Name: Unanalisi di uccisione di sferoide dalle cellule di T di auto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-12-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Scopri come valutare la citotossicità delle cellule CAR T contro sferoidi tumorali 3D in tempo reale. Questo metodo combina imaging avanzato e saggi immunologici per studiare l'efficacia delle terapie immunologiche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato supportato dal Norwegian Research Council sotto sovvenzioni #244388, #254817 e #284983; l'associazione del cancro norvegese (n. 6829007); Il norvegese salute regione sud-est sotto Grant n. 17/00264-6 e #2016006.

1. generazione di sferoidi dalla linea cellulare di cancro colorettale
<ol><li>Monostrati di cellule umane lavare HCT 116 (stabilmente transduced per esprimere Cluster di differenziazione 19 (CD19) e proteina di fluorescenza verde (GFP)) con fosfato tampone salino (PBS; 5 mL per un 25 cm2 o 10 mL per un pallone da2 di 75 cm). Aggiungere la tripsina (0,5 mL per un 25 cm2 o 1 mL per un pallone da2 di 75 cm) e incubare le cellule a 37 ° C per 5 min.</li>
	<li>Controllare il distacco delle cellule al microscopio e neutralizzare enzima di dissociazione della cellula con terreno di Roswell Park Memorial Institute 160 completo (RPMI 1640) (RPMI 1640 + 10% FCS + gentamicina; 10 mL per un 25 cm2 o 20 mL per un pallone da2 di 75 cm).</li>
	<li>Sospensione cellulare Centrifugare a 500 g per 5 min, rimuovere il surnatante con una pipetta e risospendere pipettando su e giù parecchie volte con 5 mL di terreno completo RPM1 1640.</li>
	<li>Contare le celle utilizzando esclusione in Trypan blue su un contatore di cellule compatibili.</li>
	<li>Sospensione cellulare Centrifugare a 500 g per 5 min, rimuovere il surnatante con una pipetta e risospendere in medium RPMI per ottenere 5 x 103 cellule/mL.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare ad un serbatoio sterile e dispensare 200 µ l/pozzetto in un 96-pozzetto rotondo piastre inferiori usando una pipetta multicanale.</li>
	<li>Trasferire la piastra all'apparato di imaging automatizzato all'interno di un'incubatrice (37 ° C, 5% CO2, 95% di umidità).</li>
	<li>Accedere al software di acquisizione, selezionare Pianificazione per acquisire | Apri Aggiungi nave | Scansione il programma | Creare nave: nuovo.</li>
	<li>
Selezionare il tipo di scansione: sferoide. Selezionare i canali di interesse: fase + campo chiaro (per seguire la crescita di sferoidi), verde (per seguire il segnale del tumore, tempo di acquisizione 300 ms) e rosso (per seguire l'apoptosi, acquisizione tempo 400 ms).
	<ol>
<li>Selezionare l'ingrandimento desiderato: 10x.</li>
		<li>Scegli il modello di piastra e la sua posizione nel cassetto. Selezionare la posizione dei pozzi all'immagine. Immettere la descrizione dell'esperimento: nome, tipo di celle, numero di celle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Per la configurazione di analisi, selezionare Rinviare l'analisi fino a più tardi. Fare clic con il pulsante destro sulla timeline e selezionare opzione di Impostare l'intervallo del gruppo scansione selezionata e impostare aggiungere scansioni ogni a 4 h e per un totale di 24 h. impostare l'ora di partenza desiderata (almeno 1 h dopo incubazione nell'apparato imaging automatizzato).</li>
	<li>
Verifica ogni 2 giorni per la crescita di sferoidi accedendo al software di imaging.
	<ol>
<li>Scegliere l'opzione Vista recenti scansioni e fare doppio clic sull'esperimento desiderata. Selezionare il campo chiaro nel pannello canali immagine e quindi utilizzare lo strumento di caratteristiche di immagine di misura per misurare il diametro di sferoidi. Ci vogliono 6 giorni per uno sferoide di raggiungere la dimensione desiderata: 0,5 mm di diametro. Aggiungere 50 µ l di terreno RPMI completo per pozzetto al giorno 4 per limitare l'effetto di evaporazione medio.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. generazione di cellule CD19 auto T
<ol><li>
Espansione di cellule T auto CD19 Nota: L'espressione stabile di cellule CD19 auto T è stata acquisita da trasduzione retrovirale di massa del donatore sano PBMCs come descritto in precedenza16. Il costrutto retrovirale codificante per CD19 auto è una macchina di seconda generazione e consiste di fmc63 scFv catena, CD8 cerniera e dominio transmembrana, un dominio costimolatorie 4-1BB e, infine, un dominio CD3ζ.<ol>
