Isolamento di cellule staminali mesenchimali da tessuto della polpa e co-coltura con cellule tumorali per studiare le loro interazioni

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle cellule staminali sul ruolo delle cellule staminali adulte nella regolazione del comportamento delle cellule tumorali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la valutazione delle interazioni delle cellule tumorali e delle cellule staminali in vitro senza l'uso di organismi viventi. Questa tecnica ha un potenziale per la metastasi tumorale in quanto modella il ruolo di promozione delle cellule staminali adulte nella metastasi tumorale ai tessuti duri come l'osso.

La dimostrazione della procedura sarà effettuata da Huseyin Apdik, un post-dottorato nel mio laboratorio. Inizia usando forcelle di estrazione sterili per rimuovere il tessuto della polpa dal centro dei denti del giudizio ottenuti da giovani adulti di età compresa tra 17 e 20 anni. Posizionare il tessuto in DMEM completo a freddo in piatti di coltura tissutale di 10 centimetri e utilizzare un bisturi per tritare i campioni in frammenti da due a tre millimetri.

Trasferire i pezzi da ogni piatto in singoli pozzi di una piastra di sei pozzetti trattata con coltura tissutale e coprire i tessuti in ogni pozzo con 200 microlitri di DMEM completo. Lasciare che i tessuti si attaccano ai fondi del pozzo con un'incubazione di almeno due ore in un incubatore di coltura cellulare umidificato di 37 gradi Celsius e 5%CO2. Alla fine dell'incubazione, nutrire i tessuti con da due a 2,5 millilitri di mezzo fresco completo e colturare le cellule per altri otto o nove giorni.

Quando la coltura ha raggiunto l'80% di confluenza, lavare ogni bene con due millilitri di PBS seguiti dal distacco delle cellule con due millilitri di tripside a 37 gradi Celsius. Dopo due minuti, interrompere la reazione con due millilitri di DMEM completo per pozzo e raccogliere le cellule per centrifugazione. Quindi, resostigliere i pellet in 15 millilitri di mezzo fresco completo per due pozzi di cellule e passare le cellule in mastri T75 per la loro successiva coltura.

Dopo almeno otto passaggi, visualizzare le cellule mediante microscopia ottica. Le cellule staminali della polpa dentale dovrebbero essere attaccate ai piatti di coltura e dovrebbero mostrare una morfologia cellulare simile a un mandrino. Per l'analisi del marcatore di superficie, dopo aver dimostrato la trippsinizzazione, fissare le cellule con paraformaldeide al 4% per 20 minuti a temperatura ambiente in tubi da 1,5 millilitri seguiti da tre lavaggi in 500 microlitri di PBS per lavaggio.

Dopo l'ultimo lavaggio, etichettare le cellule con gli anticorpi appropriati di interesse in 100 microlitri di PBS per tubo per un'ora a quattro gradi Celsius. Al termine dell'incubazione, lavare le cellule tre volte in PBS come dimostrato ed etichettare le cellule con gli anticorpi secondari appropriati in 100 microlitri di PBS per tubo per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi lavare i campioni tre volte in PBS e analizzare le cellule per citometria di flusso secondo protocolli standard.

Per la differenziazione delle cellule staminali della polpa dentale, seminare una volta 10 alle quattro cellule in singoli pozzi di piastre da 24 porri in 500 microlitri di DMEM completo per un'incubazione 24 ore su 24 nell'incubatore di coltura cellulare. Il giorno successivo, sostituire il mezzo in ogni pozzo con l'appropriato mezzo di differenziazione e riportare le cellule all'incubatrice, rinfrescando il mezzo due volte a settimana per due settimane. La differenziazione può essere confermata dalla colorazione blu di von Kossa e Alcian secondo protocolli standard.

Dopo due o quattro passaggi, raccogliere i supernaganti medi condizionati dalle cellule staminali della polpa dentale coltivate quando le colture raggiungono l'80% di confluenza. Quindi, centrifugare il mezzo raccolto per rimuovere qualsiasi materiale di tessuto di scarto e detriti cellulari e conservare il mezzo a -20 gradi Celsius fino all'uso. Per il trattamento delle cellule tumorali, seminare una volta 10 alle cinque cellule tumorali in singoli pozzi di una piastra da 12 po 'per l'incubazione notturna a 37 gradi Celsius e 5%CO2.

