Isolamento di singole comunità batteriche intracellulari generati da un modello murino di infezione delle vie urinarie per analisi unicellulare a valle

Comunità batteriche intracellulari, o IBC, sono state osservate nei topi a cui sono state somministrate infezioni sperimentali del tratto urinario, o UTI. Sono stati osservati anche nei sedimenti urinari dei pazienti con UTI umana. La tecnica che stiamo descrivendo oggi è un modo per isolare singoli IPC da topi infettati sperimentalmente.

La tecnica di micropipetting della bocca è l'unica tecnica attualmente disponibile per isolare i batteri intracellulari dalle vesciche del topo infette. Per preparare pipette per bocca di vetro, pizzicare saldamente entrambe le estremità di un tubo capillare di vetro e ruotare uniformemente il centro del tubo avanti e indietro lungo il suo asse su una fonte di fiamma aperta. Quando il vetro diventa morbido, rimuovere il capillare dalla fonte di calore e smontare immediatamente il vetro.

La lunghezza finale ideale del capillare tirato è da tre a cinque centimetri più lunga di un capillare senza scrupoli per garantire un diametro interno appropriato per isolare le singole cellule epiteliali della vescica. Quando il vetro si è raffreddato, controllare se il centro del capillare di vetro è più stretto e che l'interno del tubo è ancora cavo. Raccogliendo la grande estremità del capillare tirato con una mano, utilizzare le pinze per afferrare il capillare nel punto più stretto, assicurandosi che le pinze siano brandita con abbastanza forza per afferrare saldamente il capillare senza schiacciarlo.

Ruotare rapidamente le forcep per spezzare il capillare tirato nel punto più stretto. Quindi, posizionare il capillare di dimensioni micropipette della bocca in una piastra di Petri di 100 millimetri e sterilizzare i raggi UV per 30 minuti. Per raccogliere la vescica, posizionare un topo in posizione supina e sterilizzare l'area addominale con il 70% di etanolo.

Utilizzando forcep sterilizzate con etanolo e forbici chirurgiche, fare un'incisione cutanea trasversale iniziale di un centimetro sopra l'apertura uretrale ed espandere l'incisione diagonalmente verso gli arti superiori del topo per creare un taglio a forma di V lungo l'intero anteriore del topo che espone il contenuto del peritoneo. Utilizzando nuovi strumenti sterilizzati, spingere delicatamente verso il basso sui cuscinetti di grasso vicino alla regione pelvica del mouse per far sporgere la vescica e afferrare la vescica esposta all'apice. Mantenendo una presa ferma sulla vescica, tagliare gli ureteri e l'uretra per liberare la vescica e inserire la punta di un albero di pinze arrotondate nell'apertura della vescica dove era appena incisa.

Rilasciare le forcep afferrando l'apice e mantenendo le forcelle arrotondate quasi completamente chiuse, utilizzare un secondo paio di forcelle per estrarre delicatamente l'estremità esterna della bocca della vescica lontano dalle forcelle arrotondate e intorno e sopra l'altra punta delle forcep arrotondate per capovolgerla all'interno. Quindi, utilizzare la seconda coppia di forcep per convincere delicatamente la vescica invertita dalla punta delle forcep in un millilitro di PBS freddo. E raschiare delicatamente lo strato interno della cellula epiteliale all'esterno della vescica invertita con due paia di forcelle pulite.

Una volta raschiate tutte le celle, inserire l'estremità non obbligatoria di un capillare di vetro tirato nel tappo di gomma di un tubo aspiratore e montare saldamente l'estremità stretta di una punta della pipetta di un millilitro nell'altra estremità aperta del tubo. Montare saldamente l'estremità stretta di una pipetta aspirante a due millilitri nell'estremità aperta e più larga della punta della pipetta da un millilitro e posizionare la sospensione della cella raschiata sotto un microscopio sezionante. Utilizzando un ingrandimento da 20 a 40X, identificare gli IBC come grandi aggregati fluorescenti e immergere l'estremità fine del capillare di vetro in un tubo fresco di PBS per un secondo per ridurre l'assorbimento di volume indesiderato attraverso l'azione capillare.

Quando è stato individuato un IBC di interesse, portare lentamente l'estremità aperta del tubo capillare verso l'IBC e applicare una forza di aspirazione molto piccola alla pipetta aspirante per guidare l'IBC nel capillare di vetro. Quindi, spostare il capillare su un tubo di centrifuga vuoto da 1,5 millilitri e applicare una leggera pressione positiva per espellere la goccia e l'IBC nel tubo. Oltre alla conferma della presenza di un singolo IBC isolato nel tubo di raccolta tramite il microscopio di sezionamento, la purezza dell'IBC isolato può essere confermata mediante microscopia confocale.

Le cellule isolate devono macchiare sia per E.coli che per uroplakin e devono avere dimensioni compresa tra 50 e 120 micrometri. Dopo l'isolamento, la presenza e la vitalità delle cellule batteriche nel singolo IBC possono essere confermate attraverso la quantificazione dell'unità di formazione della colonia o la reazione quantitativa a catena della polimerasi per gli equivalenti genomici. In particolare, le cellule epiteliali non infette isolate con lo stesso protocollo non dimostrano quantità quantificabili di batteri.

Inoltre, l'analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi a trascrizione inversa conferma la presenza di geni batterici in una serie di IC isolati individualmente e raggruppati. Assicurarsi sempre che una micropipetta per la bocca possa raccogliere ed espellere facilmente il liquido. Non esitate a cambiare il capillare o l'intero apparato se la micropipetta della bocca si sente occlusa.

Questa tecnica di micropipetting della bocca ci permette di studiare direttamente e specificamente le popolazioni intracellulari che si formano durante un'UTI sperimentale. Senza questa tecnica, quelle popolazioni intracellulari sarebbero contaminate e superate in numero dai batteri extracellulari. Alcuni altri agenti infettivi possono essere più facilmente aerosolizzati o trasmessi rispetto all'E.coli che abbiamo usato in questa applicazione.

In questi casi, alcuni controlli aggiuntivi possono quindi essere giustificati, come l'aggiunta di un filtro o l'estensione del tubo, a seconda dell'applicazione utilizzata. Gli IBC isolati utilizzando questa tecnica di micropipetting della bocca possono quindi essere utilizzati in altre analisi a valle a singola cella, come il QRTPCR o il sequenziamento dell'RNA.