 30 mM NaCl) utilizzando la colonna di ultrafiltrazione (MWCO ~ 3 kDa). Girare ogni lavaggio a 14.000 × g a r.t. per 3-5 min.</li>
	<li>Raccogliere la soluzione rimanente (80 µ l) e incubare a 37 ° C per un giorno a 650 giri/min in un thermomixer.</li>
	<li>Se il test LPEI polyplex, aggiungere 2,5 µ l di MgCl2 (500 mM) per una concentrazione finale di 16 mM MgCl2. Quindi, aggiungere 7 µ l di Destrano solfato-40 kDa (50 mg/mL) (equivalente alla A / P 1.000) per svelare il nucleo nanostrutture di DNA (decapsulamento, vedere passaggio 6). Nota: Ignorare questo passaggio se lavora con chitosano polyplex o origami di DNA nudo.</li>
	<li>Seguire nsTEM imaging come descritto nel passaggio 3 (Figura 2).</li>
</ol>8. dnasi I test di titolazione di nanostrutture di DNA nudo Origami
<ol><li>Mix 3 µ l di origami di DNA nudo compresa 1 nmol fosfato con 2 µ l di 10x dnasi buffer (100 mM Tris-HCl, 25 mM MgCl2, 5mm CaCl2, pH 7.6), 1 µ l di MgCl2 (250 mM), 12 µ l di acqua a 0,2 mL PCR provette. Aggiungere 2 µ l di dnasi I (x 10). Regolare la concentrazione d'archivio La dnasi ho (x 10) per ottenere il finale dnasi concentrazioni di 0.25-2 U/mL.</li>
	<li>Incubare i campioni a 37 ° C per 1-2 h in un termociclatore.</li>
	<li>Immergere i campioni in ghiaccio e disattivare l'attività nucleolitico aggiungendo 2 µ l di 500 mM dithiothreitol (DTT) e 2,5 µ l di EGTA (33 mM).</li>
	<li>Analizzare i campioni utilizzando un'età come descritto nel passaggio 3.</li>
</ol>9. stabilità di Polyplexes verso dnasi I
<ol><li>Mix 4 µ l di una polyplex (tra cui 1 nmol di fosfato, preparato a diversi rapporti di N/P) con 1,5 µ l di una dnasi buffer (10x), 8 µ l di TB e 1,5 µ l di dnasi I (100 U/mL) a un 0,2 mL PCR tube.</li>
	<li>Incubare il campione per 24 h a 37 ° C in un termociclatore.</li>
	<li>Aggiungere 2 µ l di proteinasi K (20 mg/mL) per digerire la dnasi I. Incubare per 30 min a 37 ° C in un termociclatore. Nota: invece di digestione enzimatica, disattivazione chimica della dnasi I da aggiungendo 1,5 µ l di DTT (500 mM) e 2 µ l di EGTA (33 mM) posso essere eseguito.</li>
	<li>3,6 µ l di Destrano solfato-40 kDa (50 mg/mL) (equivalente alla A / P 1.000) per svelare il nucleo nanostrutture di DNA.</li>
	<li>Eseguire età come descritto nel passaggio 3 (Figura 3A, Figura 3). Includono gli origami di DNA fresco come controllo per misurare e comparare le intensità di banda sul gel.</li>
	<li>Asportare la band l'età e l'Estratto di congelare l'origami di DNA da una compressione colonna di estrazione basata sul protocollo fornito dal fornitore.</li>
	<li>Seguire nsTEM imaging come descritto nel passaggio 4 (Figura 2).</li>
</ol>10. stabilità verso siero bovino fetale (FBS)
<ol><li>Mix 4 µ l di origami di DNA nudo o sua polyplex corrispondente (tra cui 1 nmol di fosfato) con 17 µ l di TB + 10% FBS in 0,2 mL PCR provette. Utilizzare FBS appena scongelati.</li>
	<li>Incubare il campione a 37 ˚ c in un termociclatore per 24 h.</li>
	<li>Immergere il campione in un bagno di ghiaccio.</li>
	<li>Se il test il polyplex, eseguire il processo di decapsulamento aggiungendo 3,6 µ l di Destrano solfato-40 kDa (50 mg/mL). Inoltre, è possibile aggiungere NaOH se lavora con chitosano polyplexes (Vedi punto 6.3)</li>
	<li>Eseguire un'età come descritto nel passaggio 3. Includere l'origami del DNA fresco come controllo per misurare e comparare le intensità di banda sul gel.</li>
	<li>Asportare la band sull'età e per estrarre l'origami di DNA da una colonna di estrazione del freeze di squeeze.</li>
	<li>Aggiungere 2 µ l di proteinasi K (20 mg/mL) per la soluzione di origami del DNA estratta (20 µ l) in una provetta PCR da 0,2 mL. Incubare per 30 min a 37 ° C in un termociclatore per digerire le proteine del siero associati a nanostrutture.</li>
	<li>Lavare il campione con 5 x 500 µ l di TB tra cui 16 mM MgCl2 utilizzando la colonna di ultracentrifugazione (MWCO ~ 100 kDa) per lavare proteinasi K (MW ~ 28,9 kDa) distanza. Girare ogni lavaggio a 14.000 × g a r.t. per 3-5 min.</li>