<li>Per espandere, cultura il trasdotte T cellule in presenza di anti-CD3/28 biglie magnetiche con una cella a rapporto perlina di 1:1 per 10 – 11 giorni. Durante l'espansione, le cellule sono in sostanza completa (X-VIVO 15, 5% sostituzione del siero e 100 U/mL ricombinante umano il-2). Nota: La densità ideale per un'espansione efficiente è 1 a 2 x 106 cellule/mL. A seconda del numero iniziale, le cellule possono essere espansa in boccette (25cm2 beute a 20 mL, 75 cm2 beute a 40 mL di volume totale) in un'incubatrice di coltura cellulare (37 ° C, 5% CO2, 95% di umidità).</li>
		<li>Come un gruppo di controllo negativo per i seguenti saggi, comprendono non trasdotte PBMCs (verrà denominata come Mock) del protocollo di espansione parallela alle cellule T auto CD19.</li>
		<li>Il giorno 3 in poi, aggiungete mezzo fresco ogni giorno e dividere le celle in matracci di cultura più se necessario.</li>
		<li>Giorno 10 – 11, cellule di centrifugare a 500 x g per 5 min, rimuovere il surnatante e combinare tutte le cellule in una provetta da 50 mL e risospendere le cellule in ~ 30 mL di fresco multimediale completo.</li>
		<li>Posizionare il tubo da 50 mL contenente le celle di sedimento su un supporto magnetico per separare i branelli magnetici da terreno di coltura.</li>
		<li>Attendere 2-3 min per le perline per raccogliere sul lato del tubo.</li>
		<li>Rimuovere il terreno di coltura con una pipetta e trasferirlo in una nuova provetta senza toccare le zone di raccolta biglie magnetiche.</li>
		<li>Ripetere i passaggi per quanto riguarda la rimozione di tallone (2.1.5–2.1.7) ancora una volta a limitare il numero di perle in terreno di coltura finale.</li>
		<li>Risospendere e contare le celle, regolare la densità di 1 a 2 x 106 cellule/mL in terreno completo.</li>
		<li>Le cellule per almeno 4 ore fino a una notte di riposo. Quindi direttamente congelarli giù a-80 ° C e trasferire le fiale a un serbatoio di azoto liquido il giorno seguente per l'archiviazione a lungo termine. In alternativa, uno può prolungare il resto fino a una notte per un uso immediato.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Controllo di espressione di CD19 auto su cellule T primarie
	<ol>
<li>Contare il numero di cellule T espanse come i numeri potrebbero variare leggermente dopo una notte cultura o moderatamente dopo congelamento/scongelamento.</li>
		<li>Trasferire 5 x 105 celle da entrambi auto CD19 e Mock cellule T primarie per separare i tubi di citometria a flusso.</li>
		<li>Lavare le cellule con 200 μL di tampone di flusso (2% FBS in PBS) e centrifugare le provette a 500 x g per 5 min, ripetere i passaggi di lavaggio per sbarazzarsi di eventuali artefatti causati da terreno di coltura.</li>
		<li>Preparare l'anticorpo primario (biotina Goat Anti-Mouse IgG, F(ab') ₂ frammento specifico) effettuando la diluizione 1: 200 nel Buffer del flusso.</li>
		<li>Risospendere le cellule in 100 μL di miscela di anticorpi per tubo e incubare in ghiaccio per 15 min. Ripetere il passaggio precedente di lavaggio due volte per rimuovere l'anticorpo in eccesso.</li>
		<li>Preparare l'anticorpo secondario (streptavidina-PE) come diluizione di 1: 400 nel Buffer del flusso.</li>
		<li>Risospendere le cellule in 100 μL di miscela di anticorpi per tubo e incubare in ghiaccio per 15 min. Ripetere il passaggio precedente di lavaggio due volte per sbarazzarsi dell'anticorpo in eccesso.</li>
		<li>Risospendere le cellule in 200 μL di tampone di flusso per tubo e analizzarlo su un citometro a flusso.</li>
		<li>Le cellule di T di Mock uso per impostare il cancello positivo e negativo e analizzare CD19 auto trasdotte cellule T di conseguenza.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 3D tumore sferoide uccisione Assay
<ol><li>
Dopo 6 giorni o una volta sferoidi raggiunge la dimensione desiderata, rimuovere la piastra dall'incubatrice. Usando una pipetta multicanale, rimuovere delicatamente 100 µ l/pozzetto di sostanza RMPI 1640 completa delle placche di sferoide.
	<ol>
<li>Per questo passaggio, angolo le punte verso l'interno muro della piastra 96 pozzetti, evitando il contatto con il fondo del pozzo al fine di ridurre al minimo la dispersione di sferoidi. Rimanente volume dovrebbe essere circa 100 µ l.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare una soluzione di 1: 200 di Annexin V rosso mescolando 50 µ l di Annexin V rosso con 9,95 mL di terreno completo RPMI 1640.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l/pozzetto di soluzione di Annexin V rosso 1: 200.</li>
