Name: Utilizzando un agente patogeno batterico alla sonda per le risposte cellulari e organismica-livello Host (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Scopri tecniche di saggi di infezione in vitro e in vivo per analizzare l'efflusso di patogeni intracellulari. Questi metodi valutano l'efficienza dell'efflusso e caratterizzano i patogeni post-efflusso.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Topi sono stati trattati umanamente secondo tutte le linee guida di governo appropriati per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health e il loro uso è stati approvati per questo intero studio della cura degli animali istituzionale Università di Miami e uso Comitato (protocollo 16-053).
1. preparare le celle per infezione
<ol><li>Propagare la linea di macrofago-come delle cellule di topo 264,7 in terreni di coltura di tessuto DMEM completati con 10% di siero fetale di vitello (d'ora in poi denominato DMEM/FCS) utilizzando un pallone da 125 mL e un incubatore di coltura del tessuto mantenuta a 37 °C/5% CO2.</li>
	<li>Il giorno prima dell'infezione, utilizzare un raschietto di cella per rimuovere le cellule dal pallone di espansione e raccogliere in una provetta conica da 15 mL tappo a vite. Centrifugare le cellule a 800 x g per 10 min, decantare il supernatante e sospendere il pellet cellulare in 1 mL di DMEM/FCS (senza antibiotici) e determinarne il titolo usando un contatore automatizzato delle cellule o un emocitometro.</li>
	<li>
Regolare titolo a 2 x 106 cellule/mL e aggiungere 0,10 mL (2 x 105 cellule) dei pozzetti di una piastra di coltura del tessuto 48 pozzetti. Garantire che la sospensione cellulare copre l'intera superficie del pozzo.
	<ol>
<li>Cellule di piastra in ulteriori pozzi per una fonte successiva dei media condizionati. Inoltre posizionare 0,10 mL di DMEM/FCS in ulteriori tre pozzi per servire come un 'nessun controllo di cella'.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incubare per una notte in un incubatore di coltura del tessuto a 37 °C/5% CO2. Il giorno successivo, non rimuovere dalla incubatrice fino a quando l'inoculo del batterio è preparato e pronto all'uso.</li>
</ol>2. preparazione Listeria monocytogenes (Lm) per infezione
<ol><li>Inoculare 2 mL di infusione cervello-cuore (BHI) con una singola Colonia da una piastra di agar appena striato (< 2 giorni) di Lm e incubare per una notte a 37 ° C con agitazione a 130 rotazioni/min.</li>
	<li>Il giorno successivo, aggiungere 0,10 mL di coltura durante la notte a 2 mL pre-riscaldati BHI e continuare fino a quando la densità ottica (OD600) è compreso fra 0,4 e 0,6 in incubazione a 37 ° C con agitazione.</li>
	<li>Determinarne approssimativo titolo batterica utilizzando una formula di conversione empiricamente derivati. Nel nostro laboratorio, una cultura di Lm in crescita esponenziale in BHI è circa 1.3 x 109 Colonia formando unità (CFU) /OD600. Ridurre al minimo la quantità di tempo le colture batteriche sono esposti a temperatura ambiente.</li>
	<li>Appena prima dell'infezione è necessario regolare il titolo a 5 x 107 CFU/mL utilizzando pre-riscaldato DMEM/FCS come diluente.</li>
</ol>3. infezione
<ol><li>Lavorare rapidamente e con precisione, aggiungere 20 µ l (1 x 106 CFU; molteplicità di infezione, MOI = 5) dell'inoculo da Lm preparata (passaggio 2.4 sopra) ai pozzetti inclinando leggermente il piatto e posizionando accuratamente il puntale in media sovrastanti; Nota: evitare di toccare le pareti del pozzo con il puntale.</li>
	<li>Delicatamente dispensare il contenuto di ogni pozzetto per garantire la completa miscelazione; non agitare o significativamente inclinare il piatto come questo si diffonderà Lm sopra le pareti del pozzo. 37 °C/5% CO2 incubator, tornare piastra di coltura delle cellule.</li>
	<li>Preparare una soluzione di gentamicina 10 µ g/mL usando media condizionati da pozzi non infetti come diluente.</li>
	<li>A 30 minuti post infezione (mpi), attentamente aggiungere 30 µ l della soluzione di gentamicina (concentrazione finale di 2,5 µ g/mL) e delicatamente dispensare il contenuto del bene come prima e piastra di coltura cellulare ritorno all'incubatore a 37 °C/5% CO2 .</li>
	<li>A 60 mpi, vendemmia appositi pozzetti per analisi di CFU (60 mpi punto di tempo) o analisi FCM (come descritto di seguito nelle sezioni 4 e 5, rispettivamente).</li>
	<li>Per pozzetti rimanenti, in tempi diversi da allora in poi sia raccogliere le cellule come prima o, per il dosaggio di emersione Lm , interamente di rimuovere il supporto dal pozzo e sostituire con 150 µ l di gentamicina-free media condizionati.</li>
</ol>4. elaborazione ed analisi di intracellulare ed emergente Lm dall'analisi di CFU di campionamento
<ol><li>Per raccogliere, inclinando leggermente il piatto e rimuovere con attenzione il supporto intero dal pozzo. Aggiungere 0,50 mL di acqua distillata sterile (dsH2O). Dopo 30 s, trasferire l'acqua risultante lisato (100) in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e agitare vigorosamente per 10 s.</li>
	<li>Preparare 10-1 e 10-2 diluizioni aggiungendo o 4,5 µ l o 50 µ l di acqua lisato a 450 µ l di dsH2O e brevemente vortex per garantire la completa miscelazione.</li>
	<li>Diffusione di 50 µ l del 100, 10-1 e/o 10-2 campioni su piastre di agar Lisogenesi brodo (LB).</li>
	<li>Dosaggio per emergente Lm (passo 3.6 sopra), rimuovere 10 µ l di media sovrapposizione e dividerlo in aliquote di due 5 µ l: ad un'aliquota aggiungere 5 µ l di DMEM/FCS e per la seconda aliquota aggiungere 5 µ l di DMEM/FCS contenente 5 µ g/mL Gentamicina. Il controllo di quest'ultimo distingue tra extracellulare Lm (gentamicina sensibile) e intracellulare Lm (gentamicina resistente) nel CFU successivo analisi.</li>
	<li>Dopo 5 min a temperatura ambiente, aggiungere 90 µ l di dsH2O, vortexare vigorosamente per 10 s e diffusione 50 µ l su piastre di agar LB.</li>
	<li>Enumerare Lm colonie su piastre di agar LB dopo 2 giorni di incubazione a 37 ° C.</li>
</ol>5. campionamento di elaborazione ed analisi di intracellulare ed emergente Lm da citometria a flusso (FCM)