	<li>Eseguire nsTEM imaging come descritto nel passaggio 4 (Figura 3). Nota: Il campione di gel estratto dal passaggio 10.6 potrebbe essere direttamente usato per formazione immagine di nsTEM. Tuttavia, l'imaging potrebbe essere molto impegnativo per l'attaccamento delle proteine del siero per le nanostrutture di DNA origami. Pertanto, trattamento di proteinasi K (passaggi 10,7-10.9) è consigliato per facilitare il processo di imaging.</li>
</ol>11. test l'indirizzabilità della perossidasi di rafano (HRP)-funzionalizzati DNA Origami su rivestimento con policationi
<ol><li>Purificare l'auto-assemblato biotinylated-NR (biotina-NR) come descritto nel passaggio 2.</li>
	<li>Incubare 200 µ l di biotina-NR purificato (36 nM, in 16 mM integrato buffer di TB) con 200 µ l di coniugato HRP streptavidina (540 nM, nel buffer di TB). Aggiungere 4,8 µ l di MgCl2 (500 mM) ad una concentrazione finale di 14 mM. Incubare a r.t. per 12 h a 650 giri/min in un thermomixer</li>
	<li>Purificare il HRP-funzionalizzate NR (HRP-NR) di un metodo di purificazione di PEG (come descritto nel passaggio 2) per rimuovere gli enzimi HRP non associati. Risospendere il precipitato HRP-NR in TB tra cui 16 mM MgCl2.</li>
	<li>µ L di mix 6.5 di purificato HRP-NR (36 nM) con 6,5 µ l di policationi delle concentrazioni varianti per preparare la polyplex rapporti N/P 1, 2, 4, 10 e 20 (utilizzando la formula 3).</li>
	<li>Ripetere i passaggi da 11,2-11,4 per non-biotinylated NR. Poiché l'enzima HRP può legarsi non specifico per il DNA origami, l'origami di DNA di non-biotinylated, che viene trattato con enzimi HRP e PEG purificato (simile a biotina-NR), servirà come il controllo con il test.</li>
	<li>Mix 6.5 µ l di acqua distillata con 6,5 µ l di policationi della variante concentrazioni corrispondenti ai rapporti definiti N/P 1, 2, 4, 10 e 20. Esempi di tesi servono come il gruppo vuoto.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione preparata nei passaggi 11.4-11,6 (12,5 µ l) di una piastra a 96 pozzetti inclusi 72,5 µ l di tampone HEPES (25mm HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, pH di 0.05% Triton X-100, 1% DMSO, 7.4) e mescolare bene.</li>
	<li>Aggiungere 10 µ l di 2, 2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) (ABTS) (15 mM).</li>
	<li>Aggiungere 5 µ l di H2O2 (12 mM) e miscelare bene pipettando su e giù. H2O2 avvia la reazione.</li>
	<li>Misurare l'assorbanza a 421 nm oltre 4 h con un lettore multimodale (Figura 4A).</li>
</ol>12. prova l'indirizzabilità di Emina-associazione aptameri (HBA)-funzionalizzati DNA Origami su rivestimento con policationi
<ol><li>Purificare l'HBA funzionalizzati-NR (HBA-NR) come descritto nel passaggio 2. Risospendere il precipitato HBA-NR in TB completati con 6 mM MgCl2 (maggiore concentrazione di sale conduce all'aggregazione di HBA-NR).</li>
	<li>Miscelare 10 µ l di HBA-NR (40 nM) con 10 µ l di policationi a varia concentrazione per preparare polyplex definiti rapporti N/P 1, 2, 10 e 20.</li>
	<li>Miscelare 10 µ l di nudo-NR (40 nM) o acqua distillata con 10 µ l di policationi alle concentrazioni variabili corrispondenti ai rapporti N/P 1, 2, 10 e 20.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione di 20 µ l preparati da passaggi 12.2 e 12.3 alla piastra 96 pozzetti compreso 60 µ l di tampone HEPES (25mm HEPES, 20 mM KCl, 200 mM NaCl, pH di 0.05% Triton X-100, 1% DMSO, 7.4) e mescolare bene. Includere almeno un campione in bianco sostituendo i 20 µ l di soluzione di polyplex o polycation (da passaggi 12.2 e 12.3) con acqua.</li>
	<li>Aggiungere 5 µ l di Emina (0,04 mM) seguita da 10 µ l di Mirkotorre (15 mM). Collocare la piastra su un agitatore orbitale per 5 min.</li>
	<li>Aggiungere 5 µ l di H2O2 (12 mM) e miscelare bene pipettando su e giù.</li>
	<li>Misurare l'assorbanza a 421 nmover 30 min con il lettore di piastra multimodale (Figura 4B).</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse relazionati alla presente relazione.