	<li>Trasferire la piastra in un incubatore (37° C, 5% CO2, 95% di umidità) per 15 min.</li>
	<li>Raccogliere le cellule trasdotte auto CD19 T in una provetta da 15 mL e centrifugare a 500 x g per 5 min, rimuovere il surnatante con una pipetta e risospendere pipettando su e giù più volte con 2 mL di terreno completo RPM1 1640.</li>
	<li>Contare le celle utilizzando esclusione in Trypan blue su un contatore di cellule compatibili.</li>
	<li>Sospensione cellulare Centrifugare a 500 g per 5 min, rimuovere il surnatante con una pipetta e risospendere in medium RPMI per ottenere 2 x 105 cellule/mL.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare ad un serbatoio sterile e pipettare 100 µ l/pozzetto in un 96 pozzetti tondo piastra sferoide inferiore usando una pipetta multicanale.</li>
	<li>Trasferire la piastra indietro all'apparato di imaging automatizzato all'interno di un'incubatrice (37 ° C, 5% CO2, 95% di umidità).</li>
	<li>
Accedere al software di acquisizione, selezionare pianificazione per acquisire.
	<ol>
<li>Pulsante destro del mouse sulla timeline scansione e selezionare Edit Timeline. Pulsante destro del mouse sul gruppo di scansione ed eliminarlo. Pulsante destro del mouse sulla timeline e selezionare opzione di Impostare l'intervallo del gruppo scansione selezionata e impostare aggiungere scansioni ogni a 1,5 h e per un totale di 24 h.</li>
		<li>Impostare l'ora di partenza desiderata (almeno 1 h dopo incubazione nell'apparato imaging automatizzato). Selezionare Salva pianificazione scansioni.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. analisi di immagine automatizzato
<ol><li>Accedere al acquisizione, scegliere l'opzione Vista recente analizza e seleziona l'opzione Launch Analysis . Seleziona Crea nuova definizione di analisi | Analisi tipo: sferoide. Spuntare i canali dell'immagine per analizzare (fase + campo chiaro, verde e rosso).</li>
	<li>Selezionare almeno 10 immagini rappresentative: in genere, 1 per ogni condizione e almeno 3 punti di tempo (inizio, metà e fine dell'acquisizione).</li>
	<li>Anteprima l'impostazione predefinita analizzare procedura nello stack di tutta l'immagine.</li>
	<li>Modificare i parametri per campo chiaro maschera. Parametri tipici sono: sensibilità 10, foro riempimento 1.000 µm2min area 1.000 µm2. Anteprima nello stack di tutta l'immagine e verificare che i parametri selezionati rilevare sferoidi con precisione.</li>
	<li>Modificare i parametri per maschera verde (GFP). Parametri tipici sono: segmentazione del cappello superiore con raggio 200 µm e soglia 3 GCU, bordo spaccato fuori, riempimento dei fori 5.000 µm2, regola dimensione -2 pixel, Area min 3.000 µm2. Anteprima nello stack di tutta l'immagine e verificare che i parametri selezionati rilevare sferoidi con precisione.</li>
	<li>Modificare i parametri per maschera rossa (Annessina V). Parametri tipici sono: segmentazione del cappello superiore con raggio 150 µm e soglia 2 GCU, bordo spaccato fuori, riempimento dei fori 5.000 µm2, regola dimensione di 0 pixel, Area min 1.000 µm2. Anteprima nello stack di tutta l'immagine e verificare che i parametri selezionati rilevare sferoidi con precisione.</li>
	<li>
Lanciare l'analizzatore.
	<ol>
<li>Una volta fatto l'analisi, estrarre la misura di interesse. Selezionare il file analizzato e quindi l'opzione Grafico metriche . Selezionare i parametri di interesse, la scansione e il pozzo. In genere, totale intensità rosso e verde all'interno di confini campo chiaro danno le misurazioni più accurate limitando il segnale di fluorescenza per i confini di sferoidi determinata dalla maschera di campo chiaro (Figura 3). Estrarre metriche selezionate in vari formato di file facendo clic su "Esporta dati".</li>
	</ol>
</li>
	<li>Procedere all'estrazione delle immagini e dei filmati selezionando il file analizzato e quindi selezionare l'opzione Esporta immagini e filmati . Due opzioni sono disponibili, sia come "visualizzare" recuperare immagini e filmati come visto sul software di imaging (immagini solitamente composite), entrambi "come memorizzato" per recuperare i dati grezzi per analisi esterna tramite software di terze parti.</li>
</ol>

