Name: Generazione di cloni delle cellule di cancro per visualizzare Telomeric Repeat-contenente RNA TERRA espresso da un singolo dei telomeri nelle cellule viventi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-17T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Scopri come generare cloni di cellule tumorali con tag MS2 per visualizzare il RNA TERRA da un singolo telomero in cellule viventi. Questo metodo avanzato utilizza CRISPR-Cas9 e microscopia confocale.

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Siamo grati per il personale della struttura imaging avanzata del CIBIO presso l'Università di Trento e l'impianto di microscopia luce BioOptics a Max F. Perutz laboratori (MFPL) a Vienna. La ricerca che porta a questi risultati ha ricevuto non finanziamenti dalla Stiftung Mahlke-Obermann e il settimo programma dell'Unione europea quadro di ricerca, sviluppo tecnologico e dimostrazione sotto convenzione di sovvenzione 609431 CE. CE è supportato da un fellowship di Montalcini dal Ministero dell'istruzione Università e ricerca (MIUR).

1. Selezione di cloni resistenti neomicina
<ol><li>Crescere le cellule AGS in medium F-12_K di Ham (Kaighn) completate con 10% siero bovino fetale (FBS), 2 mM L-Glutammina, penicillina (0,5 unità per mL di terreno) e streptomicina (0,2 µ g / mL di medium) a 37 ° C e 5% CO2. Transfect le cellule in una confluenza di 50-60% con il sgRNA/Cas9 esprimendo vettoriale e la cassetta di MS2 presso un 01:10 rapporto molare21. Nota: In un esperimento parallelo, verificare l'efficienza di trasfezione di trasfezione un vettore che esprimono GFP (cioè, Cas9-GFP vector). Almeno 60-70% di efficienza di trasfezione dovrebbe essere realizzato.</li>
	<li>Il giorno seguente, sostituire il mezzo di coltura con mezzo contenente neomicina alla concentrazione finale a 0,7 µ g/mL (mezzo selettivo). Nota: Spaccare le cellule e li semina in terreno selettivo il giorno dopo trasfezione permetterà di accelerare il processo di selezione. Tutte le cellule trasfettate con non morirà immediatamente. Se transfezione avviene in 6 piastre a pozzetti, nel qual caso ciascun pozzetto a un 60% confluenza dovrebbe contenere circa 0,7 x 106 celle, il giorno seguente che le celle possono essere suddivise da un singolo pozzo di terreno selettivo contenente 10 cm piatto.</li>
	<li>Mantenere le cellule in terreno selettivo per 7-10 giorni, cambiando mezzo ogni uno o due giorni, fino al singolo cloni sono visibili.</li>
	<li>Raccolta di cloni cellulari<ol>
<li>Preparare un piatto ben 96 contenente 10 µ l di 0,25% tripsina in ciascun pozzetto. Nota: Preparare due 96 pozzetti nel caso in cui più di 96 cloni devono essere selezionati.</li>
		<li>Con l'uso di un microscopio, segnare la posizione di ogni clone visibile nel piatto 10 cm facendo un punto nella parte inferiore del piatto con un pennarello. Ogni punto corrisponderà ad una colonia di essere raccolti.</li>
		<li>Sostituire il mezzo di coltura con appena sufficiente fosfato tamponata (PBS) forma una pellicola sottile di liquido sui cloni e non lasciare che le celle a secco durante la raccolta di clone.</li>
		<li>Scegliere singole colonie utilizzando una pipetta 10 µ l. Collegare il puntale contenente 5 µ l di tripsina alla Colonia e rilasciare lentamente la tripsina che rimarrà localizzata sulla Colonia. Consentire la tripsina staccare le cellule per 1 min, poi raschiare la Colonia con la punta e succhiano la punta. Nota: Durante questa procedura, lanciando il piatto un po' su un lato quindi per diminuire il volume di PBS attorno alla Colonia essendo scelto aiuterà il processo di prelievo evitando di diluire la tripsina attorno alla Colonia. Utilizzando un anello di clone può anche aiutare a raccogliere singoli cloni.</li>
		<li>Inserire le celle dalla Colonia in un pozzetto della piastra ben 96 contenente 10 µ l di 0,25% tripsina.</li>
		<li>Incubare per 5 minuti a temperatura ambiente, quindi riempire il pozzetto con 150 µ l di terreno selettivo (medio F - 12K di Ham (Kaighn) completati con 10% FBS, 2 mM L-Glutammina, penicillina (0,5 unità per mL di terreno), streptomicina (0,2 µ g / mL di medium) e contenenti neomicina presso una concentrazione di 0,7 µ g/mL. Nota: Durante il periodo di incubazione possono essere selezionati altri cloni. Si raccomanda di prendere come molti cloni come possibile. Vengono raccolti i cloni più maggiore sarà la probabilità di identificare quelli positivi.</li>
		<li>Una volta che tutti i cloni sono raccolti e trasferiti nella piastra ben 96, permettono alle cellule di crescere per un paio di giorni in mezzo selettivo F - 12K di Ham (Kaighn), supplementato con 10% FBS, 2 mM L-Glutammina, penicillina (0,5 unità per mL di terreno), streptomicina (0,2 µ g / mL del mezzo) e contenenti neomicina ad una concentrazione di 0,7 µ g/mL a 37 ° C e 5% CO2, fino a raggiungere la confluenza del 90%.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Suddivisione dei cloni<ol>
<li>Preparare tre 96 pozzetti rivestiti con gelatina aggiungendo 100 µ l di gelatina per pozzetto, incubare a temperatura ambiente per 30 minuti, quindi lavare due volte con PBS. Queste piastre verranno utilizzate per l'estrazione del DNA (piastra di DNA) e per clone congelamento (piastre di congelamento). Nota: Gelatina promuoverà l'allegato delle cellule e del DNA ai pozzetti. In particolare, il rivestimento di gelatina consentirà il DNA di attaccare nella parte inferiore dei pozzetti durante l'estrazione di DNA e lavare le procedure (discusse sotto). Durante la procedura di divisione di clone, si consiglia di utilizzare una pipetta multicanale.</li>
		<li>Una volta che cloni raggiungono 90% confluenza, aspirare medio da ciascun pozzetto della piastra ben 96, lavare con PBS, aggiungere 30 µ l di 0,25% tripsina per pozzetto e incubare per 5 min a 37 ° C. Nota: Cloni crescerà a ritmi diversi, che dipenderanno anche il numero di cellule raccolte al clone. Così, questo passaggio verrà eseguito durante i diversi giorni quando i diversi cloni raggiungono la confluenza del 90%.</li>
		<li>Aggiungere 70 µ l di terreno selettivo per pozzetto, perturbare grumi di cellule pipettando su e giù all'interno dei pozzetti, quindi trasferire 30 µ l della 100 µ l alla piastra di DNA gelatinizzata preriempita con 120 µ l di terreno selettivo per bene e 30 µ l al wit preriempita piastre congelamento gelatinizzato medio di µ l di h 50 (senza selezione).</li>
		<li>Posizionare la piastra di DNA nell'incubatrice e permettono alle cellule di crescere a 37 ° C e 5% CO2 fino al 90% confluenza.</li>