Nell'auto-assemblaggio di origami di DNA, i fili dei punti metallici in genere vengono aggiunti nel rapporto in eccesso di 5-10 al patibolo. Questi filamenti fiocco in eccesso anche associare alla polyplexes polycation e forma nell'intervallo manometro che più ulteriormente sono difficili da essere separato dal DNA origami polyplexes. Quindi, un punto critico nella formazione polyplex è quello di rimuovere i fili graffetta in eccesso e utilizzare ben purificata nanostrutture di DNA origami.
Altri metodi sono stati sviluppati per la stabilizzazione di nanostrutture di DNA come la ciclizzazione di filamenti di DNA tramite un clic reazione26. Come alchini - e azide-modificato fiocco fili sono richiesti per la formazione di anelli ad incastro a singolo filamento, questa tecnica è limitata per la stabilizzazione delle nanostrutture piccolo tale un catenano di DNA, e non è facilmente scalabile per grandi origami di DNA struttura, ad esempio quelli utilizzati in questo protocollo. Recentemente, Gerling et unl.27 ha riferito un metodo per la creazione di ciclobutene covalente della pirimidina dimero (CPD) legami tra vicini thymidines all'interno di nanostrutture di DNA mediante irradiazione ultravioletta. Anche se questo metodo è sito-selettivo e scalabile, la sua efficienza nella protezione origami di DNA è molto inferiore a polycation rivestimento. Ad esempio, gli oggetti di origami del DNA CPD-stabilizzato sopportare solo 0,4 U/mL dnasi I per 1 h, mentre polyplexes erano stabili in presenza di 10 U/mL dnasi I per almeno un giorno.
In breve, terapia genica ispirato chitosano e rivestimento LPEI è un basso costo, One-Step e l'efficiente metodo per affrontare la stabilità a lungo termine di nanostrutture di DNA origami in Mg-vuotati e nucleasi-rich media. La reversibilità della formazione polyplex facilita la sua applicazione in multi-step test diagnostici dove la protezione di origami di DNA contro nucleolitico degradazione o sale-svuotamento è cruciale in un unico passaggio ma potrebbe causare problemi in altri passaggi, quali DNA amplificazione. Inoltre, il rivestimento polycation è un potenziale approccio per migliorare l'assorbimento cellulare di nanostrutture di DNA origami per droga consegna applicazioni28.

Il DNA è un elemento versatile per l'auto-assemblaggio di nanoscala strutture1programmabile. Il metodo più popolare per la creazione di nanostrutture di DNA è la tecnica di origami del DNA, che si basa sull'auto-assemblaggio di un DNA circolare lungo, singolo filamento impalcatura con l'aiuto di centinaia di fiocco sintetico forma-determinazione più breve fili2. Oggi, la creazione di nanostrutture di DNA in quasi qualsiasi geometria e morfologia è facilmente fattibile. Nanostrutture di DNA possono essere site-specifically funzionalizzati con alta precisione3,4 e può essere programmato per sottoporsi a cambiamenti conformazionali allosterico5,6. Quindi, utilizzando il DNA come materiale da costruzione offre l'opportunità unica di creare programmabile e reattivo nanostrutture progettate per applicazioni in biosensori, la diagnostica e la consegna della droga. Tuttavia, nanostrutture di DNA sono suscettibili di digestione di exo- ed endo-nucleasi e basato su reticolo 3D nanostrutture di DNA origami generalmente richiedono elevata salinità buffer (ad es., mM 5-20 Mg+ 2) per mantenere la loro l'integrità7,8.