<ol><li>Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+in+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 365 (8), 725-733 (2011).</li>
<li>Kochenderfer, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+B-lineage+cells+and+regression+of+lymphoma+in+a+patient+treated+with+autologous+T+cells+genetically+engineered+to+recognize+CD19%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Eradication of B-lineage cells and regression of lymphoma in a patient treated with autologous T cells genetically engineered to recognize CD19.</a> Blood. 116 (20), 4099-4102 (2010).</li>
<li>Brentjens, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD19-targeted+T+cells+rapidly+induce+molecular+remissions+in+adults+with+chemotherapy-refractory+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">CD19-targeted T cells rapidly induce molecular remissions in adults with chemotherapy-refractory acute lymphoblastic leukemia.</a> Science Translational Medicine. 5 (177), 177ra138(2013).</li>
<li>Grupp, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chimeric+antigen+receptor-modified+T+cells+for+acute+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Chimeric antigen receptor-modified T cells for acute lymphoid leukemia.</a> New England Journal of Medicine. 368 (16), 1509-1518 (2013).</li>
<li>D'Aloia, M. M., Zizzari, I. G., Sacchetti, B., Pierelli, L., Alimandi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CAR-T+cells%3A+the+long+and+winding+road+to+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">CAR-T cells: the long and winding road to solid tumors.</a> Cell Death & Disease. 9 (3), 282(2018).</li>
<li>Amann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+innovative+3D+cell+culture+system+to+study+tumour--stroma+interactions+in+non-small+cell+lung+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Development of an innovative 3D cell culture system to study tumour--stroma interactions in non-small cell lung cancer cells.</a> PLoS One. 9 (3), e92511(2014).</li>
<li>Enzerink, A., Salmenpera, P., Kankuri, E., Vaheri, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+of+fibroblasts+induces+proinflammatory+chemokine+secretion+promoting+leukocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Immunology%22%5BJournal%5D)">Clustering of fibroblasts induces proinflammatory chemokine secretion promoting leukocyte migration.</a> Molecular Immunology. 46 (8-9), 1787-1795 (2009).</li>
<li>Birgersdotter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+culturing+of+the+Hodgkin+lymphoma+cell-line+L1236+induces+a+HL+tissue-like+gene+expression+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+%26+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional culturing of the Hodgkin lymphoma cell-line L1236 induces a HL tissue-like gene expression pattern.</a> Leukemia & Lymphoma. 48 (10), 2042-2053 (2007).</li>
<li>Pickl, M., Ries, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+3D+and+2D+tumor+models+reveals+enhanced+HER2+activation+in+3D+associated+with+an+increased+response+to+trastuzumab%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Comparison of 3D and 2D tumor models reveals enhanced HER2 activation in 3D associated with an increased response to trastuzumab.</a> Oncogene. 28 (3), 461-468 (2009).</li>
<li>Galateanu, B., et al. <a target="_blank" href="https://www.spandidos-publications.com/10.3892/ijo.2016.3467?text=abstract">Impact of multicellular tumor spheroids as an in vivo-like tumor model on anticancer drug response.</a> International Journal of Oncology. 48 (6), 2295-2302 (2016).</li>
<li>Shaheen, S., Ahmed, M., Lorenzi, F., Nateri, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-Formation+%28Colonosphere%29+Assay+for+in+Vitro+Assessment+and+Expansion+of+Stem+Cells+in+Colon+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reviews+and+Reports%22%5BJournal%5D)">Spheroid-Formation (Colonosphere) Assay for in Vitro Assessment and Expansion of Stem Cells in Colon Cancer.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 12 (4), 492-499 (2016).</li>
<li>Izraely, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Metastatic+Microenvironment%3A+Melanoma-Microglia+Cross-Talk+Promotes+the+Malignant+Phenotype+of+Melanoma+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">The Metastatic Microenvironment: Melanoma-Microglia Cross-Talk Promotes the Malignant Phenotype of Melanoma Cells.</a> International Journal of Cancer. , (2018).</li>
<li>Khawar, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+Dimensional+Mixed-Cell+Spheroids+Mimic+Stroma-Mediated+Chemoresistance+and+Invasive+Migration+in+hepatocellular+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Three Dimensional Mixed-Cell Spheroids Mimic Stroma-Mediated Chemoresistance and Invasive Migration in hepatocellular carcinoma.</a> Neoplasia. 20 (8), 800-812 (2018).</li>
<li>Merker, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+and+characterization+of+ErbB2-CAR-engineered+cytokine-induced+killer+cells+for+the+treatment+of+high-risk+soft+tissue+sarcoma+in+children%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Generation and characterization of ErbB2-CAR-engineered cytokine-induced killer cells for the treatment of high-risk soft tissue sarcoma in children.</a> Oncotarget. 8 (39), 66137-66153 (2017).</li>
<li>Mittler, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Content+Monitoring+of+Drug+Effects+in+a+3D+Spheroid+Model%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Oncolology%22%5BJournal%5D)">High-Content Monitoring of Drug Effects in a 3D Spheroid Model.</a> Frontiers in Oncolology. 7, 293(2017).</li>
<li>X Tadesse, F. G., Mensali, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unpredicted+phenotypes+of+two+mutants+of+the+TcR+DMF5%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Unpredicted phenotypes of two mutants of the TcR DMF5.</a> Journal of Immunological Methods. 425, 37-44 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