		<li>Aggiungere 80 µ l di ghiacciata preparata 2x congelamento medio (80% FBS e 20% solfossido dimetilico (DMSO)) in ciascun pozzetto della piastra congelamento, parafilm (spruzzato con etanolo al 70%) sopra la piastra così per sigillare ogni bene, mettere il coperchio sulla parte superiore e avvolgere la piastra con un foglio di alluminio. Posizionare le piastre di congelamento a-80 ° C.</li>
		<li>Aggiungere 90 µ l di terreno selettivo per pozzetto alla piastra ben 96 originale contenente i cloni che sono stati suddivisi e tenerlo in coltura fino al PCR risultati dello screening. Piastrina d'appoggio fungerà da questo piatto.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. lo screening di cloni resistenti neomicina
<ol><li>Estrazione del DNA dalla piastra di DNA ben 96.<ol>
<li>Una volta che i cloni coltivati nella piastra di DNA raggiungono 90% confluenza, lavare 2 volte con PBS, quindi lisare con 50 µ l di tampone lisi (10 mM Tris-HCl pH 7.5, 10 mM EDTA, 10 millimetri di NaCl, 0,5% SDS e proteinasi K di 1 mg/mL). Coprire la piastra con parafilm, sigillando ogni bene, mettere il coperchio, coprire con pellicola trasparente e posto a 37 ° C durante la notte.</li>
		<li>Aggiungere 100 µ l di etanolo freddo (Et-OH) / soluzione di NaCl (0,75 M di NaCl in 100% etanolo) a ciascun bene e precipitare per 6 h o una notte a temperatura ambiente. Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
		<li>Rimuovere la soluzione di NaCl/Et-OH invertendo la piastra e lavare 3 volte con 200 µ l di etanolo al 70% per pozzetto.</li>
		<li>Aggiungere 25 µ l di soluzione di RNasi A in acqua distillata e incubare a 37 ° C per 1 h.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilizzare 3 µ l di DNA genomico per l'amplificazione di PCR. Eseguire lo screening di PCR dei cloni selezionati utilizzando primers ricottura all'interno del gene di resistenza di neomicina e subtelomeriche 15q. L'amplificazione di PCR viene eseguita utilizzando gli enzimi della polimerasi standard e protocolli PCR21. Nota: Condizioni di PCR per MS2 primer (primer MS2-subtel15q-primer-S e MS2 come) e gli iniettori CTR (CTR prime S e primer CTR come) sono i seguenti: 98 ° C per 20 s come punto di denaturazione e quindi 34 cicli a 98 ° C 10 s, 58° C 20 s, 72 ° C 15 s , utilizzando enzima polimerasi in un 25 µ l reazione mescolare (Vedi Tabella materiali). Sequenze dell'iniettore sono indicati nella tabella 1.</li>
	<li>Eseguire reazioni di PCR su gel di agarosio ed estrarre fasce PCR ottenuti da cloni positivi utilizzando le procedure di estrazione standard del gel (Vedi Tabella materiali per reagenti di estrazione del gel).</li>
	<li>Eseguire analisi di sequenziamento del DNA del prodotto della PCR gel-estratta per la conferma della presenza di sequenze MS221. Nota: L'analisi di sequenziamento possono essere eseguite utilizzando i primers utilizzati per lo screening di PCR.</li>
	<li>Proiezione del sud della macchia di cloni positivi di PCR<ol>
<li>Crescere i cloni positivi alla PCR e di sequenziamento screening dalla piastra ben 96 originale (la piastrina d'appoggio) per ben 6 piastre in F - 12K di Ham (Kaighn), supplementato con 10% FBS, 2 mM L-Glutammina, penicillina (0,5 unità per mL di terreno), streptomicina (0,2 µ g / mL di terreno) e contenenti neomicina ad una concentrazione di 0,7 µ g/mL a 37 ° C 5% CO2. Nota: In alternativa, se alcuni di questi cloni sono stati persi, scongelare li da una delle piastre congelamento (Vedi protocollo 2.6).</li>
		<li>Una volta che i cloni sono al 90% confluenza nella piastra ben 6, lavare le cellule con PBS e aggiungere 250 µ l di tampone di lisi contenente 0,5 µ g proteinasi K per pozzetto.</li>
		<li>Raschiare le celle utilizzando un raschietto di cella e trasferire il lisato in una provetta da 1,5 mL.</li>
		<li>Incubare a 37 ° C per 16 h.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di etanolo al 100%, agitare vigorosamente e consentire il DNA per precipitare almeno 2 ore o durante la notte a-20 ° C. Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
		<li>Spin a 13.400 x g a 4 ° C per 10 minuti, eliminare il surnatante e lavare il pellet con etanolo al 70%. Lasciare asciugare a temperatura ambiente l'aria di pellet. In alternativa, utilizzare un concentratore a vuoto.</li>
		<li>Risospendere il pellet di DNA in 50 µ l di acqua distillata contenente RNasi A e incubare per 1h a 37 ° C.</li>
		<li>Digerire il 5-10 µ g di DNA genomico mediante enzimi di restrizione NcoI e BamHI (due digestioni indipendente) in 100 µ l di reazione incubando le reazioni di digestione a 37 ° C durante la notte.</li>
		<li>Eseguire 4 µ l della digestione su gel di agarosio (0,8% agarosio) per la conferma di digestione completa.</li>
		<li>Aggiungere 1/10 di volume di sodio acetato 3M soluzione pH 5.2 e 2 volumi di etanolo al 100% per le reazioni di digestione di limitazione e incubare almeno 2 ore o durante la notte a-20 ° C per precipitare il DNA. Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.</li>
		<li>Centrifugare a 13.400 x g a 4 ° C per 20 min, eliminare i sovranatante e lavare il pellet con etanolo al 70%. Lasciare asciugare il pellet all'aria a temperatura ambiente. In alternativa, utilizzare un concentratore a vuoto.</li>
		<li>Risospendere il pellet in 20 µ l di acqua distillata e caricare il DNA digerito su gel di agarosio 0.8%. Nota: Per una migliore risoluzione del DNA digerito, preparare un gel almeno 15 cm lungo ed eseguire durante la notte a bassa tensione (Volt ̴30). L'elettroforesi impostata deve essere ottimizzato.</li>
		<li>Il giorno seguente, macchia il gel con un agente di etichettatura del DNA, come il bromuro di etidio alla concentrazione finale di 1 µ l/10 mL, per 30 min a temperatura ambiente e scattare una foto con un righello vicino il gel su un gel di strumento di imaging.</li>
		<li>Impostare il trasferimento di DNA su una membrana di nylon ed eseguire l'ibridazione della membrana con una sonda di sequenza-specific MS2 utilizzando le procedure standard21.</li>
		<li>Scongelare i cloni che sono positivi alla PCR, DNA sequencing e Southern blot da una delle due piastre congelamento (Vedi punto successivo).</li>
	</ol></li>
	<li>Lo scongelamento dei cloni<ol>
<li>Preparare una provetta da 15 mL contenente 5 mL di pre-riscaldato di Ham F - 12K medium (di Kaighn) supplementato con 10% FBS, 2 mM L-Glutammina, penicillina (0,5 unità per mL di terreno) e streptomicina (0,2 µ g / mL di medium) per ogni clone essere scongelati.</li>
