Rilevamento dell'endotossina in Nano-formulazioni utilizzando dosaggi di Limulus Amoebocyte Lysate (LAL)

Rilevamento di endotossine in nanomateriali ingegnerizzati rappresenta una delle grandi sfide nel campo della nanomedicina. Qui, presentiamo un caso di studio che descrive il quadro composto da tre diversi formati LAL per stimare il potenziale contaminazione di endotossina in nanoparticelle.

Questo metodo può aiutare a rispondere in campo medico sulla sicurezza dei nano medicinali. Il vantaggio di questa tecnica è che è standard, e viene utilizzato in tutto il mondo per la valutazione dei prodotti, ai nano medicinali. Dimostrazione della procedura, sarà Barry Neun, presso il Nano Technology Characterization Lab.

Per la preparazione standard di calibrazione, utilizzare 900 microlitri di limulus amebocyte lysate o acqua di grado LAL. E 100 microlitri di endotossina standard di controllo, per preparare tutte le diluizioni intermedie necessarie, per consentire la preparazione di uno standard di calibrazione con una concentrazione di un'unità di endotossina per millilitro. Quindi, utilizzando 900 microlitri di acqua di grado LAL e 100 microlitri di un'unità di endotossine per millilitro standard di calibrazione, preparare un secondo standard di calibrazione, a una concentrazione di 0,1 unità di endotossine per millilitro.

Quindi ripetere la diluizione seriale di dieci volte per preparare due standard di calibrazione più bassi. Ottenere un totale di quattro standard di calibrazione, che vanno da 0001 a un'unità di endotossina per millilitro. Per preparare un'unità di endotossina 05 per controllo di qualità millilitro, combina 50 microlitri di un'unità di endotossina per millilitro di soluzione endotossina standard di controllo, con 950 microlitri di acqua di grado LAL.

Successivamente nel software selezionare le impostazioni dello strumento e creare il modello. Selezionare Raccogli dati e immettere l'ID test e il gruppo di dati nella scheda generale. Nella scheda hardware selezionare il tipo di strumento e il metodo LAL e verificare che sullo schermo venga visualizzato un numero di serie, l'ID di sistema e le informazioni sulla porta seriale.

Fare clic due volte per confermare la selezione dello strumento e la comunicazione con lo strumento e immettere gli ID campione nello stesso ordine in cui i campioni verranno testati. Quindi utilizzare i pulsanti predefiniti per immettere la curva standard di controllo negativo e testare i campioni. Aggiungere il volume appropriato di standard di calibrazione del controllo negativo e il controllo di qualità in tubi di vetro preeticati duplicati.

E aggiungere il volume appropriato di LAL al primo vile di prova. Vortice brevemente il vile e posizionare il flaconcino nelle fessure di prova appropriate nel carosello dello strumento. Prima di caricare i campioni, eseguire diverse diluizioni del nano materiale di prova entro la massima diluizione valida come dimostrato.

Per preparare un'unità di 05 endotossine per millilitro di controllo del miglioramento dell'inibizione, combinare 25 microlitri dell'unità di endotossina per millilitro della soluzione endotossina standard di controllo, con 475 microlitri del nano materiale in esame a una data diluizione. Dopo il vortice, caricare gli opportuni controlli di miglioramento dell'innovazione e i campioni di studio non spirati nello strumento. Quindi aliquota non spirata e i nano materiali chiodati ad una diluizione specifica in tubi preeticati.

Prima di vortice e caricamento nel carosello dello strumento. Per eseguire un Gel-Clot LAL, preparare l'endotossina standard di controllo a una concentrazione finale di quattro lambda e combinare 100 microlitri di serie, con 100 microlitri d'acqua, o campione di prova per ottenere una concentrazione finale di endotossine standard di controllo due lambda. Aggiungere 100 microlitri di Lysine ad ogni diluizione lambda.

Vortice brevemente i tubi e posizionare il rack di tubi in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per un'ora. Alla fine dell'incubazione, invertire i tubi con un movimento liscio e registrare manualmente i risultati utilizzando più per un coagulo fermo e meno per nessun coagulo o un coagulo sciolto. In questa analisi rappresentativa, la doxorubicina liposomiale PEGylated interferì con la LAL cromogenica alla diluizione cinque, tuttavia questa interferenza fu superata a diluizioni più elevate.

Il recupero dei picchi è stato compreso tra il 50 e il 200% quando la formulazione è stata testata a diluizioni 50 e 500 nella TORBIDITÀ e nel LAL cromogenico, nonché alla diluizione cinque, nel LAL torbidità. Se regolati dal fattore di diluizione, i risultati erano coerenti tra le delusioni in entrambi i saggi. Inoltre, i risultati sono stati coerenti tra i tre formati di saggio.

Ricorda che ogni campione ha la sua gamma di diluizioni, ogni formato LAL utilizza il suo standard di controllo nella doxin e nel lisato, e che i tubi utilizzati per preparare le diluizioni e per eseguire una reazione diversa per ogni saggio LAL. Per questa procedura altri metodi come Può essere eseguito per rispondere a domande aggiuntive sul materiale Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada alle suture e al campo della nano medicina, per esplorare le applicazioni mediche dei farmaci formulati dalla nanotecnologia negli esseri umani e modelli clinici tra cui, a titolo usare la soluzione ma non, primati, conigli, cani e ratti non umani. Non dimenticare che lavorare con doxin può essere estremamente pericoloso e le precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale, dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.