L'uso di sferoidi come strumento innovativo per convalidare il trattamento del cancro futuro è diventato un campo di crescente interesse negli ultimi anni. Sferoidi rappresentano un passaggio intermedio tra il classico 2D analisi in vitro e valutazione in vivo. Il metodo ulteriormente tiene un sacco di promesse per quanto riguarda la loro potenza in termini di che imita il micro-ambiente del tumore così come gene profiling7. Il protocollo presentato in questa pubblicazione è stato adattato da sere...

Trasferimento adottivo di cellule (ACT) rappresenta il trattamento di cancro di generazione successivo. Essa si basa sull'iniezione di cellule effettrici (T - o cellule NK) in un paziente. Queste cellule possono essere geneticamente modificate con un recettore che li guiderà alla loro destinazione, il tumore e distruggerlo. Recentemente questo approccio è stato indicato per essere fattibile quando un recettore chimerico antigene (auto) diretto contro il marcatore di cellule B CD19 è stato introdotto nelle cellule del paziente T per uccidere il suo cancro1. Nel caso di auto, che è un recettore artificiale, il disegno consiste di frammenti anticorpali specifici, l'antigene vincolante dominio ridotto a un frammento di variabile entità designata a singola catena (scFv), legata ai domini di segnalazione del T-cell. Anche se ci sono parecchi disegni, le versioni più comunemente usate di cui come seconda generazione auto disegni, costituito da CD3z per la segnalazione di TCR e un dominio di costimolazione (CD28, 4-1BB, OX40, ecc.) 1 , 2. il campo di immunoterapia diretto la maggior parte della sua attenzione a questa nuova forma di atto quando CD19 auto-T cellule trattate efficacemente numerosi pazienti con le malignità delle cellule di B3,4. Dopo questo successo, i ricercatori hanno cercarono di sfruttare i disegni simili prendendo di mira altri epitopi per tumori solidi con successo limitato. Purtroppo, la scarsità di antigeni specifici del tumore e le più severe microambienti di tumore resi auto T cellule meno efficace nei confronti di tumori solidi5.
Attualmente, le strategie di convalida più comunemente usato in vitro si basano su sistemi bidimensionali (2D) che interessano solo un frammento delle sfide già citato tumore solido. Classicamente, 2D in vitro sistemi coinvolgono una miscela delle cellule T auto e linee cellulari del cancro di destinazione come strati monomolecolari per valutare la funzionalità e la specificità di queste cellule effettrici. Anche se queste strategie sono parti importanti e vitali degli studi, non prendono in considerazione la complessa morfologia e struttura tridimensionale (3D) del cancro cellule6. Le cellule tumorali coltivate in sistemi 3D, definito come sferoidi, acquisiscono nuovi tratti fenotipici attraverso cambiamenti nel gene espressione profilo7, che possa influenzare il riconoscimento di cellule effettrici reindirizzata. Birgersdotter e colleghi hanno dimostrato che una linea cellulare di linfoma (HL) Hodgkin quando coltivata solo in un modello 3D cultura acquisisce un profilo di espressione genica che è simile al tumore primario campioni8. Di conseguenza, sferoidi o 3D simile cultura offerta di metodologie più pertinenti in modelli in vitro al contrario di sistemi 2D standard. Tali sistemi sono anche simili a studi in vivo, che sono visti come il passo finale nel processo di convalida di una determinata macchina. Considerando che i sistemi 2D non riescono a imitare la morfologia dei cluster di cancro, sferoidi offrono formazioni simili per valutare la funzionalità delle cellule di T auto prima di modelli in vivo. In uno studio, Pickl et al. identificato che un modello di sferoide del recettore del fattore di crescita epidermico umano (HER2) che overexpressing le cellule tumorali hanno dimostrato profili simili segnalazione a modelli in vivo9. Questo ulteriore sostiene che sferoidi offrono più pertinenti e close-in vivo valutazione delle cellule di T di auto. Inoltre, convalida di auto T-cellula contro sferoidi potrebbe aiutare valutare la loro efficacia più criticamente e impedire alcuni dei disegni di trasferirsi in vivo gli studi prematuramente10; contribuendo in tal modo, alla ricerca eticamente interessato sacrificando meno animali. Inoltre, protocolli utilizzando sferoidi non sono più costosi rispetto ai classici sistemi 2D e molto più veloce rispetto alla classica in vivo studi. Presi insieme, si può prevedere che l'inclusione degli studi sferoide diventerà presto la pratica standard per collegare gli studi in vitro e in vivo.
Qui, presentiamo la preparazione di sferoidi dalla linea cellulare del cancro del colon HCT 116. Questa linea cellulare è stata modificata per esprimere la molecola CD19 umana rendono sensibile ai linfociti CD19 auto e fornire una chiara valutazione dell'uccisione mediante un costrutto auto clinicamente validato.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>D8537-500ML</td><<td>strong>Numero di lotto: RNBG7037</td></tr><tr><td>75 cm&sup2; palloni per area di crescita</td><td>VWR</td><td>430639</td><td>Numero di lotto: 2218002</td></tr><tr><td>75 cm&sup2; palloni per area di crescita</td><td>VWR</td><td>734-2705</td><td>Numero di lotto: 3718006</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>SIGM-ALDRICH</td><td>T3924-100ml</td><td>Numero di lotto: SLBTO777</td></tr><tr><td>RPMI 1640 med L-glutammina, 10 x 500 mL</td><td>Life Technology (Gibco)</td><td>21875-091</td><td>Numero di lotto: 1926384</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>10500064</td><td>Numero di lotto: 08Q3066K</td></tr><tr><td>Gentamicina</td><td>Thermo Fischer</td><td>15750060</td><td>Numero di lotto: 1904924A</td></tr><tr><td>Soluzione blu di tripano, 0,4%</td> <td>Thermo Fischer</td><td>15250061</td><td>Numero di lotto: 1886513</td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti, fondo rotondo</td><td>VWR</td><td>734-1797</td><td>Numero di lotto: 33117036</td></tr><tr><td>Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28</td><td>Thermo Fischer</td><td>11132D-X-VIVO</td><td></td></tr> <tr><td>15 con gentamicina L-Gln, rosso fenolo, 1 L</td><td>BioNordika</td><td>BE02-060Q</td><td>Numero di lotto: 8MB036</td></tr><tr><td>CTS Sostituzione del siero di cellule immunitarie</td><td>Thermo Fischer</td><td>A2596102</td><td>Numero di lotto: 1939319</td></tr><tr><td>IL-2 Proleukin</td><td>Novartis</td><td></td><td>Numero di lotto: 505938M</td></tr><tr><td>IncuCyte Annexin V Red Reagent</td><td>Essen Bioscience</td><td>4641</td><td>Numero di lotto: 17A1025-122117</td></tr><tr><td>Serbatoio reagente</td><td>VWR</td><td>89094-672<</td><td>strong>Numero di lotto: 89094-672</td></tr><tr><td>Provette da 15 mL</td><td>VWR</td><td>734-1867</td><td>Numero di lotto: 19317044</td></tr><tr><td>anti-umano CD19-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>555413</td><td>Numero di lotto: 4016990 RRID: AB_395813</td></tr><tr><td>Biotina-SP (spaziatore lungo) AffiniPure F(ab')2 Frammento di capra Anti-topo IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>115-066-072</td><td>Numero di lotto: 129474: RRID: AB_2338583</td></tr><tr><td>Streptavidin-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>554061</td><td>Numero di lotto: 5191579: RRID: </forte> AB_10053328</td></tr><tr><td>HCT 116 Linea di carcinoma colorettale</td><td>ATCC</td><td>CCL-247-Incucyte</td><td></td></tr> <tr><td>S3</td><td>Essen Bioscience</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un'analisi di uccisione di sferoide dalle cellule di t di auto