		<li>Rimuovere una delle piastre congelamento da-80 ° e aggiungere 100 µ l di terreno completo di pre-riscaldato F12K al bene contenente il clone positivo per essere scongelati. Nota: Questa procedura deve essere eseguita rapidamente e appoggiare la piastra ben 96 su ghiaccio secco dopo ogni clone è scongelato, al fine di consentire gli altri cloni di rimanere congelati. Ciò è particolarmente importante se più cloni devono essere scongelati dallo stesso piatto ben 96.</li>
		<li>Trasferire le cellule per il tubo da 15 mL contenente 5 mL di medium e centrifuga a 800 x g per 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aspirare il mezzo, risospendere le cellule in 500 µ l di terreno F12K completo pre-riscaldato e trasferire ogni clone in un unico pozzetto di una piastra ben 12.</li>
	</ol></li>
	<li>Eliminazione del gene di resistenza neomicina dal cassetto MS2 integrata a subtelomeriche 15q.<ol>
<li>Consentire i cloni a crescere di un piatto ben 12 in un piatto di 10 cm nel terreno F12K completo. Nota: Neomicina non deve essere inclusi nel mezzo se non diversamente indicato.</li>
		<li>Aggiungere l'adenovirus Cre-esprimendo le cellule coltivate in un piatto di 10 cm alla confluenza del 70% in 10 mL di terreno completo di F12K. Nota: Utilizzando un adenovirus che esprimono Cre-GFP permetterà la valutazione dell'efficienza di infezione, che dovrebbe raggiungere il 100%. L'adenovirus replica-difettoso andranno perso dopo pochi passaggi in coltura.</li>
		<li>48 ore dopo l'infezione, dividere le celle in tre piatti di 10 cm. Due piatti saranno utilizzati per la verifica della rimozione gene neomicina da selezione negativa, le celle contenenti neomicina in crescita medio (primo piatto) e da Southern blot (secondo piatto).</li>
		<li>Il terzo piatto contenente il clone per congelamento delle cellule e l'estrazione di RNA della coltura.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Verifica della TERRA-MS2 espressione della trascrizione di RT-qPCR
<ol><li>Al momento della verifica della rimozione del gene di neomicina, eseguire l'estrazione di RNA totale da TERRA-MS2 cloni utilizzando solventi organici (fenolo e guanidina soluzione isothiocynate)21.<ol>
<li>Risospendere il RNA Estratto da un piatto di 10 cm in 100 µ l di acqua di dietil pirocarbonato (DEPC).</li>
		<li>Eseguire 3 µ l di RNA su un gel di acido (MOPS) propansulfonico di denaturanti (1% formaldeide-contenenti) 1 x 3-(N-Morpholino) per verificare la concentrazione e l'integrità del RNA. Anche analizzare la concentrazione di RNA usando uno spettrofotometro.</li>
		<li>Trattare 3 µ g di RNA con dnasi I utilizzando 1 unità della dnasi I enzima in 60 µ l di reazione finale.</li>
		<li>Incubare la reazione per 1h a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Invertire le analisi di reazione e qPCR di trascrizione<ol>
<li>Aggiungere i seguenti componenti di un tubo del microcentrifuge nucleasi-free: 2 µ l di un primer specifico di 1 µM TERRA, 1 µ l di dNTP mix (10 mM), 6 µ l di dnasi I trattati RNA (corrispondente a ̴300ng RNA). Regolare il volume a 13 µ l con 4 µ l di acqua DEPC. Nota: Per ogni RNA devono essere analizzate, una seconda provetta contenente i reagenti stessi ma un primer specifico di riferimento, invece di primer specifici di TERRA, deve essere preparata.</li>
		<li>Riscaldare la miscela a 65 ° C per 5 min e incubare in ghiaccio per almeno 1 min.</li>
		<li>Raccogliere il contenuto dei tubi mediante centrifugazione breve e 4 µ l di enzima 5 X RT Buffer, 1 µ l 0,1 M ditiotreitolo (DTT), 1 µ l (4 unità) dell'inibitore di RNAsi e 1 µ l della trascrittasi inversa (Vedi Tabella materiali).</li>
		<li>Incubare i campioni a 42 ° C per 60 min, quindi utilizzare 2 µ l della reazione di RT per analisi qPCR.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparare la miscela di reazione di qPCR in un volume finale di 20 µ l composto da 10 µ l di mix master di 2 x qPCR, 2 µ l di modello di cDNA, 1 µ l di primer forward (10 µM), 1 µ l di primer reverse (10 µM) e 6 µ l di acqua.</li>
	<li>Eseguire qPCR reazione in un termociclatore utilizzando protocolli standard21.</li>
</ol>4. produzione di un Retrovirus esprimendo MS2-GFP
<ol><li>Per generare il retrovirus esprimenti MS2-GFP, transfect 80% confluenti phoenix imballaggio di cellule con una proteina di fusione GFP-MS2 esprimendo retrovirus vettoriali (pBabe-MS2-GFP PURO) e un gene env esprimendo vettore (ad esempio pCMV-VSVG) utilizzando un rapporto molare 4:1 di i due vettori.</li>
	<li>Il giorno seguente, è necessario sostituire il mezzo di coltura (DMEM supplementato con 10% FBS, 2 mM L-Glutammina e Pen/Strep) con fresca Media contenente 10mM del butirrato del sodio.</li>
	<li>Incubare per 8 h a 37 ° C, 5% CO2, quindi sostituire il mezzo con mezzo di coltura fresco da cui il virus saranno raccolto.</li>
	<li>Dopo 48 h, è necessario rimuovere il mezzo contenente retrovirus dalle cellule di phoenix. Questo mezzo può essere utilizzato direttamente per l'infezione di TERRA-MS2 cloni, nel qual caso il mezzo di filtrare attraverso un filtro da 0,45 µm, aggiungere polybrene (concentrazione finale di 30 µ g/mL) e aggiungerlo alle cellule (in questo caso il protocollo continua al passo 5). In alternativa, i retrovirus possono essere precipitati in un tubo falcon 50 mL aggiungendo volumeth 1/5 del 50% PEG-8000/900 mM NaCl soluzione e incubazione overnight a 4 ° C su una ruota di rotatore.</li>
	<li>Il giorno seguente, le particelle di retrovirus pellet mediante centrifugazione a 2.000 x g per 30 min, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in F12K medium senza siero. Nota: Le particelle di virus possono essere risospesi in 1/100th del surnatante volume originale. Un'infezione test dovrebbe essere eseguito al fine di verificare il volume minimo del retrovirus per infettare efficientemente le cellule necessaria.</li>
</ol>5. visualizzazione delle trascrizioni di TERRA-MS2 in cellule viventi
<ol><li>Piastra di TERRA-MS2 cloni e cellule WT AGS in piatti con fondo di vetro. Il giorno di infezione, è necessario aggiungere polybrene il medium (concentrazione finale di 30 µ g/mL) ed il retrovirus esprime MS2-GFP.</li>
	<li>Dopo 24 ore, eliminare il terreno contenenti virus e aggiungere mezzo fresco senza rosso fenolo.</li>
	<li>Analizzare le cellule al microscopio invertito utilizzando l'impostazione di microscopio appropriato. Immagine delle cellule con un 100 X o obiettivo 60x con grande apertura numerica (1.4 X) e utilizzando una telecamera sensibile (EMCCD). Utilizzare un sistema di controllo ambientale per mantenere i campioni a 37 ° C e 5% CO2 durante la formazione immagine.</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori non dichiarano concorrenti interessi finanziari