<ol><li>Preparare 264.7 celle grezze come descritto ai punti 1.1-4. Regolare le cellule a 1 x 106 cellule/mL e aggiungere 1 mL (1 x 106 cellule) dei pozzetti di una piastra di coltura del tessuto 6 pozzetti.</li>
	<li>Preparare l'inoculo del batterio come descritto al punto 2.1-2.3 e infettare le cellule con volume di inoculo corrispondente a un MOI di 50 (5 x 107 CFU).</li>
	<li>A 1,5 ore post infezione (hpi), raccogliere media dalla prima serie di pozzi e mettere in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL con 500 µ l di paraformaldeide al 4% (PFA) e posto sul ghiaccio fino a quando tutti i pozzetti sono stati elaborati.</li>
	<li>Per raccogliere intracellulare Lm, aggiungere 1 mL di dsH2O al pozzo e dopo 60 s, trasferire l'acqua risultante lisato di una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL con 500 µ l di 4% PFA. Vortexare vigorosamente per 10 s e posto su ghiaccio fino a quando tutti i pozzetti sono stati elaborati. (Elaborazione del campione è descritta nel passaggio 5.8 qui sotto).</li>
	<li>Per pozzetti rimanenti, rimuovere i supporti e sostituire con 1 mL di DMEM/FCS con 5 gentamicina µ g/mL per uccidere extracellulare Lm e restituire immediatamente le cellule a incubatore.</li>
	<li>Dopo 30 min (2 hpi) rimuovere i supporti e sostituire con DMEM/FCS senza gentamicina.</li>
	<li>Dopo 2 e 4 h (4 e 6 hpi) prendere la seconda e la terza volta punti raccogliendo media e lisati come punti 5.3 e 5.4.</li>
	<li>Centrifugare le provette a 10.000 x g per 7 min. Remove surnatante senza pellet inquietante.</li>
	<li>Sospendere ogni pallina nella macchiatura cocktail di 50 µ l di 4% PFA e 15 µ l di falloidina. Incubare le provette al buio a 4 ° C per 20 min.</li>
	<li>Dopo incubazione aggiungere 1 mL di tampone di FACS a ciascuna provetta e pipetta su e giù per mescolare.</li>
	<li>Gira tubi a 10.000 x g per 7 min. Remove surnatante senza pellet inquietante.</li>
	<li>Sospendere ogni pellet in 400 µ l di tampone di FACS per uso immediato, o 200 µ l di tampone di FACS e 200 µ l di 4% PFA se per un'analisi successiva.</li>
	<li>Eseguire i campioni su un flusso cytometry e analizzare i dati raccolti.</li>
</ol>6. elaborazione ed analisi di colonizzazione di Lm e risposte dell'ospite nel fegato di campionamento
<ol><li>Preparare Lm per infezione come descritto al punto 2.1-2.3.</li>
	<li>Calcolare la quantità necessaria di sottocultura per titolo desiderato di 3 x 106 CFU/mL.</li>
	<li>Appena prima dell'infezione diluire la quantità di batteri calcolati con pre-riscaldato di Hank bilanciato sale soluzione (HBSS) in un volume finale di 1 mL. Questo è l'inoculo di input che viene iniettato nel mouse.</li>
	<li>Usando una siringa da insulina 100U g ½ 28, disegnare 100 µ l (3 x 105 CFU) di ingresso dell'inoculo e rimuovere eventuali bolle d'aria visibili.</li>
	<li>Inserire il mouse (ceppo C57BL/6; maschi tra 6 e 12 settimane) il sistema di ritenuta della holding e utilizzare acqua tiepida (non più di 45 ° C) per dilatare la vena della coda, quindi iniettare l'inoculo ingresso nella vena.</li>
	<li>Piastra 10-2 e 10-3 diluizioni dell'inoculo ingresso su piastre LB agar 10bcm e incubare per una notte a 37 ° C per determinare il dosaggio di ingresso effettivo.</li>
	<li>Alle 18 hpi, umanamente eutanasia mouse (CO2 asfissia seguita da dislocazione cervicale) e usando il peritoneo del mouse Apri taglio forbici sterili per raccogliere del lobo frontale del fegato utilizzando singole paia di forbici e pinzette per l'esterno e all'interno di il mouse. Posizionare il fegato in un 6cm di Petri sul ghiaccio.</li>
	<li>Tagliare il fegato a dadini e inserire in un flaconcino di vetro con un'ancoretta magnetica. Aggiungere 2 mL di collagenasi di 2 mg/mL D ricostituito in DMEM senza FCS. Incubare le fiale a 37 ° C su un agitatore magnetico per 30−45 min. Una volta che il tessuto è omogeneizzato, aggiungere 3 mL di DMEM/FCS per inattivare la collagenosi.</li>
	<li>Filtrare le cellule attraverso un colino di cella di 70 µm in un tubo conico, eventualmente aggiungendo ulteriori DMEM/FCS.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 800 x g per pellet a 4 ° C per 10 min, rimuovere il surnatante e sospendere il pellet cellulare in 500 µ l di tampone ACK per lisare cellule rosse del sangue.</li>
	<li>Incubare le cellule a temperatura ambiente per 5 min nel buffer di ACK. Sospendere le cellule in 1 mL di DMEM/FCS.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 800 x g per pellet a 4 ° C per 10 min, rimuovere il surnatante e sospendere in 1 mL di DMEM/FCS. Quindi, contare le celle utilizzando un contatore automatizzato delle cellule o un emocitometro.</li>
	<li>Trasferimento 1 x 106 cellule in provetta per microcentrifuga da 1,5 mL e spin a pellet. Quindi sospendere in 1 mL di dsH2O e vortexare per lisare le cellule. Piastra 50 µ l su piastre LB a non diluito e 10-2 diluizioni e incubare a 37 ° C per enumerare Lm per analisi CFU.</li>
	<li>1 x 106 cellule di trasferimento nelle provette di FACS per ogni campione di tessuto secondo i conteggi delle cellule e lavare con 1 mL di tampone di FACS.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 800 x g a pellet a 4 ° C per 10 minuti e rimuovere il surnatante.</li>
	<li>Preparare un cocktail di anticorpi che contiene gli anticorpi di interesse basato sulla concentrazione consigliata per ogni anticorpo e FACS buffer. Vedi Tabella materiali per gli importi raccomandati utilizzati nell'analisi.</li>
	<li>Sospendere il pellet in 100 µ l di anticorpo cocktail e incubare le provette al buio a 4 ° C per 30 min.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, aggiungere 2 mL di buffer di FACS in ogni provetta e sospendere le cellule.</li>
	<li>Centrifugare le cellule a 800 x g a pellet a 4 ° C e scartare il surnatante. Quindi sospendere il pellet in 400 µ l di tampone di FACS per uso immediato, o 200 µ l di tampone di FACS e 200 µ l di 4% PFA se per più tardi.</li>
	<li>Analizzare le cellule tramite flusso cytometry (Vedi punto 5.13).</li>
</ol>