La mattina successiva, utilizzare una punta sterile da 200 microliter per fare una lesione da graffio in ogni pozzo e sostituire immediatamente il supernatante in ogni pozzo con mezzo fresco contenente varie concentrazioni di mezzo condizionato. Quindi, osservare immediatamente i graffi al microscopio invertito e ottenere immagini delle colture ferite a intervalli di tempo regolari. Al termine dell'analisi, misurare la chiusura dei graffi nel tempo in ImageJ.

Per valutare la migrazione delle cellule staminali della polpa dentale, primo seme tre volte 10 alle quattro cellule staminali della polpa dentale su singoli inserti di piastre da 24 pozzetti con pori da 0,4 micron in 250 microlitri di DMEM e incubare gli inserti durante la notte a 37 gradi Celsius. Successivamente, semina cinque volte 10 le quattro cellule tumorali in singoli pozzi di una piastra da 24 porri in 500 microlitri di DMEM per l'incubazione notturna a 37 gradi Celsius. La mattina dopo, graffiare le cellule tumorali come dimostrato.

Sostituire i supernatinanti con 500 microlitri di DMEM fresco e posizionare un inserto seminato di cellule staminali di polpa dentale in ogni bene alimentato con mezzo fresco. Quindi osservare immediatamente le cellule su un microscopio invertito e immagini le cellule a intervalli regolari per valutare la migrazione delle cellule staminali della polpa dentale. Per valutare le interazioni dirette delle cellule staminali della polpa dentale con le cellule tumorali, tripinare ogni coltura etichettata per ottenere sospensioni a una cellula e raccogliere le cellule dissociate per centrifugazione.

Resuspend i pellet in distinte soluzioni di colorante del linker cellulare preparate in tampone C diluito, fornite secondo le istruzioni del produttore, e incubare le cellule sono a temperatura ambiente per 10 minuti. Terminare la reazione di colorazione con 100 microlitri di siero bovino fetale e raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Quindi centrifugare le cellule con un mezzo di crescita completo prima di placcare cinque volte 10 alle quattro cellule staminali della polpa dentale e alle cellule tumorali per pozzo in una piastra da sei po 'a un rapporto uno a uno in due millilitri di mezzo completo.

Raccogliere le cellule dopo 24 o 48 ore di incubazione per centrifugazione seguita da un lavaggio in PBS. Quindi, risospese le cellule in 300 microlitri di tampone di smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza in tubi di citometria a flusso tondo-fondo da cinque millilitri e vortice per disperdere eventuali aggregati cellulari prima di analizzare le cellule secondo protocolli di analisi citometrica a flusso standard. Le cellule staminali della polpa dentale mostrano una morfologia cellulare simile a un fibroblasto dopo la placcatura ed esprimono antigeni superficiali delle cellule staminali mesenchimali ma non marcatori cellulari ematopoietici.

Cambiamenti a livello morfologico e molecolare legati alla differenziazione osteo, condro e adipogenica si osservano anche nelle colture di cellule staminali della polpa dentale a seguito dell'appropriata applicazione del cocktail di differenziazione. Il trattamento delle colture cellulari tumorali ferite da graffi con concentrazioni del 10 e 20% di mezzo condizionato aumenta significativamente la chiusura dei graffi rispetto alle colture cellulari tumorali di controllo-medio trattato. Le molecole secrete delle cellule staminali della polpa dentale inseriscono co-colture hanno anche aumentato la chiusura dei graffi nelle cellule tumorali ferite rispetto alle co-colture cellulari di controllo.

L'analisi al microscopio a fluorescenza delle interazioni tra lo stelo della polpa dentale e la cellula tumorale all'interno di una coltura cellulare in vitro rivela la creazione di una struttura ben organizzata all'interno della quale le cellule tumorali proliferano rapidamente dopo 48 ore. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di tenere due campioni di tessuto in mezzo freddo e trasportare immediatamente campioni in laboratorio per ridurre al minimo la morte cellulare. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nei campi delle cellule staminali nell'esplorazione delle interazioni del cancro delle cellule staminali adulte negli esseri umani.

Seguendo questa procedura, altri metodi come il tracciamento delle cellule immunitarie per le cellule differenziali etichettate di vari tipi di cellule staminali e cancro possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande su come le cellule staminali adulte interagiscono con le cellule tumorali e controllano la metastasi tumorale. Non dimenticare che lavorare con i campioni umani può essere pericoloso e che precauzioni come l'analisi dei campioni di pazienti per malattie infettive e l'ottenimento del consenso scritto del paziente dovrebbero sempre essere implementate quando si esegue questa procedura.