Name: In Vitro Scratch test per dimostrare gli effetti dellarsenico su migrazione delle cellule della pelle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Impara l'assay di scratch in vitro per studiare la migrazione cellulare cutanea esposta ad arsenico. Questo metodo fornisce dati preliminari sulla guarigione delle ferite prima di test in vivo.

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Ricerca riportata in questa pubblicazione è stata sostenuta dall'Istituto nazionale sulla salute delle minoranze e le disparità di salute del National Institutes of Health, sotto Premio numero U54MD012388. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

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Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Applicazione di questo test fornisce una valutazione di alto-rendimento e tempestiva della migrazione cellulare e può tradurre direttamente a complessi sistemi fisiologici5,6,7. Per questo motivo, il modello proposto di banco ha sintonizzato e praticato per valutare gli effetti di vari agenti terapeutici e le tossine ambientali su6di cicatrizzazione. Le concentrazioni di arsenico utilizzato in questo studio sono stati ritenuti rilevanti per l'ambiente attraverso la vasta ricerca di letteratura dei livelli di esposizione conosciuta e da una revisione retrospettiva dei dati vari basi14,15, 16,17,18,19,20,21. Uso di questo test di gratta e Vinci in vitro hanno dimostrato che l'esposizione a una concentrazione di arsenico all'interno l'alta, ma rilevanti per l'ambiente gamma, ritardo nella chiusura della ferita (migrazione cellulare).
Questo banco top model fu anche impiegato per isolare e studiare una linea singola cella (fibroblasti) per capire meglio come la migrazione dei fibroblasti contribuisce per ferire i risultati di guarigione. Inoltre, è difficile studiare le funzioni di una linea singola cella in sistemi complessi in vivo con molte altre cellule e tessuti presenti che possono interferire con l'analisi. Inoltre, il dosaggio fornisce il mezzo per raggiungere i dati di chiusura semi-quantitativa percentuale ferita che possono essere utilizzati per indirizzare specifici meccanismi cellulari attraverso i quali composti possono influenzare la guarigione della ferita. Ad esempio, celle utilizzate nell'analisi della memoria virtuale possono essere raccolti e memorizzate in un reagente desiderato e utilizzate nell'espressione genica (segnale mRNA) o l'espressione della proteina saggi22. Queste informazioni possono essere utili per lo sperimentatore, se cercano di capire ciò che segnali o proteine possono essere in gran parte contribuendo ai cambiamenti nella migrazione cellulare in presenza di diversi trattamenti (cioè, arsenico)22.
Fibroblasti cutanei neonatali umani sono stati selezionati per questo lavoro basato sul loro ruolo nella guarigione delle ferite. Tuttavia, questo protocollo di analisi gratta e Vinci è stato implementato utilizzando vari tipi di cellule e per una gamma di scopi di ricerca. Ad esempio, il dosaggio di gratta e Vinci è stato adottato nel campo dell'oncologia per studiare l'inibizione di migrazione di chemioterapia farmaci23; per la migrazione delle cellule del muscolo scheletrico, la proliferazione e diffusione24; per studiare l'effetto degli estratti della pianta sulla migrazione cellulare25; e per comprendere come la proliferazione e la migrazione dei cheratinociti contribuiscono alla ferita guarigione9. Inoltre, una carta precedente da Pinto et al valutato gli effetti dell'uranio (U) e plasma ricco di piastrine (PRP) sulla migrazione di hDFn utilizzando il dosaggio zero6. Lo scopo di questo lavoro era di capire l'entità a cui questo test potrebbe testare l'effetto di un agente pensato per rallentare la migrazione cellulare (U), come pure un agente pensato per accelerare la migrazione cellulare (PRP). Come si può vedere nel suddetto lavoro e ricerca da altri ricercatori, applicazione del dosaggio zero ha alto potenziale per l'uso in vari modelli sperimentali26. Nonostante il dettaglio fornito all'interno dei metodi, varianza dovrebbe essere previsto tra gli investigatori e gli esperimenti. Ad esempio, tassi di migrazione cellulare probabilmente varierà basato sulla linea cellulare in uso, oltre i micronutrienti necessari necessari per i tipi di cella univoci. Molte delle osservazioni importanti per aiutare nella vitalità e rendimento delle celle sono elencati come Note in tutto questo protocollo. Tuttavia, si raccomanda vivamente che gli investigatori seguano le raccomandazioni del produttore per condizioni di crescita ottimali e di utilizzare questo metodo come istruzioni supplementari per il lavoro di cultura generale delle cellule.
Anche se il dosaggio zero è estremamente versatile per lo studio dell'attività cellulare; polarizzazioni impreviste possono sorgere in tecniche di misurazione. Ad esempio, quando si utilizza ImageJ per tracciare manualmente fronti di migrazione cellulare, variazione potrebbe esistere tra gli utenti, che possono limitare l'accuratezza e la raccolta di dati rappresentativi. Si deve anche osservare che fronti di migrazione devono essere letta in cieco per il trattamento di minimizzare utente bias. Inoltre, identificare manualmente fronti di migrazione potrebbe causare errore di calcolo della media distanza ha viaggiato a causa della formazione di pseudopodio di cellule e la loro capacità di raggiungere adesioni focali di forma, che possono essere visivamente fuorviante. In modo simile, l'uso di fluorescente "Tracking cellulare" tinture sulla superficie delle cellule o proteine nucleari per rilevare migrazione involontariamente possono fissare le cellule con conseguente inesattezze quando si misura la migrazione cellulare nel corso del tempo. È consigliabile che opportuni controlli positivi o negativi essere iscritti entro l'esperimento per completamente valutare l'effetto del trattamento sulle linee cellulari. Pratica di questo test deve essere completato in riconoscimento dei suoi limiti. Questo test non garantisce che risultati di migrazione cellulare ottenuti dalla sperimentazione in vitro si tradurranno direttamente in vivo i risultati. Migrazione di cellulari e guarigione della ferita in un sistema vivente complesso coinvolge una moltitudine di tipi di cellule e segnali molecolari; ognuno dei quali ha il potenziale per influenzare le risposte di guarigione.
In sintesi, l'analisi di gratta e Vinci è stato trovato per fornire screening ad alta resa di migrazione cellulare in risposta alle mutevoli ambienti6,25. In particolare abbiamo utilizzato questo protocollo per rilevare correttamente le modifiche nella migrazione cellulare a seguito di esposizione all'arsenico alle varie dosi rilevanti per l'ambiente. Questi dati hanno fornito la giustificazione per utilizzare l'analisi di gratta e Vinci per ulteriore studio e valutare le vie meccanicistiche della migrazione cellulare in questo test e come queste vie sono alterate da esposizione all'arsenico.