<ol><li>Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+-+from+saprophyte+to+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes - from saprophyte to intracellular pathogen.</a> Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).</li>
<li>Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Life+on+the+inside%3A+the+intracellular+lifestyle+of+cytosolic+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria.</a> Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).</li>
<li>Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+impact+of+mutational+activation+on+the+Listeria+monocytogenes+central+virulence+regulator+PrfA%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA.</a> Microbiology. 154, 3579-3589 (2008).</li>
<li>McCormack, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perforin-2+Protects+Host+Cells+and+Mice+by+Restricting+the+Vacuole+to+Cytosol+Transitioning+of+a+Bacterial+Pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen.</a> Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).</li>
<li>Gregory, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complementary+adhesion+molecules+promote+neutrophil-Kupffer+cell+interaction+and+the+elimination+of+bacteria+taken+up+by+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver.</a> Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).</li>
<li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+trafficking+to+hepatic+sites+of+bacterial+infection+is+chemokine+independent+and+directed+by+focal+intercellular+adhesion+molecule-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression.</a> Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).</li>
<li>Pitts, M. G., Combs, T. A., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neutrophils+from+Both+Susceptible+and+Resistant+Mice+Efficiently+Kill+Opsonized+Listeria+monocytogenes%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes.</a> Infection and Immunity. 86, 00085(2018).</li>
<li>Carr, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+depletion+reveals+a+novel+role+for+neutrophil-mediated+protection+in+the+liver+during+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection.</a> European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).</li>
<li>Blériot, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-resident+macrophage+necroptosis+orchestrates+type+1+microbicidal+inflammation+and+type-2-mediated+tissue+repair+during+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection.</a> Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).</li>
<li>Jones, G. S., D'Orazio, S. E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+are+the+predominant+cell+type+associated+with+Listeria+monocytogenes+in+the+gut%2C+but+they+do+not+serve+as+an+intracellular+growth+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche.</a> Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).</li>
<li>Agaisse, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screen+for+host+factors+required+for+intracellular+bacterial+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection.</a> Science. 309, 1248-1251 (2005).</li>
<li>Cheng, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+RNA+interference+in+Drosophila+S2+cells+to+identify+host+pathways+controlling+compartmentalization+of+an+intracellular+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Science+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).</li>
<li>Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GILT+is+a+critical+host+factor+for+Listeria+monocytogenes+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection.</a> Nature. 455, 1244-1247 (2008).</li>
<li>Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perturbation+of+vacuolar+maturation+promotes+listeriolysin+O-independent+vacuolar+escape+during+Listeria+monocytogenes+infection+of+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells.</a> Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).</li>
<li>Shrestha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+host-encoded+Heme+Regulated+Inhibitor+%28HRI%29+facilitates+virulence-associated+activities+of+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens.</a> PLoS One. 8, 68754(2013).</li>
<li>Bahnan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eIF2%CE%B1+Kinase+Heme-Regulated+Inhibitor+Protects+the+Host+from+Infection+by+Regulating+Intracellular+Pathogen+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Infection+and+Immunity%22%5BJournal%5D)">The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking.</a> Infection and Immunity. 20, 00707(2018).</li>
<li>Kortebi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Listeria+monocytogenes+switches+from+dissemination+to+persistence+by+adopting+a+vacuolar+lifestyle+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogen%22%5BJournal%5D)">Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells.</a> PLoS Pathogen. 13, 1006734(2017).</li>
<li>VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+Gentamicin+Concentration+and+Exposure+Time+on+Intracellular+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505(2017).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Grazie al suo programma di infezione cellulare rapida e processive, Lm è un patogeno ideale per sondare le attività cellulari che hanno un impatto infezione. È stata identificata una serie di fattori dell'ospite che positivamente o negativamente influenzare Lm infezione cellulare11,12,13,14. Due tali host fattori caratterizzati nel nostro laboratorio, perforina-2 e l'inibitore...