In questo articolo presentiamo un metodo per generare cloni di cellule tumorali umane contenenti sequenze di MS2 integrati all'interno di subtelomeriche 15q. Utilizzando questi cloni, le molecole di MS2-etichetta TERRA trascritte da subtelomeriche 15q vengono rilevate da microscopia di fluorescenza di co-espressione di una proteina di fusione GFP-MS2. Questo approccio consente ai ricercatori di studiare la dinamica della TERRA espressa da un singolo dei telomeri in vita cellule21. In questo protoc...

La TERRA di RNA lunghi non codificanti è trascritto dalla regione subtelomerica dei cromosomi e la trascrizione procede verso le estremità del cromosoma, che chiude all'interno del tratto di ripetizione telomerica1,2. Per questo motivo, trascrizioni TERRA sono costituiti da sequenze subtelomeric derivata alla loro estremità 5' e terminare con ripetizioni telomeriche (UUAGGG nei vertebrati)3. Importanti ruoli sono stati proposti per TERRA, tra cui la formazione dell'eterocromatina presso i telomeri4,5, DNA replication6, promuovendo una ricombinazione omologa tra cromosoma termina7,8 , 9, regolazione del telomero struttura10e lunghezza del telomero omeostasi2,11,12,13. Inoltre, trascrizioni TERRA interagiscono con numerosi siti di extratelomeric alla regolazione dell'espressione genica diffusa di cellule staminali embrionali (ES) del mouse14. In linea con queste prove, ibridazione in situ di fluorescenza RNA (RNA-pesce) analisi hanno mostrato che solo un sottoinsieme delle trascrizioni TERRA di localizzare a telomeri1,2,15. Inoltre, la TERRA è stata segnalata a formare aggregati nucleari localizzazione presso i cromosomi X e Y del mouse le celle2,16. Questi risultati indicano che le trascrizioni TERRA subiscono complesse dinamiche all'interno del nucleo. Comprensione delle dinamiche delle molecole TERRA vi aiuterà a definire la loro funzione e meccanismi di azione.
Il sistema di MS2-GFP è stato ampiamente utilizzato per visualizzare le molecole di RNA in cellule viventi da vari organismi17,18. Questo sistema è stato utilizzato in precedenza per tag e visualizzare le molecole TERRA di singolo-telomero in S. cerevisiae12,19. Utilizzando questo sistema, è stato recentemente dimostrato che le trascrizioni TERRA di lievito localizzare all'interno del citoplasma durante la fase di spostamento post-Coelho, suggerendo che la TERRA possa esercitare funzioni extranucleari20. Noi abbiamo recentemente utilizzato il sistema di MS2-GFP per studiare le trascrizioni TERRA di singolo-telomero in cancro cellule21. A questo scopo, abbiamo impiegato lo strumento di modifica di genoma CRISPR/Cas9 di integrare MS2 sequenze a un singolo telomero (telomero 15q, qui di seguito Tel15q) ed abbiamo ottenuto cloni che esprimono MS2-etichettate endogene Tel15q TERRA (TERRA-MS2 cloni). Co-espressione di una proteina legante il RNA MS2 fusi con GFP (MS2-GFP) che riconosce e lega RNA MS2 sequenze consente visualizzazione delle trascrizioni di singolo-telomero TERRA in vita cellule21. Lo scopo del protocollo illustrato qui è quello di descrivere in dettaglio i passaggi necessari per la generazione di cloni di TERRA-MS2.
Per generare cloni di TERRA-MS2, una cassetta di MS2 è integrata all'interno della regione subtelomerica del telomero 15q, a valle del sito di inizio TERRA promotore regione e trascrizione. La cassetta di MS2 contiene un gene di resistenza di neomicina affiancato da siti lox-p, e la sua integrazione a subtelomeriche 15q viene eseguita utilizzando il sistema CRISPR/Cas922. Dopo trasfezione di MS2 cassetta, singolo cloni sono selezionati e subtelomeric integrazione della cassetta è verificato mediante PCR, DNA sequencing e Southern blot. Cloni positivi sono infettati con un adenovirus che esprimono Cre al fine di rimuovere il marcatore di selezione nel cassetto, lasciando solo sequenze di MS2 e un sito singolo lox-p a subtelomeriche 15q. Espressione delle trascrizioni TERRA MS2-contrassegnati da Tel15q è verificata da RT-qPCR. Infine, si esprime la proteina di fusione GFP-MS2 in TERRA-MS2 cloni tramite infezione retrovirale per visualizzare trascrizioni MS2-TERRA mediante microscopia a fluorescenza. Trascrizioni TERRA possono essere facilmente individuate da RNA-pesce e cellule vive imaging utilizzando telomeric repeat specifiche sonde1,2,15,23. Questi approcci forniscono importanti informazioni sulla localizzazione della popolazione totale di molecole TERRA a risoluzione di singola cellula. La generazione di cloni contenenti sequenze di MS2 presso un singolo subtelomeriche permetterà ai ricercatori di studiare le dinamiche delle trascrizioni TERRA di singolo-telomero in cellule viventi, che contribuiranno a definire la funzione e meccanismi di azione di TERRA.