La rapida degradazione del DNA dall'azione delle nucleasi presente nel sangue e la matrice extracellulare è un grave ostacolo per la consegna efficiente in vivo dei prodotti genetici nelle cellule9. Per superare questa limitazione, in genico non virale, DNA è mescolato con un polimero cationico definiti N/P carica (rapporto delle ammine in polycation per i fosfati nel DNA)10. Il complesso del DNA con un polimero cationico, noto come polyplex, protegge il DNA da degradazione nucleasi-mediata e migliora il suo assorbimento cellulare11. Ispira gli avanzamenti di consegna del gene, oligolysine12, oligolysine-polietilene glicole (spina) copolimeri13, poli (2-dimethylamino-ethylmethacrylate) (PDMAEMA)-basato su polimeri14e virus del capsid proteine15 sono stati utilizzati per la stabilizzazione di nanostrutture di DNA origami.
Recentemente, abbiamo segnalato un metodo per la protezione di nanostrutture di DNA origami in Mg-vuotati e nucleasi-rich media utilizzando il chitosano naturale polisaccaride cationico e il polyethyleneimine lineare sintetica (LPEI) è stato segnalato16. Questo articolo è un adattamento dei nostri lavori precedenti e descrive il protocollo dettagliato per la preparazione di polyplexes, loro caratterizzazione, testare la stabilità delle nanostrutture nudo e protetto a basso contenuto di sale e nucleasi-rich media ed esaminando il indirizzabilità di enzima - e aptamer-funzionalizzate nanostrutture di DNA origami su polycation rivestimento.

<table><tbody><tr><td>10&volte; Tampone di reazione DNase I</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>B0303</td><td></td></tr><tr><td>ABTS (sale diammonico di 2&prime;-Azino-bis(3-etilbenzotiazolina-6-acido solfonico)Alfa</td> <td>Aesar</td><td>J65535</td><td></td></tr><tr><td>Colonne di ultracentrifugazione Amicon</td><td>Merck Millipore</td><td>UCF500308, UCF510024</td><td></td></tr><tr><td>lattato di oligosaccaride chitosano (Mn ~ 4000-6000, > 90% deacetilato, 60%. composizione oligosaccaride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>523682</td><td></td></tr><tr><td>Filamenti di graffette specifici per il design</td><td>Integrate DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Destrano solfato sale sodico (Mr ~ 4 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75027</td><td></td></tr><tr><td>Destrano solfato sale sodico (Mr ~ 40 kDa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>42867</td><td></td></tr><tr><td>DNA gel caricamento colorante (6&times;)</td><td>ThermoFischer sceintifico</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I (senza RNasi)</td><td>New England Biolab (NEB)</td><td>M0303</td><td></td></tr><tr><td>Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N&prime;,Acido N&prima;-tetraacetico (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) BioUltra, anidro, &ge; 99% (titolazione)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Freeze'N Squeeze DNA Gel Estrazione Colonne di centrifuga</td><td>Biorad</td><td>7326165</td><td></td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9039</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogen peroixde sluition (32% in peso)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>LPEI-25 kDa</td><td>Polysciences, Inc</td><td>23966-1</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE Agente riducente del campione (500 mM ditiotreitolo (DTT))</td><td>ThermoFischer sceintific</td><td>NP0004</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglicole (PEG, MW ~ 8000 Da)</td><td>Carl Roth</td><td>O263.1</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimmina, lineare, media Mn 10.000, PDI &le; 1.2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>765090</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimmina, lineare, media Mn 5.000, PDI &le; 1.3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>764582</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di proteinasi K (20 mg/ml)</td><td>ThermoFischer sceintific</td><td>AM2548</td><td></td></tr><tr><td>HRP coniugato con streptavidina</td><td>ThermoFischer sceintific</td><td>N100</td><td></td></tr><tr><td>SYBER sicuro DNA gel colorante</td><td>ThermoFischer sceintific</td><td>S33102</td><td></td></tr></tbody></table>

terapia genica ispirato polycation rivestimento per la protezione di nanostrutture di dna origami

Gene-therapy Inspired Polycation Coating for Protection of DNA Origami Nanostructures

Nanostrutture di DNA origami tenere un immenso potenziale per essere utilizzato per applicazioni biologiche e mediche. Tuttavia, le condizioni di basso contenuto di sale e nucleasi in fluidi fisiologici inducono denaturazione e degradazione delle nanostrutture auto-assemblate del DNA. In genico non virale, degradazione enzimatica del DNA viene superata dall'incapsulamento del DNA negativamente caricato in un guscio cationico. Qui, ispirato da progressi consegna di gene, un semplice, One-Step e solida metodologia è presentato per la stabilizzazione di nanostrutture di DNA origami grazie al loro rivestimento con chitosano e lineare polyethyleneimine. Il rivestimento polycation protegge efficacemente nanostrutture di DNA origami in Mg-vuotati e nucleasi-rich media. Questo metodo conserva anche l'indirizzabilità completo di base di enzima e aptamero funzionalizzazione di nanostrutture di DNA.