Modelli sperimentali basati su infezione sono intrinsecamente impegnativi a causa della loro dipendenza dalle condizioni di partenza dello stato di ospite e patogeno, le varie strategie di infezione del patogeno e la difficoltà di attribuzione dell'agente patogeno e host-processi basati basato sui risultati. Il batterio Listeria monocytogenes (Lm) è diventato un agente patogeno ideale per sondare le risposte di difesa ospite a causa della sua trattabilità genetiche e microbiologiche, la strategia di infezione cellulare rapida e processive e relativamente chiaro relazione tra suoi fenotipi di infezione cellulare e organismica livello. L'infezione cellulare di Lm procede attraverso quattro fasi distinte1: (i) l'invasione cellulare che si conclude con Lm essere racchiuso all'interno di un vacuolo; (ii) Lm-diretto la dissoluzione della membrana del vacuolo e rilascio di Lm nel citosol; (iii) replica intracytosolic; e (iv) penetrazione fisica della membrana plasmatica che si traduce in entrambi l'infezione delle cellule direttamente adiacenti (ad esempio in un foglio di epiteliale) o, in cellule solitarie, rilascio di Lm nell'ambiente extracellulare. Ognuna di queste fasi sono promossi da specifici Lm-codificato fattori (denominati «fattori di virulenza») che, quando eliminato, causare difetti di infezione nei modelli animali e cellulari. Questa strategia di infezione generale è stata evoluta indipendentemente da un numero del cosiddetto 'citosolico' patogeni2.
Formanti colonie (CFU) unità saggi sono largamente impiegate per valutare sia in vitro (cioè, cellulare) in vivo (cioè, organismica) esiti di infezione. Oltre alla loro alta sensibilità, specialmente per le infezioni in vivo, CFU saggi forniscono una lettura univoca per l'invasione dell'agente patogeno e sopravvivenza/proliferazione intracellulare. Saggi di CFU sono stati ampiamente utilizzati per analizzare Lm sia host determinanti delle cellule che hanno un impatto infezione. Come informativo come questi studi precedenti sono stati per analizzare l'invasione cellulare e intracytosolic replica, CFU saggi non sono, al meglio della nostra conoscenza, stati utilizzati per tenere traccia della quarta fase del processo di infezione Lm : fuga cellulare. Qui, descriviamo relativamente semplici mezzi di fuga come cellulare (in appresso denominato 'emersione') possono essere monitorati mediante analisi CFU (così come da citometria a flusso) e visualizza esempi di come entrambi fattori patogeno-ospite con codifica e regolano questa fase di Lm ciclo di infezione. L'analisi della fase terminale del ciclo cellulare Lm infezione può rendere possibile identificare l'agente patogeno supplementare e fattori di infezione specifica cellula ospite e attività.