<table><tbody><tr><td>Cellule AGS</td> <td>-</td><td></td> <td>Dono di Christian Baron (Universit&eacute; de Montr&eacute; al).</td></tr><tr><td>F12K Nut Mix 1X</td><td>GIBCO</td><td>21127022</td><td>Terreno di coltura per cellule AGS</td></tr><tr><td>L-Glutammina&nbsp;</td><td>CORNING</td><td>MT25005CI</td><td>Componente del terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Soluzione di penicillina streptomicina</td><td>CORNING</td><td>30-002-CI</td><td>Componente del terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>Fetale Siero bovino Sigma</td><td>Aldrich</td><td>F2442</td><td>Componente del terreno di coltura cellulare</td></tr><tr><td>DMEM 1X</td><td>GIBCO</td><td>21068028</td><td>terreno di coltura per cellule di fenice</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016</td><td>utilizzato nella trasfezione cellulare phoenix</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td>utilizzato nella trasfezione cellulare phoenix (soluzione HBS)</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td>utilizzato nella trasfezione cellulare phoenix (soluzione HBS)</td></tr><tr><td>Destrosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9434</td><td>utilizzato nella trasfezione cellulare phoenix (soluzione HBS)</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td>utilizzato nella trasfezione di cellule phoenix (soluzione HBS) e nella precipitazione di retrovirus</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3264</td><td>utilizzato nella trasfezione cellulare phoenix (soluzione HBS)</td></tr><tr><td>TRYPSIN EDTA SOLUTION 1X</td><td>CORNING</td><td>59430C</td><td>utilizzato nella divisione cellulare</td></tr><tr><td>DPBS 1X</td><td>GIBCO</td><td>14190250</td><td>Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco</td></tr><tr><td></td><td>DMSO Sigma Aldrich</td><td>D8418</td><td>Componente del mezzo di congelamento cellulare (80% FBB e 20% DMSO)</td></tr> <tr><td>G-418 Disolfato</td><td>per medium</td><td>G4185</td><td>farmaco di selezione per&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione di gelatina Bioreagente</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1393</td><td>Composizione di una piastra di DNA a 96 pozzetti e di una piastra di congelamento</td></tr><tr><td>Fisher BioReagents</td><td>a base di tris</td><td>10376743</td><td>Componente del tampone di lisi cellulare per l'estrazione del DNA genomico</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td>Componente del tampone di lisi cellulare per l'estrazione del DNA genomico</td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71729</td><td>Componente del tampone di lisi cellulare per l'estrazione genomica del DNA</td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM2546</td><td>Componente del tampone di lisi cellulare per l'estrazione del DNA genomico</td></tr><tr><td>RNAsi A</td><td>Thermo Fisher</td><td>12091021</td><td>degradazione dell'RNA durante l'estrazione del DNA</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5304</td><td>Preparazione del gel di DNA</td></tr><tr><td>Atlas ClearSight</td><td>Bioatlas</td><td>BH40501</td><td>Reagente colorante utilizzato per la rilevazione di campioni di DNA e RNA in gel di agarosio</td></tr><tr><td>etanolo</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP28184</td><td>precipitazione del DNA</td></tr><tr><td>Acetato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71196</td><td>Utilizzato per la precipitazione del DNA a una concentrazione 3M pH5.2</td></tr><tr><td>Wizard SV Gel e sistema di pulizia PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td>Estrazione di frammenti PCR da gel di agarosio durante lo screening PCR di cloni positivi alla neomicina</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>AMBION</td><td>15596018</td><td>Solvente organico utilizzato per l'estrazione dell'RNA</td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>89836</td><td>degradazione del DNA genomico dall'RNA</td></tr><tr><td>Miscela di dNTP</td><td>Invitrogen</td><td>10297018</td><td>utilizzato nelle reazioni RT e PCR</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>707265ML</td><td>utilizzato nelle reazioni RT</td></tr><tr><td>pirocarbonato di dietil</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td>utilizzato per inattivare le RNAsi in acqua (diluizione 1:1000)</td></tr><tr><td>Ribolock</td><td>Thermo Fisher</td><td>EO0381</td><td>Inibitore della RNasi</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M9381</td><td>preparazione di gel di RNA</td></tr><tr><td>Paraformaldeide Microscopia</td><td>elettronica</td><td>Scienze 15710</td><td>preparazione di gel di RNA denaturante (1% PFA in 1x MOPS)</td></tr><tr><td>Superscript III Trascrittasi inversa</td><td>Invitrogen</td><td>18080-093</td><td>Reazione di retrotrascrizione</td></tr><tr><td>Pfu DNA polimerasi (ricombinante)</td><td>Thermo Scientific</td><td>EP0501</td><td>Reazione PCR</td></tr><tr><td>2X qPCRBIO SyGreen Mix Separate-ROX</td><td>PCR BIOSYSTEMS</td><td>Reazione PB 20.14</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>L'adenovirus Cre-GFP</td><td>https://medicine.uiowa.edu/vectorcore</td><td>1174-HT</td><td>utilizzato per infettare i cloni TERRA-MS2 al fine di rimuovere il gene neomycn</td></tr><tr><td>Butirrato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B5887</td><td>utilizzato per promuovere la produzione di particelle di retrovirus nelle cellule di fenice</td></tr><tr><td>PEG8000</td><td>Sigma Aldrich</td><td>89510</td><td>Precipitazione di parti di retrovirus</td></tr><tr><td>35&micro;-Dish Glass Bottom</td><td>Ibidi</td><td>81158</td><td>utilizzato nelle analisi di imaging su cellule vive di cloni TERRA-MS2</td></tr></tbody></table>