Sono stati progettati tre nanostrutture di DNA origami di configurazioni diverse, tra cui un nanorod (NR), un nanobottle (NB) e una nanostruttura wireframe (WN) (i modelli 3D delle nanostrutture sono illustrati nella Figura 2). Il NR e NB sono stati progettati basata su un reticolo quadrato e a nido d'ape, rispettivamente, utilizzando caDNAno17 e il WN è stato creato utilizzando il software di Daedalus18. Un protocollo completo per la progettazione e l'auto-assemblaggio di nanostrutture di DNA è stato già pubblicato19,20,21,22. Il fiocco forma specifici filoni erano ordinati, auto-assemblati e ulteriormente purificati si basa su un protocollo descritto da Stahl et al. 23 (passaggio 2).
Polyplexes sono stati caratterizzati dall'analisi di ritardo del gel e nsTEM imaging. Con la miscelazione l'origami del DNA con il policationi, uno spostamento nella banda nanostruttura nuda verso il catodo è stato osservato (Figura 1A). Questo può essere attribuito a controbilanciare la carica negativa del fosfato gruppi legandosi a policationi e le dimensioni complessive aumentano del complesso. Aggiunta di una quantità extra di polianioni come Destrano solfato può invertire la formazione polyplex. A questo proposito, Destrano solfato di più alto peso molecolare (MW ~ 40 kDa) ha mostrato di essere più efficiente per la decomplexation rispetto al solfato di destrano di peso molecolare inferiore (MW ~ 4 kDa) (Figura 1B).
Mentre LPEI polyplexes dalla macchia negativa del acetato di uranile TEM di imaging, era difficile da eventuali particelle di immagine. È stato supposto che LPEI potrebbe ostacolare l'acetato di uranile da associazione per la spina dorsale di fosfato grazie alla schermatura stretto di origami di DNA. Pertanto, prima di formazione immagine di nsTEM, una quantità eccedente di Destrano solfato è stato aggiunto al LEPI polyplexes. Lo svelati nanostrutture di DNA origami ha mostrato alcun segno di difetto né decomposizione. Al contrario, chitosano polyplexes erano imaged con successo senza necessità di trattamento polyanion (Figura 2).
Tutte le nanostrutture di DNA nudi (a prescindere dalla loro diverse configurazioni) erano denaturati completamente dopo un giorno di incubazione a 37 ° C nel buffer di Mg da zero, come confermato da formazione immagine di nsTEM. Al contrario, nanostrutture rivestito con LPEI o chitosano a N/P≥1 è rimasta intatta. Allo stesso modo, DNasi ho titolazione analisi hanno mostrato la suscettibilità delle nanostrutture non protetti verso la digestione enzimatica. Mentre nude nanostrutture erano completamente digeriti in presenza di 1 U/mL dnasi I dopo 2 h, la LEPI o chitosano incapsulato origami di DNA alloggiato intatto nel buffer di Mg-zero completati con 10 U/mL dnasi I per un minimo di un giorno (Figura 2). Maggiore stabilità verso nucleolitico digestione è stata realizzata aumentando il rapporto N/P del polyplexes. Inoltre, LPEI protegge le nanostrutture di DNA più efficientemente rispetto al chitosano (Figura 3A, Figura 3C), probabilmente a causa della maggiore densità di carica di LEPI e quindi, più alta affinità obbligatoria verso il DNA24 . Nessuna differenza è stata osservata durante l'utilizzo di LPEI di diverso peso molecolare (figura3B).