<table><tbody><tr><td>ACK Tampone di lisi</td><td>Gibco&nbsp;</td><td></td><td></td>A1049201</tr><tr><td>Perline di compensazione reattiva all'ammina ArC&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>A10346</td><td></td></tr><tr><td>BHI (Brain Heart Infusion) brodo</td><td>EMD Milipore</td><td>110493</td><td></td></tr><tr><td>Filtro cellulare, 70 &; m</td><td>VWR</td><td>10199-656</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi D</td><td>Roche</td><td>11088858001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM media&nbsp;</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Tubi FACS&nbsp;</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>FBS - Calore inattivato&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4135-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Hanks ' Soluzione salina bilanciata</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-6X500ML</td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Grow Cells MS</td><td>MBPE-4040</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Kit di colorazione di cellule morte gialle riparabili.</td><td>Life Technologies</td><td>L349S9</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina Falloidina&nbsp;</td><td>Thermo Fischer</td><td>R415</td><td></td></tr><tr><td>SP6800 Analizzatore spettrale</td><td>Sony</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringa 28 G 1/2" 1cc</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>TPP Coltura tissutale 48 piastre a pozzetti&nbsp;</td><td>MIDSCI</td><td>TP92048</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali TPP a 6 pozzetti&nbsp;</td><td>MIDSCI</td><td>TP92406</td><td></td></tr><tr><td>UltraComp eBeads</td><td>eBioscience</td><td>01-2222-42</td><td></td></tr><tr><td><forte>antigene</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD11b&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurocromo = PE Cy5, Diluizione = 1/100, Clone = M1/70</td></tr><tr><td>CD11c</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = AF 647, Diluizione = 1/100, Clone = N418</td></tr><tr><td>CD45</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = APC Cy7, Diluizione = 1/100, Clone = 30-F11</td></tr><tr><td>F4/80</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = PE, Diluizione = 1/100, Clone = BM8</td></tr><tr><td>Live/Dead</td><td>Invitrogen</td><td></td><td>Flurocromo = AmCyN, Diluizione = 1/100</td></tr><tr><td>Ly6C</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = PacBlue, Diluizione = 1/200, Clone = HK1.4</td></tr><tr><td>MHC II</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = AF 700, Diluizione = 1/200, Clone = M5/114.15.2</td></tr><tr><td>NK 1.1</td><td>Biolegend</td><td></td><td>Flurochrome = BV 605, Diluizione = 1/100, Clone = PK136</td></tr></tbody></table>