generazione di cloni delle cellule di cancro per visualizzare telomeric repeat-contenente rna terra espresso da un singolo dei telomeri nelle cellule viventi

Generation of Cancer Cell Clones to Visualize Telomeric Repeat-containing RNA TERRA Expressed from a Single Telomere in Living Cells

I telomeri sono trascritti, dando luogo a telomeric repeat-contenente RNA lunghi non codificanti (TERRA), che sono state proposte per svolgere un ruolo importante nella biologia del telomero, tra cui la formazione dell'eterocromatina e nell'omeostasi di lunghezza del telomero. Recenti scoperte hanno rivelato che TERRA molecole interagiscono anche con interne regioni cromosomiche per regolare l'espressione genica in cellule staminali embrionali (ES) del topo. In linea con questa prova, RNA fluorescenza in situ di ibridazione (RNA-pesce) analisi hanno mostrato che solo un sottoinsieme di TERRA trascrizioni localizzare alle estremità del cromosoma. Una migliore comprensione delle dinamiche di molecole TERRA vi aiuterà a definire la loro funzione e meccanismi di azione. Qui, descriviamo un metodo per etichettare e visualizzare trascrizioni TERRA di singolo-telomero in cellule di cancro usando il sistema di MS2-GFP. A questo scopo, vi presentiamo un protocollo per generare cloni stabili, utilizzando la linea cellulare del cancro AGS stomaco umano, che contiene le sequenze di MS2 integrate a un singolo subtelomeriche. Trascrizione di TERRA dal telomero MS2-etichetta provoca l'espressione di molecole TERRA MS2-Tag che vengono visualizzate da microscopia di fluorescenza di cellule vive al momento di co-espressione di una proteina di legame al RNA MS2-fusa a GFP (MS2-GFP). Questo approccio consente ai ricercatori di studiare la dinamica delle single-telomero TERRA molecole nelle cellule tumorali, e può essere applicato ad altre linee cellulari.

Figura 1 rappresenta una panoramica della strategia sperimentale. I passaggi principali del protocollo e un calendario indicativo per la generazione di cloni di TERRA-MS2 in cellule AGS sono illustrati (Figura 1A). Giorno 1, più pozzetti di una piastra ben 6 transfected con la cassetta di MS2 e sgRNA/Cas9 esprimendo vettori (illustrati nella Figura 1B)....

Qui, presentiamo un protocollo per generare cloni delle cellule di cancro che contiene un tag di sequenza MS2 presso un singolo subtelomeriche. Questo approccio, basandosi sul sistema MS2-GFP, permette la visualizzazione delle trascrizioni endogene di telomerica ripetizione-contenente RNA (TERRA) espresso da un singolo telomero in cellule viventi.