L'indirizzabilità dei gruppi funzionali in nanostrutture di DNA dopo l'incapsulamento in un guscio di polimero è una caratteristica importante. Inoltre, è stata esaminata la compatibilità di polycation rivestimento con l'enzima perossidasi di rafano (HRP) e associazione Emina aptameri (HBA) funzionalizzati DNA origami. Tre biotinilati fiocco fili erano sporgevano dalla superficie della NR e quindi funzionalizzati con HRP coniugato streptavidina (tre enzimi al DNA origami). Cataliticamente altamente attivo (Kd: 439 nM) HBA aptamero PS2. M (5'-GTGGGTAGGGCGGGTGG-3') è stato scelto per questi esperimenti25. Fino a 24 fili graffette erano sporgevano dalla superficie NR con un linker di lunghezza 5-nm (5'-AAAAGAAAAGAAAAA-3') seguita da PS2. Sequenza di M (24 aptameri per origami di DNA). Nessun ostacolo notevole di enzimatica o aptamero attività è stata osservata su rivestimento origami di DNA HRP - o HBA-funzionalizzate con LPEI e chitosano variante N/P rapporti (Figura 4A-B)16. Tuttavia, la cinetica dell'enzima HRP è drammaticamente cambiata dopo l'associazione per l'origami del DNA (Figura 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig1.jpg"> Figura 1 : Immagini rappresentative età di formazione polyplex e decapsulamento. (A) l'analisi dello spostamento di mobilità elettroforetica per NB mescolato con chitosano a rapporti N/P di 0.01-8. Ogni corsia contiene 1 nmol NB La prima corsia è il riferimento NB (B) decapsulamento dei polyplexes di polyanionic destran solfato (DS). Questa figura è stata modificata da una precedentemente pubblicati figura16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig2.jpg"> Figura 2 : Micrografie TEM macchia negativa di origami di DNA e polyplexes. 3D modello e nsTEM micrografie di nanostrutture di nudo DNA origami (colonne 1 e 2). micrografie di nsTEM di LPEI polyplexes (dopo decapsulamento) e chitosano polyplexes (colonne 3 e 4). nsTEM immagini di origami di DNA nudo e protetta (polyplex) sottoposti a svuotamento di Mg (colonne 5, 6 e 7), degradazione enzimatica (colonne 8 e 9), la digestione del siero (colonne 10 e 11) per un giorno a 37 ° C. LPEI-5 kDa è stato usato per questo test. Nanostrutture di DNA nudi sono stati degradati di là di rilevamento su un'età in presenza di 1 U/mL dnasi I o in TB + 10% FBS dopo 2 h di incubazione a 37 ° C. Scala bar: 100 nm. Questa figura è stata modificata da una precedentemente pubblicati figura16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig3.jpg"> Figura 3 : Risultati rappresentativi della dnasi nelle analisi di protezione. (A) La dnasi I test di protezione per polyplexes di WN con LPEI-5 kDa, LPEI-10 kDa e LPEI-25 kDa preparato al rapporto N/P di 2, 4, 8 e 10. I campioni sono stati sottoposti a 10 U/mL dnasi I per 24 h a 37 ° C. L'ultima corsia è il controllo WN. Il polyplexes erano decapsulato prima del carico nel gel. (B) l'intensità di banda medio normalizzato per polyplexes di origami del DNA con diversi LPEI estratte dall'età immagine-A. Asse Y rappresenta normalizzato banda media intensità. (C) The dnasi I analisi della protezione di chitosano-WN polyplexes preparato a N/P rapporti di 1, 2, 4, 10 e 20. I campioni sono stati sottoposti a 10 U/mL dnasi I per 24 h a 37 ° C. 6 Lane è il controllo polyplex (N/P 20). L'ultima corsia è il controllo WN. Tutti chitosano polyplexes erano decapsulato previo caricamento nel gel. Questa figura è stata modificata da una precedentemente pubblicati figura16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58771/58771fig4.jpg"> Figura 4: risultati di rappresentante di aptamer-funzionalizzati colorimetrico e di enzima DNA origami saggi. (A) il saggio colorimetrico di nanostrutture funzionalizzate enzima (HRP-NR) rivestito con chitosano 3,7 h dopo l'inizio della reazione. (B) analisi colorimetrica di nanostrutture funzionalizzate aptamero (HBA-NR) rivestito con chitosano, 6 min dopo l'inizio della reazione. Asse Y rappresenta l'assorbanza normalizzato. (C) monitorare l'analisi colorimetrica di HRP e HRP-NR nel tempo. Questa figura è stata modificata da una precedentemente pubblicati figura16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58771/58771fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Polimeri cationici</td>
			<td>Chitosano</td>
			<td>LPEI-5 kDa</td>
			<td>LPEI-10 kDa</td>
			<td>LPEI-25 kDa</td>
		</tr>
<tr>
<td>Peso molecolare dei polimeri (kDa)</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
			<td>10</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Diagnostic peso del monomero (g/mol)</td>
			<td>161</td>
			<td>43</td>
			<td>43</td>
			<td>43</td>
		</tr>
<tr>
<td>Numero di ammina per monomero</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Numero di ammina al polimero</td>
			<td>28</td>
			<td>116</td>
			<td>232</td>
			<td>581</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1. Calcolo del numero di gruppi amminici a polycation.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Peso molecolare di Destrano solfato (kDa)</td>
			<td>4</td>
			<td>40</td>
		</tr>
<tr>
<td>Peso molecolare del monomero (g/mol)</td>
			<td>366</td>
			<td>366</td>
		</tr>
<tr>
<td>Numero di solfato per monomero</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Numero di solfato per polimeri</td>
			<td>22</td>
			<td>220</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2. Calcolo del numero di gruppi solfato per polyanion.