utilizzando un agente patogeno batterico alla sonda per le risposte cellulari e organismica-livello host

Using a Bacterial Pathogen to Probe for Cellular and Organismic-level Host Responses

Ci sono una varietà di strategie che impiegano batteri patogeni di sopravvivere e proliferare una volta all'interno della cellula eucariotica. I cosiddetti 'citosolici' patogeni (Listeria monocytogenes, Shigella flexneri, Burkholderia pseudomallei, Francisella tularensise Rickettsia spp.) accedere al cytosol delle cellule infette da fisicamente ed enzimaticamente degradare la membrana vacuolar primaria. Una volta nel cytosol, questi agenti patogeni sia proliferano, nonché generano sufficienti forze meccaniche di penetrare la membrana plasmatica della cellula ospite al fine di infettare nuove cellule. Qui, ci mostrano come questa fase terminale del ciclo cellulare infezione di L. monocytogenes (Lm) può essere quantificata da saggi di unità formanti colonie e citometria a flusso e dare esempi di come sia effetto di fattori patogeno-ospite con codifica e questo processo. Mostriamo anche una stretta corrispondenza delle Lm dinamiche di infezione delle cellule coltivate infettate in vitro e quelli delle cellule epatiche derivate da topi infettati in vivo. Questi saggi basati sulla funzione sono relativamente semplici e possono essere facilmente scalati per schermi di alto-rendimento basata su individuazione per modulatori della funzione delle cellule eucariotiche.