Generazione di cloni delle cellule di cancro per visualizzare Telomeric Repeat-contenente RNA TERRA espresso da un singolo dei telomeri nelle cellule viventi

Telomeres are transcribed, giving rise to telomeric repeat-containing long noncoding RNAs (TERRA), which have been proposed to play important roles in ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave sui telomeri, come il lievito telomerico non coding RNA TERRA localizzazione, e posso insistere sul fatto che è telomero di origine o in trans, un diverso cromes-mants Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente ai ricercatori di visualizzare le molecole TERRA espresso da un singolo telomero nelle cellule viventi. A dimostrare la procedura saranno Claudio Oss Pegorar e Nicole Bettin, due studenti laureati del mio laboratorio. Per iniziare a far crescere le celle AGS in base al protocollo di testo.Quindi, quando le celle raggiungono il 50-60% di confluenza, trasspettarle con il vettore di espressione sgRNA Cas9 e la cassetta MS2. Il giorno dopo sostituire il mezzo di coltura con mezzo contenente neomicina. Dopo questo aggiungere 10 microlitri dello 0,25% Tripsyn ad ogni pozzo di una piastra da 96 pozzi.Utilizzando un microscopio e un marcatore, contrassegnare la posizione di ogni clone visibile nel piatto. Sostituire il mezzo di coltivazione della neomicina con abbastanza PBS da formare una sottile pellicola di liquido sui cloni. Utilizzando una pipetta da 10 microlitri contenente cinque microlitri di tripina, rilasciare lentamente la tripina sulla colonia.Lasciare che la tripina scollega le celle per un minuto. Raschiare la colonia con la punta e succhiarla nella punta. Dopo questo, trasferire le cellule dalla colonia in un pozzo della piastra del pozzo 96.Incubare il piatto per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi riempire il pozzo con 150 microlitri di mezzo selettivo. Quindi, aggiungere 100 microlitri di gelatina ad ogni pozzo di tre 96 piastre di pozzo.Incubare le piastre a temperatura ambiente per 30 minuti e lavare le piastre con PBS due volte. Dopo che i cloni raggiungono il 90% di confluenza, aspirare il mezzo da ogni pozzo della piastra e lavare la piastra con PBS. Quindi aggiungere 30 microlitri di triptina ad ogni pozzo e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per cinque minuti.Successivamente, aggiungere 70 microlitri di mezzo selettivo a ciascuno dei pozzi. Interrompere le cellule tubazioni su e giù. Trasferire 30 microlitri della miscela nel pozzo della piastra di DNA gelatinizzata contenente 120 microlitri di mezzo selettivo.Quindi trasferire 30 microlitri della miscela alla piastra di congelamento gelatinizzata contenente 50 microlitri di mezzo. Posizionare il DNA nell'incubatrice e consentire alle cellule di crescere a 37 gradi Celsius fino a raggiungere il 90% di confluenza. Dopo questo, aggiungere 80 microlitri di mezzo di congelamento a freddo ghiacciato ad ogni pozzo della piastra di congelamento.Sigillare la piastra con parafilm, sostituire il coperchio e avvolgere la piastra in un foglio di alluminio. Quindi mantenere le piastre di congelamento a 80 gradi Celsius. Dopo che i cloni nella piastra del DNA raggiungono il 90% di confluenza, lavare la piastra con PBS due volte.Quindi lisciviare le cellule con 50 microlitri di tampone di lisi. Coprire la piastra con parafilm, sostituire il coperchio e avvolgere la piastra in un involucro saran. Dopo questo, incubare il piatto a 37 gradi celsius durante la notte.Il giorno successivo aggiungere 100 microlitri di soluzione di cloruro di sodio etanolo ad ogni pozzo e consentire la precipitazione del DNA per sei ore o durante la notte a temperatura ambiente. Quindi invertire la piastra e lavarla tre volte con 200 microlitri di etanolo 70% per pozzo. Aggiungere 20 microlitri di RNasi Una soluzione ad ogni pozzo della piastra e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora.Successivamente, utilizzare tre microlitri di DNA genomico per l'amplificazione PCR e configurare la macchina PCR. Far crescere i cloni positivi PCR in sei piastre di pozzo secondo il protocollo di testo. Una volta che i cloni raggiungono il 90% di confluenza, lavare le cellule con PBS e aggiungere 250 microlitri di tampone di Lysis con proteinasi K ad ogni pozzo.Utilizzare un raschietto per celle per raschiare le cellule e trasferire il lisato in un tubo da 1,5 millilitri. Incubare il lisato a 37 gradi Celsius per 16 ore. Aggiungere un millilitro di etanolo al Lysate e agitare vigorosamente.Consenti ai cloni di crescere in mezzo F-12K secondo il protocollo di testo. Quindi aggiungere l'adenovirus cre-espresso alle cellule una volta raggiunta la confluenza del 70%. 48 ore dopo l'infezione, dividere le cellule in tre piatti di 10 centimetri.Quindi coltura i primi piatti per il congelamento cellulare e l'estrazione dell'RNA. In primo luogo, placcare i cloni TERRA-MS2 e le cellule AGS di tipo selvaggio in piatti di fondo in vetro. Quindi aggiungere polybrene e MS2-GFP esprimendo retrovirus al mezzo.Dopo 24 ore scartare il mezzo contenente il retrovirus e aggiungere un mezzo fresco senza fenolo rosso alle cellule. Infine, utilizzando un microscopio invertito e una fotocamera sensibile, immagini le celle con l'obiettivo e l'apertura appropriati. In questo protocollo sono stati creati e creati cloni di cellule tumorali contenenti un tag di sequenza MS2 in un singolo sottotelomero.I cloni resistenti alla neomicina sono stati schermati utilizzando pcr. I cloni positivi sono stati coltivati per l'estrazione genomica del DNA e l'analisi delle macchie del Sud. I cloni positivi all'analisi pcr e southern blot sono stati infettati dal CRE-GFP che esprimeva Adenovirus al fine di rimuovere il gene neomicina presente nella cassetta MS2.Una volta confermata l'eliminazione del gene di resistenza alla neomicina, l'RNA estratto dai cloni è stato testato per l'espressione delle trascrizioni TERRA-MS2. Al fine di visualizzare le trascrizioni TERRA-MS2 nelle cellule viventi mediante microscopia confocale, i cloni selezionati sono stati infettati da un retrovirus che esprime una proteina di fusione MS2-GFP. Le trascrizioni e i telomeri TERRA-MS2 sono stati simultaneamente visualizzati nelle cellule viventi tramite microscopia confocale co-esprimere la proteina di fusione MS2-GFP e una proteina di legame telomero fusa mCherry, TRF2, nei cloni selezionati.Quando si tenta questa procedura è importante fare ogni sforzo per selezionare un singolo clone anziché una popolazione mista di cloni. Seguendo questa procedura, altri metodi come un DNA FISH sui cromosomi si diffondono, possono essere utilizzati al fine di visualizzare l'integrazione della cassetta MS2 in cellule fisse. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica può spianare la strada ai ricercatori nel campo dei telomeri per esplorare la localizzazione cellulare di singole molecole di telomero TERRA nelle cellule umane viventi.Non dimenticare che lavorare con vettori virali e materiali radioattivi può essere estremamente incerto. E le precauzioni, come indossare cappotti da laboratorio, guanti e usare scudi in plexiglass per ridurre al minimo le radiazioni, devono sempre essere prese quando si esegue questa procedura.