Qui, un protocollo per la protezione di nanostrutture di DNA origami in Mg-vuotati e nucleasi-rich media usando chitosano naturale polisaccaride cationico e rivestimenti sintetici lineare polyethyleneimine (LPEI) è presentato.

Terapia genica ispirato Polycation rivestimento per la protezione di nanostrutture di DNA Origami

DNA origami nanostructures hold an immense potential to be used for biological and medical applications. However, low-salt conditions and nucleases in ...

La stabilizzazione biologica delle nanostrutture del DNA è essenziale per le future applicazioni in vivo, come la somministrazione mirata di farmaci. Tuttavia, il DNA viene degradato nel corpo da vari enzimi. Qui presentiamo una tecnica di rivestimento che protegge le nanostrutture di DNA dalla degradazione enzimatica.I principali vantaggi sono che il nostro rivestimento comprende composti non tossici che sono già utilizzati negli organismi viventi e che la funzionalizzazione della superficie rimane possibile. Questa funzionalizzazione è importante per incorporare sensori molecolari per il riconoscimento del bersaglio e interruttori per il rilascio del carico di droga. I rivestimenti di policatione aumentano significativamente l'assorbimento cellulare delle strutture di origami di DNA incapsulate, quindi questo metodo può aprire la porta per le applicazioni degli origami di DNA nella diagnostica e nella terapia.L'assorbimento cellulare è richiesto anche per potenziali applicazioni di somministrazione genica della nanotecnologia del DNA. Ritengo che il metodo sia abbastanza semplice e possa essere facilmente padroneggiato. Per iniziare, misurare la concentrazione di origami di DNA purificati.Utilizzare due microlitri di tampone TB come vuoto per calibrare lo spettrofotometro ultravioletto. E poi misurare la concentrazione di origami di DNA a 260 nanometri. Quindi calcolare le quantità di fosfati nella soluzione di origami del DNA purificato, usando la formula due, come descritto nel manoscritto.Preparare 15 microlitri della struttura degli origami di DNA includendo un nanomolo di fosfato, utilizzando il tampone tb per la diluizione. Aggiungere 13,2 microlitri a TB a 1,8 microlitri di chitosano. E aggiungere 15 microlitri della soluzione chitosana a 15 microlitri degli origami di DNA per sviluppare un poliplex chitosano di origami di DNA con un rapporto N/P di otto.Continuare a preparare polilessi di diversi rapporti N/P, utilizzando calcoli come descritto nel manoscritto. Preparare 80 millimetri di tubo per il gel di agarosio al 2%. Aggiungere 352 microlitri di cloruro di magnesio molare 2.5 e quindi pre-macchiarlo con 10 microlitri di macchia di gel di DNA.Versare la soluzione di gel in una scatola di gel asciutta. Inserire un pettine per elettroforesi in gel e lasciarlo solidificare a temperatura ambiente per 15-30 minuti. Nel frattempo integrare il tampone di corsa con cloruro di magnesio millimolare da 11 millimolare.Mescolare da 10 a 20 microlitri di ciascun campione con il 20% del buffer di caricamento 6X. Caricare i campioni nei pozzi di gel di agarosio, incluso un origami di DNA nudo come controllo. Far funzionare il gel a 70 volt a temperatura ambiente per due ore e mezza o tre ore.Quindi utilizzare uno scanner UV per visualizzare il gel. Per eseguire un test di protezione della DNasi I, aggiungere quattro microlitri di ogni poliplex rispetto a diversi rapporti N/P, 1,5 microlitri di tampone 10X DNasi I, 8 microlitri di TB e 1,5 microlitri di DNasi I a un tubo PCR separato da 2 millilitri. Quindi incubare lo stesso a 37 gradi Celsius in un termociclo per 24 ore.Per digerire la DNasi I, aggiungere due microlitri da 20 milligrammi per millilitri proteinasi K e incubare per 30 minuti a 37 gradi celsius in un termociclo. Quindi, per svelare le nanostrutture del DNA di base aggiungere 3,6 microlitri da 