Valutare il ruolo dell'agente patogeno e codificata in host fattori che incidono infezione cellulare Utilizzando le condizioni di infezione sopra descritte, 0,15% del selvaggio-tipo ingresso Lm viene recuperato dopo 1,5 h di co-incubazione con macrofagi coltivati (Figura 1A). Nei successivi 1,5 h di co-incubazione (3h post infezione, hpi), c'era un aumento di 4 volte nel recupero di vitali Lm e da 3 a 6 h...

Descriviamo entrambe le analisi in vitro e in vivo di infezione che possono essere utilizzate per analizzare le attività dei fattori ospite-codifica.

Utilizzando un agente patogeno batterico alla sonda per le risposte cellulari e organismica-livello Host

There are a variety of strategies bacterial pathogens employ to survive and proliferate once inside the eukaryotic cell. The so-called 'cytosolic' ...

Gli agenti patogeni microbici che si replicano intracellularmente devono eventualmente uscire dalla cellula infetta. Che, rispetto ad altri aspetti delle interazioni patogene ospiti è relativamente sottostudiato. Qui descriviamo le tecniche per analizzare l'efflusso patogeno.Mostriamo come saggi relativamente semplici possono essere utilizzati per valutare l'efficienza dell'efflux o caratterizzare gli agenti patogeni post-efflux Le tecniche generali qui descritte sono ampiamente applicabili anche se specifici modelli di cellule ospiti patogene possono differire in cinetica, dosaggi ed eventualmente read-out. Come nell'istituire qualsiasi sistema sperimentale, è essenziale stabilire controlli chiari che garantiscano il rispetto di processi biologici autentici in campioni sperimentali o coorti. A dimostrare la procedura sarà Petoria Gayle, una studentessa laureata del mio laboratorio.Per iniziare con l'esperimento di infezione, utilizzare una pipetta per aggiungere 20 microlitri dell'inoculo Lm appena preparato ai pozzi, con il piatto leggermente inclinato e la punta della pipetta accuratamente posizionata nel supporto sovrasante. Evitare di toccare le pareti del pozzo con la punta della pipetta. Pipettare delicatamente il contenuto di ogni pozzo per garantire una miscelazione completa.Non agitare o inclinare significativamente la piastra per evitare di stendo LM sulle pareti del pozzo. Riportare il piatto di coltura cellulare al 37 gradi Celsius, l'incubatore di anidride carbonica al cinque%. Utilizzare mezzi condizionati da cellule non infette come diluente per preparare una soluzione di gentamicina da 10 microgrammi per millilitro.A 30 minuti dopo l'infezione, aggiungere con cura 30 microlitri della soluzione di gentamicina nel piatto per raggiungere una concentrazione finale di due punti-cinque microgrammi per millilitro. Pipettare delicatamente il contenuto del pozzo per mescolare e restituire il piatto di coltura cellulare all'incubatore. Per raccogliere, inclinare leggermente il piatto e utilizzare con cura una pipetta per rimuovere l'intero supporto dal pozzo.Aggiungere al pozzo millilitri di punto cinque di acqua distillata e sterile. Dopo 30 secondi, trasferire vigorosamente il lysate d'acqua risultante su un tubo di microcentrifugo e vortice di un punto e cinque millilitri per 10 secondi. Aggiungere microlitri a quattro punti e 50 microlitri del litoro d'acqua a 450 microlitri di acqua distillata e sterile per preparare le diluizioni decina e cento volte.Brevemente vortice per garantire una miscelazione accurata. Aggiungere 50 microlitri dei campioni originali diluiti e cento volte diluiti su piastre di agar di brodo di lisogenia e stenderli utilizzando uno spargitore di piastre. Per saggiare l'LM emergente, estrarre 10 microlitri del supporto di sovrapposizione dal piatto e dividerlo in due aliquote a cinque microlitri e tubi di micro centrifuga.Aggiungere cinque microlitri di DMEM/FCS a un'aliquota e aggiungere cinque microlitri di DMEM/FCS contenenti cinque microlitri per millilitro gentamicina alla seconda aliquota come controllo. Attendere cinque minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 90 microlitri di acqua sterile distillata ad ogni aliquota e vortice i due vigorosamente per 10 secondi.Quindi aggiungere 50 microlitri del campione su piastre di agar LB e stendere utilizzando uno spargitore di piastre. Conservare le piastre in incubatore di 37 gradi celsius per due giorni prima di enumerare le colonie Lm. Utilizzando un contatore di celle automatizzato, regolare le cellule preparate, grezze due-sei-quattro-punto-sette alla concentrazione di una per 10 al sesto cellule per millilitro.Aggiungere un millilitro del campione ai pozzi di una piastra di coltura tissutale a sei pozzi. Infettare le cellule con un inoculo Lm preparato, corrispondente a una molteplicità di infezione di 50. A un punto-cinque ore dopo l'infezione, in un tubo di microcentrifugo a un punto e cinque millilitri riempito con 500 microlitri del quattro per cento di PFA, raccogliere i supporti dal primo set di pozzi e posizionare il tubo sul ghiaccio.Per raccogliere Lm intracellulare, aggiungere un millilitro di acqua distillata e sterile ad ogni pozzo. Dopo 60 secondi, trasferire il litorato d'acqua risultante in un tubo di microcentrifugo a cinque millilitri con 500 microlitri di PFA al quattro per cento. Vortice vigorosamente il tubo per 10 secondi e posizionarlo sul ghiaccio.Per i pozzi rimanenti, rimuovere i supporti e sostituirli con un millilitro di DMEM/FCS con cinque microgrammi per millilitro gentamicina per uccidere lm extracellulare.Restituire prontamente il piatto all'incubatore. Dopo 30 minuti, rimuovere i supporti e sostituirli con DMEM/FCS senza gentamicina. Dopo altre due e quattro ore, raccogliere i media in lisati per la seconda e la terza volta punti nei tubi e metterli sul ghiaccio per raffreddarsi.Tubi di centrifuga a 10.000 volte G per sette minuti. Utilizzando una pipetta, rimuovere il supernatante senza disturbare il pellet. Aggiungere nel tubo un cocktail di colorazione contenente 50 microlitri di PFA al quattro per cento e 15 microlitri di phalloidina e mescolare per sospendere ogni pellet.Incubare i tubi al buio a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Dopo l'incubazione, aggiungere un millilitro di tampone FACS a ciascun tubo e pipetta su e giù per mescolare. Tubi di rotazione nella centrifuga a 10.000 volte G per sette minuti.Rimuovere il supernatante senza disturbare il pellet. Per un uso immediato, sospendere ogni pellet in 400 microlitri di tampone FAX. Se si memorizza per un'analisi successiva, aggiungere 200 microlitri di tampone FAX e 200 microlitri di PFA al quattro per cento nel tubo e mescolare per sospendere.Utilizzando le condizioni di infezione nel breve trattamento con l'antibiotico gentamicina per eliminare l'Lm non interiorizzato, lo zero-point-one-five percento dell'Lm di tipo selvatico viene recuperato dopo un punto-cinque ore di co-incubazione con macrofagi coltivati. Nella successiva co-incubazione, c'è stato un aumento di quattro e sette punti-cinque volte nel recupero di Lm vitale, che rappresentano esclusivamente la proliferazione intracellulare. Un profilo comparabile è stato osservato per il ceppo Lm che possiede un prfA ipervirulento durante l'infezione iniziale, ma non tra i tre e i sei HPI.Quando il prfA è stato eliminato dal ceppo Lm, vi è una successiva riduzione del recupero del ceppo dopo una co-incubazione prolungata. Quando la gentamicina viene rimossa dai pozzi a sei HPI, l'Lm extracellulare può essere rilevato un'ora dopo sia per i ceppi di prfA di tipo selvatico che ipervirulento, ma non per il ceppo con prfA eliminato. I supporti sovrapposti sia ai macrofagi non infetti che a quelli infetti contenevano particolato a dispersione della luce, delle dimensioni di un batterio.Tuttavia, solo i supporti provenienti da macrofagi infetti possedevano segnali positivi gfp all'interno delle dimensioni gating. Un aumento dipendente dal tempo nella comparsa di Lm positivo alla falloidina è stato osservato con macrofagi infetti. Quando si placcano i macrofagi nel piatto di coltura tissutale da 48 po ', lasciare alcuni pozzi senza cellule.Questi pozzi di controllo senza cellule vengono quindi trattati esattamente allo stesso modo dei pozzi contenenti cellule, in termini di aggiunta dell'agente patogeno, antibiotici, ecc. per garantire che i segnali sperimentali dipendano dalla presenza di cellule ospiti. Analogamente agli esperimenti riportati nelle figure uno e tre, è possibile testare fattori patogeni o ospiti e o piccole molecole sul loro impatto sull'efflusso cellulare patogeno.

using-bacterial-pathogen-to-probe-for-cellular-organismic-level-host

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Un protocollo generale per lo studio di invasione delle cellule ospiti da un agente patogeno batterico, concentrandosi...