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

L'immunoterapia è diventata un campo di crescente interesse nella lotta contro il cancro altrimenti intrattabile. Tra tutti i metodi immunotherapeutic, recettore chimerico antigene (auto) Reindirizzamento cellule T ottenute i risultati più spettacolari, in particolare con la leucemia linfoblastica acuta B pediatrica (B-ALL). Metodi di convalida classica delle cellule di T auto si basano sull'uso di specificità e test di funzionalità delle cellule T auto contro le cellule bersaglio in sospensione e in modelli di xenotrapianto. Purtroppo, le osservazioni fatte in vitro spesso sono disaccoppiate dai risultati ottenuti in vivo e un sacco di fatica e animali potrebbe essere risparmiato con l'aggiunta di un altro passo: l'uso della cultura 3D. La produzione di sferoidi fuori potenziali cellule bersaglio che imitano la struttura 3D delle cellule del tumore, quando essi sono innestate nel modello animale rappresenta l'alternativa ideale. Qui, segnaliamo un metodo conveniente, affidabile e facile da produrre sferoidi da una linea cellulare colorettale trasdotte come uno strumento di convalida per la terapia cellulare adottiva (esemplificato qui dalle cellule di T auto CD19). Questo metodo è accoppiato con un avanzato sistema di imaging dal vivo che possa seguire la crescita della sferoide, effettrici cellule apoptosi delle cellule del tumore e citotossicità.

Come si può vedere nella Figura 1, è fondamentale controllare tramite flusso cytometry il livello di espressione di CD19 auto sulle cellule di T (Figura 1A) e il livello di CD19 su linee cellulari tumorali di HCT116 (Figura 1B). Figura 2 esemplifica il risultato di un esperimento tipico sferoide. L'apparato di imaging automatizzato prende le immagini in quattro diversi c...

Questo protocollo è progettato per valutare la citotossicità T-cellula (auto T-cellula) reindirizzata immunoterapia contro le cellule cancerose strutturate 3D (sferoidi) in tempo reale.