50 milligrammi per millilitro 40 kilodalton di solfato di dextran. Quindi utilizzare questi campioni e origami di DNA fresco come controllo per eseguire l'elettroforesi del gel di agarosio come descritto in precedenza.Asportare la banda corrispondente ai campioni caricati dal gel. Per estrarre gli origami di DNA, utilizzare una colonna di estrazione del congelamento della compressione e seguire le istruzioni del produttore e continuare con l'imaging di microscopia elettronica a trasmissione della macchia negativa come descritto nel manoscritto. Mescolare 6,5 microlitri di 36 nanomolari HRP-NR purificati con 6,5 microlitri di policazioni di varie concentrazioni.Per preparare un poliplex con rapporti N/P di uno, due, quattro, 10 e 20, preparare un gruppo vuoto mescolando 6,5 microlitri di acqua distillata con 6,5 microlitri di policationi di varie concentrazioni corrispondenti ai rapporti N/P di uno, due, quattro, 10 e 20. Quindi aggiungere 12,5 microlitri di ciascuna di queste soluzioni preparate a un pozzo separato di una piastra di 96 poggi. Quindi aggiungere 72,5 microlitri di tampone HEPES ad ogni pozzo e mescolare.Aggiungere 10 microlitri di 15 millimolare ABTS e quindi 5 microlitri di un perossido di idrogeno millimolare da 12 millimolare ad ogni pozzo e mescolare tubazione su e giù. Infine, utilizzare un lettore di piastre multimodale per misurare l'assorbanza a 421 nanometri in quattro ore. Dopo aver analizzato i polilessi usando un saggio di ritardo del gel, ci fu uno spostamento della nanostruttura nuda verso il catodo, probabilmente a causa del controbilanciamento della carica negativa dei gruppi fosfati al momento del legame con i policationi, e dell'aumento delle dimensioni del complesso.Quando è stata aggiunta una quantità extra di polianioni, come il solfato di dextran, la formazione di poliplex è stata invertita. Il solfato di Dextran con un peso molecolare più elevato si è dimostrato più efficiente rispetto al minor peso molecolare. Dopo aver analizzato i poliplex usando la microscopia elettronica a trasmissione della macchia negativa, le micrografie hanno mostrato nanostrutture di origami di DNA nudi, polilessi lineari di polietilenimina dopo decapsulazione, poliplex chitosani, immagini di origami di DNA nudi e protetti sottoposti a esaurimento di magnesio, degradazione enzimatica e digestione del siero.In presenza di DNasi I, dopo due ore, le nanostrutture nude sono state completamente digerite, mentre i polilessi lineari in polietilenimina degli origami di DNA incapsulati di chitosano sono rimasti intatti in presenza di 10 unità per millilitro DNasi I.I polietilenimina lineare i polilessi proteggono le nanostrutture del DNA in modo più efficiente rispetto al chitosano. Quando il rapporto N/P del poliplex è aumentato, la digestione del DNA era inferiore. Dopo l'enzima di rivestimento, o dopo origami di DNA più funzionalizzati, con poli plessi lineari di polietilenimina e chitosano a varianti rapporti N/P, non è stata osservata alcuna interferenza notevole con l'attività enzimatica.D'altra parte, la cinetica dell'enzima HRP è cambiata radicalmente dopo il legame con gli origami del DNA. È importante iniziare con strutture origami di DNA ben purificate. Esiste un filamento più stabile che può anche legarsi alle policazioni.Sono difficili da separare dai poliplex di origami del DNA. Le nostre molecole di rivestimento sono utilizzate anche in applicazioni di terapia genica. Ciò significa che le nanostrutture del DNA possono essere utilizzate in futuro per alterare il genoma degli organismi viventi.Per la colorazione del gel di agarosio, di solito vengono utilizzate molecole che intercalano il DNA e sono potenzialmente mutagene. Si prega di seguire le istruzioni di sicurezza del laboratorio quando si macchia il DNA.

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