Invasione di cellule umane da un agente patogeno batterico

Questo video dimostra una tecnica di quantificazione in vitro per determinare l'infezione da Listeria monocytogenes dei macrofagi mediante il test dell'unità formante colonie. Le colonie batteriche sulla piastra di agar rappresentano la popolazione batterica intracellulare che sfugge al meccanismo di difesa dell'ospite e sopravvive all'interno dei macrofagi.

Quantificazione dell'infezione batterica nelle cellule ospiti mediante il saggio dell'unità formante colonia

Questo video dimostra una tecnica per valutare la capacità di Porphyromonas gingivalis, un batterio patogeno anaerobico, di aderire e invadere le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVECs). Dopo aver infettato le cellule ospiti con i batteri, le cellule ospiti vengono lisate per rilasciare sia i batteri aderiti che quelli internalizzati. Quando il lisato viene placcato in un mezzo appropriato, la presenza di colonie indica interazioni batteriche-cellule ospiti riuscite.

Un test di infezione batterica per lo studio delle interazioni batteri-cellule ospiti anaerobiche

Questa tecnica fornisce un metodo per raccogliere, normalizzare e quantificare la crescita intracellulare di batteri patogeni che sono pre-coltivate in cellule naturali ospiti protozoi prima di infezioni di cellule di mammifero. Questo metodo può essere modificato per accogliere una grande varietà di cellule ospiti per la fase di adescamento e tipi di cellule bersaglio.

Trattabili infezioni cellula di mammifero con protozoo-innescate batteri

Questo articolo si concentra sulla identificazione di alta fiducioso set di dati di interazione tra ospite e patogeno proteine ​​usando una combinazione dei due metodi ortogonali: lievito di doppio ibrido seguita da un saggio di interazione high-throughput in cellule di mammifero chiamato HT-GPCA.

Un approccio comparato alla caratterizzano il paesaggio di ospite-patogeno interazioni proteina-proteina

Listeria monocytogenes è un batterio patogeno Gram positivi frequentemente usato come modello importante per lo studio di parassitismo intracellulare. Imaging tardi L. monocytogenes fasi di infezione nel contesto di schermi piccole interferenti RNA permette per lo studio globale di vie cellulari necessarie per infezione batterica delle cellule ospiti bersaglio.

Imaging InlC secrezione per Indagare infezione Cellular dalla batterica patogeni<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Abbiamo sviluppato un protocollo veloce, sensibile e riproducibile per la profilazione dell'espressione genica dei patogeni durante un'infezione.

Profili di espressione genica di microbi che infettano utilizzare una piattaforma digitale di codificazione

Sono descritti due test per lo screening ad alto rendimento basato sulla microscopia dei fattori dell'ospite coinvolti nell'infezione da Brucella. Il test di ingresso rileva i fattori dell'ospite necessari per l'ingresso in Brucella e il test dell'endpoint quelli necessari per la replicazione intracellulare. Sebbene applicabile per approcci alternativi, lo screening dei siRNA nelle cellule HeLa viene utilizzato per illustrare i protocolli.

Saggi Microscopia-based per high-throughput screening dei fattori di accoglienza che partecipano<em&gt; Brucella</em&gt; L&#39;infezione di cellule HeLa

Qui presentiamo un elegante protocollo per la valutazione in vivo di vaccino efficacia e host le risposte immunitarie. Questo protocollo può essere adattato per i modelli di vaccino che studiano virale, batterica o parassitari patogeni.

Valutazione delle risposte ospite-patogeno e l'efficacia del vaccino nei topi

Qui, presentiamo un protocollo per profilare l'interazione tra ospite e agente patogeno durante l'infezione da proteomica a base di spettrometria di massa. Questo protocollo utilizza la quantificazione senza etichette per misurare i cambiamenti nell'abbondanza proteica sia dell'ospite (ad esempio, macrofagi) che dell'agente patogeno (ad esempio, Cryptococcus neoformans)in un singolo esperimento.

Flusso di lavoro proteomica quantitativa senza etichette per interazioni host-patogeno guidate dalla scoperta

Il rilevamento delle interazioni patogeno ospite-batterico basate sull'aderenza fenotipica utilizzando l'imaging di etichettatura a fluorescenza ad alto rendimento insieme a metodi di analisi statistica automatizzati consente una rapida valutazione delle potenziali interazioni batteriche con le cellule ospiti.

Rilevamento automatizzato e ad alto rendimento dell'aderenza batterica alle cellule ospiti

Scopri tecniche di saggi di infezione in vitro e in vivo per analizzare l'efflusso di patogeni intracellulari. Questi metodi valutano l'efficienza dell'efflusso e caratterizzano i patogeni post-efflusso.

Utilizzando un agente patogeno batterico alla sonda per le risposte cellulari e organismica-livello Host

Esplora altri video