Multiplexing focalizzato ad ultrasuoni stimolazione con microscopia di fluorescenza

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in meccanobiologia, come il modo in cui i campioni biologici rispondono alle forze meccaniche prodotte dalla stimolazione ecografica a bassa intensità. Il vantaggio principale di questa tecnica è che permette a uno sperimentalista di applicare in modo non invasivo forze meccaniche a un campione e misurare vari perimetri biologici in tempo reale. Per iniziare, praticare lentamente un foro di 12 millimetri nella parte inferiore di un piatto di coltura standard da 35 millimetri utilizzando un trapano a pressione verticale.

Una volta forato, rimuovere pezzi di plastica attaccati al fondo del piatto utilizzando una lama, per creare una superficie liscia sul lato esterno. Quindi, applicare un sottile strato di epossidico di grado marino o colla sulla superficie inferiore esterna del piatto. Sopra l'adesivo, posizionare un film di poliestere spesso due punti e cinque micron, premendo saldamente per assicurarsi che l'adesivo si diffonda uniformemente tra il film e la spessa superficie plastica.

Tirare delicatamente il film in modo centrifugo con le dita, per creare una superficie piana. Una volta asciugato l'adesivo, sciacquare brevemente il piatto inferiore in poliestere con il 95% di etanolo. Quindi, i raggi UV sterilizzano il piatto posizionandolo sotto una forte sorgente di eccitazione UV da 254 nanometri.

Regolare la durata e l'intensità per fornire una dose UV di circa 330 millijoule per centimetro quadrato. Successivamente, diluire una miscela proteica a matrice extracellulare disponibile in commercio con il mezzo di coltura desiderato con un rapporto da uno a 100. Lavorare sul ghiaccio per prevenire la polimerizzazione della matrice e applicare rapidamente 100 microlitri della miscela media sulla pellicola di poliestere.

Riposizionare il coperchio sul piatto per mantenere la sterilità. Una volta coperto, incubare le stoviglie di fondo in poliestere rivestite a matrice in una coltura cellulare, incubatore tamponato di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per sei-12 ore. Dopo l'incubazione, aspirare il mezzo in eccesso e seminare direttamente la superficie con le cellule alla densità desiderata.

Posizionare un serbatoio dell'acqua sotto l'obiettivo di un microscopio verticale. Quindi, utilizzando componenti optomeccanici disponibili in commercio, posizionare il supporto del campione tra l'obiettivo e il trasduttore. Assicurarsi che le parti mobili e gli attuatori delle fasi di traslazione siano all'esterno del serbatoio o sopra la linea dell'acqua per evitare danni causati dall'acqua.

Quindi, riempire il serbatoio con acqua deionizzata e degassata fino al piano orizzontale del portacampioni, prima di utilizzare il trasduttore ad immersione. Utilizzando componenti optomeccanici non canonici disponibili in commercio, assicurarsi che il trasduttore in posizione obliqua rispetto al percorso ottico. Ciò garantirà che tutte le onde riflesse vengano allontanate dal campione.

Regolare la frequenza del generatore di funzioni alla frequenza di picco nominale del trasduttore. Quindi, creare un impulso di tensione sinusoidale della durata desiderata e della frequenza di ripetizione, utilizzando la modalità burst del generatore di funzioni. Quindi, regolare la tensione da picco a picco in base al valore desiderato.

Assicurarsi che la durata dell'impulso sia inferiore al tempo trascorso tra due impulsi consecutivi. Collegare l'output del generatore di funzioni all'ingresso di un oscilloscopio. Utilizzare l'oscilloscopio per confermare che la forma d'onda corrisponde al segnale desiderato.

Quindi, collegare l'uscita del generatore di funzioni all'ingresso di una potenza di un amplificatore RF di dimensioni corretta. Utilizzando una sonda idrofonica che funziona con un intervallo di frequenza e un'intensità acustica compatibili con quella del trasduttore ad ultrasuoni, mettere accuratamente a fuoco la punta della sonda all'interno del campo visivo dell'obiettivo nella posizione del campione. Assicurarsi che sia la sonda che il trasduttore siano immersi nel bagno d'acqua ed eseguire un grossolano pre-allineamento del trasduttore posizionando visivamente il suo asse acustico verso la sonda idrofona.

Assicurarsi che la distanza tra i due corrisponda alla lunghezza focale del trasduttore. Non urtare la punta dell'idrofono con nessun oggetto fisico diverso dall'acqua, in quanto ciò altererà il suo rivestimento e influenzerà la misurazione. Quindi, collegare l'uscita dell'idrofono a uno degli ingressi del segnale dell'oscilloscopio.

Quindi, collegare il trigger di sincronizzazione dal generatore di funzioni a un altro ingresso oscilloscopio. Visualizzare entrambi i segnali contemporaneamente sull'oscilloscopio. Successivamente, guidare il trasduttore con pochi cicli ad ultrasuoni a basso ciclo di servizio e bassa ampiezza per evitare di danneggiare la sonda.

Verificare con il produttore dell'idrofono condizioni di funzionamento sicure per evitare di danneggiare la punta dell'idrofono. Regolare la manopola della divisione S in base al tempo di percorsa dell'ecografia dalla superficie del trasduttore all'idrofono. Cercare un segnale idrofono sull'oscilloscopio dopo il trigger di sincronizzazione.

Successivamente, azionare lentamente il trasduttore utilizzando uno stadio XYZ motorizzato o manuale. Posizionare il trasduttore nella posizione correlata al segnale idrofono massimo. Con il fascio ora allineato, misurare l'ampiezza da picco a picco dell'uscita dell'idrofono all'oscilloscopio per varie tensioni che guidano il trasduttore.

Assicurarsi di non superare il limite di pressione dell'idrofono. Sostituire il mezzo di coltura della cellula con il tampone di imaging desiderato contenente cinque micromolari di un colorante sensibile al calcio permeante alla cellula, come Fluo-4 AM. Quindi, incubare il piatto di coltura in un incubatore tamponato di anidride carbonica a 37 gradi Celsius per un'ora. Dopo l'incubazione, lavare accuratamente le cellule con lo stesso tampone privo di colorante.

Quindi, posizionare il piatto nel portacampioni. Eccitare le cellule usando l'illuminazione a luce blu a 490 nanometri. Regolare l'intensità di eccitazione e l'esposizione della fotocamera per evitare un eccessivo sbiancamento o saturazione dei pixel.

Eseguire l'imaging time-lapse utilizzando un obiettivo di immersione con una lunga distanza di lavoro per una migliore qualità dell'immagine e per ridurre i riflessi indesiderati. Qui, le cellule di glioblastoma sono mostrate su pellicola di poliestere rivestita di matrice extracellulare in un mezzo di coltura standard. Queste cellule sono state incubate con un reporter fluorescente sensibile al calcio.

In questa immagine, i punti rossi rappresentano singole celle fluorescenti, identificate utilizzando un software di elaborazione delle immagini. Dopo la stimolazione per 10 secondi con ultrasuoni, sono state visualizzate robuste elevazioni di calcio in molte regioni di interesse. Il numero di regioni di interesse attivate viene mostrato qui nel tempo.

A seguito dell'attivazione di 10 secondi con ultrasuoni, circa il 70% delle regioni è stato trovato al di sopra dei valori soglia definiti dall'utente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di allineare il fascio ultrasonico prima di eseguire la misurazione della fluorescenza.