Un'analisi di uccisione di sferoide dalle cellule di T di auto

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

Questo metodo può aiutare a rispondere alla domanda chiave nel campo dell'immunoterapia sulla valutazione della citotossicità delle cellule immunitarie contro le cellule tumorali della struttura 3D. I principali vantaggi di questo metodo sono che è semplice e combina una tecnologia di imaging avanzata e un saggio immunologico sensibile. Inizia lavando la linea cellulare del cancro colorettale di interesse con cinque millilitri di PBS e rimuovendo le cellule dal fondo del pallone con 0,5 millilitri di tripside per cinque minuti a 37 gradi Celsius.Dopo aver confermato il distacco al microscopio, neutralizzare l'enzima di dissociazione cellulare con 10 millilitri di mezzo completo e raccogliere le cellule per centrifugazione. Resostigliere il pellet in cinque millilitri di mezzo fresco completo per il conteggio e rimosogliere le cellule a una concentrazione di 1,5 volte 10 alla terza parte per millilitro. Quindi seminare 200 microlitri di cellule in ogni pozzo di piastra inferiore rotonda da 96 po 'e posizionare la piastra in un apparato di imaging automatizzato all'interno di un incubatore Celsius di 37 gradi con 5%CO2 e 95% di umidità.Accedere al software di acquisizione dell'apparecchio e selezionare Pianifica per acquisire, Lanciare Aggiungi nave, Scansione nei tempi previsti e Crea nave nuova. Selezionare quindi il tipo di scansione Sferoide e selezionare i canali di interesse appropriati per il campo luminoso e la fluorescenza. Impostare l'ingrandimento su 10 volte e selezionare il modello di piastra e la sua posizione all'interno del cassetto dell'apparato di imaging.Selezionare la posizione dei pozzi da imageare e immettere la descrizione dell'esperimento, inclusi il nome, il tipo di celle e il numero di celle. Per l'impostazione dell'analisi, selezionare Rinvia analisi fino a un secondo momento, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sequenza temporale e selezionare Imposta intervallo gruppo di scansione selezionato e impostare Aggiungi scansioni ogni quattro ore e Per un totale di 24 ore. Quindi impostare l'ora di inizio su almeno un'ora dopo l'incubazione nell'apparato di imaging automatizzato.Per controllare l'avanzamento della crescita dello sferoide, ogni due giorni accedere al software di imaging e selezionare Visualizza scansioni recenti. Fate doppio clic sull'esperimento di interesse e selezionate Brightfield nel pannello Canali immagine. Quindi utilizzare lo strumento Measure Image Features per misurare il diametro degli sferoidi, aggiungendo 50 microlitri di mezzo completo per pozzo al quarto giorno per limitare eventuali effetti di evaporazione media.Quando gli sferoidi raggiungono le dimensioni sperimentali appropriate, inclinare attentamente la piastra e utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere delicatamente 150 microlitri di mezzo completo da ogni pozzo senza disturbare gli sferoidi. Successivamente, sostituire il mezzo scartato con 50 microlitri di una soluzione da uno a 200 di Annexin V Red e posizionare la piastra in un incubatore di coltura cellulare per 15 minuti. Centrifugare le celle CAR CD19 T trasdotto in un tubo conico da 15 millilitri e rimosogliere il pellet in due millilitri di mezzo completo.Dopo il conteggio, diluire le cellule a due volte 10 alla quinta colonna per millilitro di concentrazione media completa. Quindi aggiungere 100 microlitri di cellule CAR CD19 T a ciascun pozzo contenente sferoide e riportare la piastra all'apparato di imaging automatizzato. Nel software di acquisizione selezionare Pianifica per acquisire e fare clic con il pulsante destro del mouse sulla sequenza temporale di scansione.Selezionare Modifica sequenza temporale e fare clic con il pulsante destro del mouse sul gruppo di analisi per eliminarlo. Fare di nuovo clic con il pulsante destro del mouse sulla sequenza temporale e selezionare Imposta intervallo gruppo di scansione selezionato e impostare Aggiungi scansioni ogni 1 ora e mezza e Per un totale di 24 ore. Quindi impostare l'ora di inizio dell'imaging su almeno un'ora dopo l'inizio dell'incubazione nell'apparato di imaging automatico e selezionare Salva scansioni programmate.Per l'analisi automatica delle immagini, nel software di scansione selezionare Visualizza scansioni recenti e Analisi di avvio. Selezionate Crea nuova definizione analisi (Create New Analysis Definition) e tipo di analisi Sferoide (Sferroid) e impostate i canali immagine da analizzare. Seleziona almeno 10 immagini rappresentative e visualizza in anteprima la procedura di analisi predefinita sull'intero stack di immagini.Modificate i parametri per la maschera a campo luminoso e visualizzate in anteprima lo stack di immagini, confermando che i parametri selezionati rilevano accuratamente gli sferoidi. Modificate i parametri per la maschera verde e visualizzate in anteprima lo stack di immagini per verificare che i parametri selezionati rilevino accuratamente gli sferoidi. Modificate i parametri per la maschera rossa e visualizzate in anteprima lo stack di immagini per verificare che i parametri selezionati rilevino accuratamente gli sferoidi.Fai attenzione a ottenere il miglior segnale rispetto al rumore e alla sensibilità rispetto ai rapporti di specificità, tenendo presente che non sarai in grado di trovare una serie di parametri che permetteranno di catturare ogni evento in ogni momento. Quindi avviare l'analizzatore. Al termine dell'analisi, estrarre la misurazione dell'interesse e selezionare il file analizzato e l'opzione metriche del grafico.Seleziona le metriche di interesse, la scansione e il pozzo. Fare clic su Esporta dati per estrarre le metriche selezionate in diversi formati di file. Quindi, per estrarre le immagini, selezionare il file analizzato e selezionare Esporta immagini e filmati.L'espressione CD19 CAR sulle cellule T trasdotto e l'espressione CD19 sulle cellule tumorali colorettali trasdotto possono essere confermate dalla citometria a flusso. Qui, si può osservare il risultato di un tipico esperimento sferoide. A differenza delle cellule T finte, le cellule CAR T CD19 sono in grado di uccidere specificamente gli sferoidi derivati dalla linea delle cellule tumorali colorettali, diminuendo notevolmente il numero di cellule tumorali vive.Il monitoraggio dell'evoluzione dei segnali verdi e rossi totali all'interno dei confini dello sferoide nel tempo rivela che poco dopo l'iniezione cellulare CAR T CD19, la dimensione degli sferoidi si restringe rapidamente man mano che il segnale di apoptosi aumenta rapidamente. Seguendo questa procedura, altri metodi come test di tossicità, test di migrazione cellulare o misurazioni della struttura sferoide possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive rispettivamente su screening farmacologico, motilità delle cellule T o formazione di sferoidi.

Research

Ricerca

JoVE Journal

Cancer Research

Ricerca sul cancro

Gli sferoidi sono un tipo di modello di coltura cellulare 3D utilizzato per rappresentare in modo più accurato l'ambiente di una cellula rispetto ai modelli monostrato di coltura cellulare 2D. Nel protocollo di esempio, vedremo gli scienziati generare sferoidi da una linea cellulare di cancro del colon-retto e applicare l'imaging di cellule vive per monitorare la crescita degli sferoidi.