generation-cancer-cell-clones-to-visualize-telomeric-repeat

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Questo protocollo descrive le tecniche per l'isolamento di cellule vive e la coltura primaria di linee cellulari miogeniche e fibroblastiche da tessuto muscolare o cutaneo.  Viene anche descritta una tecnica per l'immortalizzazione di queste linee cellulari.  Nel complesso, questi protocolli forniscono uno strumento affidabile per generare e conservare cellule derivate da pazienti per applicazioni a valle.

Isolamento e Immortalizzazione di paziente derivati ​​da linee cellulari provenienti da Muscle Biopsia per la malattia Modeling

Il telomero e la telomerasi svolgono un ruolo essenziale nell'invecchiamento e nella tumorigenesi. L'obiettivo di questo protocollo è quello di mostrare come generare due alleli knock-in della telomerasi inducibili murini e come utilizzarli negli studi di degenerazione/rigenerazione tissutale e cancro.

Utilizzando Murine inducibile telomerasi alleli in Studi di Tissue Degeneration / Regeneration e il cancro

Qui, descriviamo un metodo di microscopia time-lapse a lungo termine per tracciare longitudinalmente singole cellule in risposta a terapie antitumorali.

Attraverso lo specchio: Time-lapse Microscopia e longitudinale monitoraggio di singole cellule allo Studio Therapeutics anti-cancro

Riportiamo una procedura concisa di ibridazione fluorescente in situ (FISH) nella gonade e negli embrioni di Caenorhabditis elegans per osservare e quantificare sequenze ripetitive. Abbiamo osservato e quantificato con successo due diverse sequenze ripetitive, le ripetizioni dei telomeri e il modello di allungamento alternativo dei telomeri (TALT).

Osservazione e quantificazione dei telomeri e sequenze ripetitive Usando fluorescenza<em&gt; In Situ</em&gt; Ibridazione (FISH) con sonde PNA in<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Trascrittasi inversa umana del telomerase (TERT) sintetizza non solo DNA telomerico, ma anche RNA double-stranded attraverso attività RNA polimerasi RNA-dipendente. Qui, descriviamo un neocostituita dosaggio per rilevare attività RNA polimerasi RNA-dipendente di TERT endogeno.

Rilevamento semi-quantitativa dell'attività della RNA polimerasi RNA-dipendente della proteina di Human Telomerase Reverse Transcriptase

Abbiamo convertito con successo il saggio di protocollo di amplificazione (TRAP) di teleomere standard per essere impiegato nelle reazioni a catena della polimerasi digitale delle gocce. Questo nuovo saggio, chiamato ddTRAP, è più sensibile e quantitativo, permettendo una migliore rilevazione e analisi statistica dell'attività telomerasi all'interno di varie cellule umane.

Droplet Digital TRAP (ddTRAP): adattamento del protocollo di amplificazione di ripetizione telomere a droplet reazione a catena della polimerasi digitale

La capacità di marcare in modo permanente le cellule staminali e la loro progenie con un fluoroforo utilizzando una linea di topo di tracciamento del lignaggio transgenico inducibile consente l'analisi spaziale e temporale dell'attivazione, proliferazione, migrazione e / o differenziazione in vivo. Il tracciamento del lignaggio può rivelare nuove informazioni sull'impegno del lignaggio, sulla risposta agli interventi e sulla multipotenza.

Tracciamento del lignaggio delle cellule staminali fluorescenti inducibili nel cervello del topo adulto

Questo protocollo descrive una tecnica per la generazione di cibridi da cellule tumorali in sospensione come strumento per studiare il ruolo dei mitocondri nel processo tumorigenico.

Generazione di cibridi transmitocondriali utilizzando linee cellulari tumorali

Presentiamo un metodo per lo studio della ridisseminazione delle cellule tumorali da metastasi polmonari che prevede un protocollo chirurgico per la fotoconversione selettiva delle metastasi polmonari, seguito dall'identificazione di cellule tumorali ridisseminate negli organi terziari.

Monitoraggio della disseminazione delle cellule tumorali dalle metastasi polmonari utilizzando la fotoconversione

Questa relazione descrive un metodo bioingegneria per progettare e costruire nuovi fattori artificiali splicing (ASF) che specificamente modulano la giunzione di geni bersaglio in cellule di mammifero. Questo metodo può essere ulteriormente ampliata per progettare vari fattori artificiali di manipolare altri aspetti del metabolismo dell'RNA.

Ingegneria fattori artificiali per manipolare in modo specifico l&#39;alternanza di splicing nelle cellule umane

Scopri come generare cloni di cellule tumorali con tag MS2 per visualizzare il RNA TERRA da un singolo telomero in cellule viventi. Questo metodo avanzato utilizza CRISPR-Cas9 e microscopia confocale.

Generazione di cloni delle cellule di cancro per visualizzare Telomeric Repeat-contenente RNA TERRA espresso da un singolo dei telomeri nelle cellule viventi (Video) | JoVE Journal

Generazione di cloni delle cellule di cancro per visualizzare Telomeric Repeat-contenente RNA TERRA espresso da un singolo dei telomeri nelle cellule viventi

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