Generazione di sferoidi da linee cellulari: un metodo di coltura cellulare tridimensionale (3D)

In questo video, dimostriamo il test ripetitivo di provocazione tumorale per valutare il potenziale ripetitivo di uccisione tumorale delle cellule CAR T durante elevati carichi di cellule tumorali. Inoltre, le cellule CAR T possono essere analizzate utilizzando la citometria a flusso per determinare le diverse sottopopolazioni di cellule CAR T nel campione.

Saggio ripetitivo di provocazione tumorale: un test di coltura in vitro per valutare le cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR) per il potenziale di uccisione ripetitiva del tumore

Questo video dimostra un metodo per monitorare l'attività delle cellule T CAR contro le cellule tumorali attraverso misurazioni dell'impedenza elettrica in tempo reale. Il monitoraggio dei cambiamenti nell'impedenza valuta l'efficacia delle cellule CAR T nell'indurre la citolisi delle cellule tumorali, fornendo informazioni sulle loro capacità citotossiche.

Un test di citolisi in vitro in tempo reale per valutare la potenza delle cellule CAR T

Questo video mostra un test in vitro che valuta gli effetti citotossici delle cellule T CAR su sferoidi tumorali 3D che esprimono proteine fluorescenti. Questa valutazione utilizza la sonda fluorescente rossa Annexin V, che si lega ai residui di fosfatidilserina esposti sul lembo esterno delle cellule tumorali apoptotiche dopo interazioni con le cellule T CAR. La fluorescenza rossa emessa dalla sonda aiuta a distinguere queste cellule da quelle sane che emettono fluorescenza verde.

Un test in vitro per valutare la citotossicità delle cellule T CAR contro gli sferoidi tumorali

Questo video mostra un test in vitro per convalidare l'attività delle cellule T del recettore dell'antigene chimerico (CAR). Le cellule di linfoma a cellule B che esprimono l'antigene CD19 e la luciferasi citoplasmatica sono co-coltivate con cellule CAR T specifiche per CD19. Il legame del CAR al CD19 su un tumore induce le cellule CAR T a rilasciare citochine e tossine che causano citotossicità delle cellule tumorali. L'attività delle cellule CAR T viene valutata quantificando la citochina...

Un test in vitro per valutare l'attività antitumorale delle cellule CAR T specifiche del tumore

Descriviamo una singola cellula saggio ad alta prestazione per misurare la citotossicità delle cellule T quando incubati con cellule tumorali bersaglio. Questo metodo impiega una densa matrice elastomerica di sub-nanolitri pozzetti (~ 100.000 pozzetti / matrice) per confinare spazialmente le cellule T e le cellule bersaglio con rapporti definiti ed è accoppiato al microscopio a fluorescenza per monitorare effettore-bersaglio coniugazione e apoptosi successiva.

Quantitativa High-throughput cella singola test di citotossicità per le cellule T

Descriviamo l'evoluzione di un modello tridimensionale, basato su sferoide in vitro che permette di testare l'attuale standard di regimi di terapia sperimentale per testa e collo carcinoma di cellule squamous su linee cellulari, che mira a valutare la terapia suscettibilità e resistenza su cellule primarie dagli esemplari umani in futuro.

Terapia test in un modello di coltura cellulare 3D basati su sferoide per testa e collo a cellule squamose

Descriviamo un sistema quantitativo di analisi della citolisi in vitro in tempo reale per valutare la potenza delle cellule T del recettore dell'antigene chimerico che prendono di mira le cellule tumorali liquide e solide. Questo protocollo può essere esteso per valutare altre cellule echeggiatrici immunitarie, così come i trattamenti combinati.

Un esempio di potenza in tempo reale per le cellule T del recettore dell'antigene chimerico rivolte alle cellule tumorali solide ed ematologiche

Qui, presentiamo un metodo per identificare i composti che modulano il meccanismo ADCC, un importante meccanismo di uccisione delle cellule tumorali degli anticorpi antitumorali. L'effetto citotossico delle cellule NK è misurato negli sferoidi delle cellule del cancro al seno in presenza di Trastuzumab. L'analisi delle immagini identifica le cellule killer vive e morte e le cellule bersaglio negli sferoidi.

Quantificazione della citotossicità cellulare anticorpo-dipendente in un modello di sferoide tumorale: applicazione per la scoperta di farmaci

Qui, descriviamo un metodo per creare goccioline a doppia emulsione che incapsulano una cellula T e una cellula bersaglio del cancro per esaminare l'uccisione cellulare a livello di singola cellula. Questo metodo consente la doppia quantificazione sia delle molecole citotossiche che dell'apoptosi delle cellule bersaglio all'interno di un'ampia popolazione di cellule T.

Saggio di citotossicità basato su goccioline per valutare le cellule T del recettore dell'antigene chimerico a livello di singola cellula

Scopri come valutare la citotossicità delle cellule CAR T contro sferoidi tumorali 3D in tempo reale. Questo metodo combina imaging avanzato e saggi immunologici per studiare l'efficacia delle terapie immunologiche.

Un'analisi di uccisione di sferoide dalle cellule di T di auto

Esplora altri video