La guarigione della ferita è costituito da una complessa serie di passaggi che implicano diversi tipi di cellule, molecole di segnalazione e di componenti della matrice extracellulare1di sovrapposizione. Insieme, questi componenti funzionano di concerto per ottenere la risoluzione della ferita o riparazione, che infine conduce alla formazione di una cicatrice fibrotica protettiva secondo il grado di trauma1. Per acquisire i singoli processi e funzioni di ferita in un esperimento di guarigione è difficile; singoli passi all'interno del processo di cicatrizzazione devono essere identificati ed analizzati separatamente. Tra i molti passaggi della guarigione delle ferite, il processo di migrazione cellulare è stato considerato critico durante la valutazione di guarigione tariffe2. Migrazione cellulare può essere osservato in tutte le fasi di guarigione della ferita e così richiede ulteriore comprensione di come le alterazioni di migrazione cellulare possono influire la chiusura della ferita. Ad esempio, la migrazione cellulare è visto in sia infiammazione fase precoce e tardiva, con l'aggregazione della piastrina e di coagulazione di sangue la ferita sito3. Questi eventi per evitare eccessiva perdita di sangue che formano un blocco temporaneo per riempire aree feriti privo di tessuto3. Piastrine in circolazione si sintetizzano e secernono mediatori vasoattivi insieme a fattori chemiotattici, quale segnale insieme per migrazione di infiammatoria dei leucociti (globuli bianchi) al tessuto ferito per riparazione4. Riepitelizzazione avviene nelle ore della lesione del tessuto e coinvolge che copre il sito della ferita attraverso attività e migrazione dei cheratinociti epiteliali per prevenire ulteriori contaminazioni o invasione di particelle estranee alla ferita sito2. Questi esempi catturano solo alcuni della migrazione cellulare molte funzioni associate con la guarigione delle ferite.
Il dosaggio di gratta e Vinci è stato descritto e utilizzato per capire meglio la migrazione cellulare ed i suoi molti ruoli nella cicatrizzazione5,6. Questo test è considerato semplicistico, fornisce ad alta velocità e consente al ricercatore di raccogliere dati sulla migrazione cellulare rappresentativo. Saggi di migrazione hanno dimostrato con successo che alcuni composti possono accelerare o rallentare la velocità di migrazione cellulare6. Inoltre, questi risultati di test forniscono informazioni fisiologiche traslazionale che possono essere utilizzati per formulare trattamenti di destinazione, le concentrazioni ed i geni di interesse prima sperimentazione in vivo di dosaggio. Il test richiede tecniche di coltura cellulare di base e forniture, una linea cellulare di scelta e tecnologia di imaging per catturare il movimento nel tempo o in movimento in risposta ai trattamenti.
Il dosaggio può essere facilmente manipolato o su misura per soddisfare le esigenze del ricercatore. Tuttavia, ci sono quattro domande di base da considerare prima della sperimentazione. Quali domande generali o specifici è/sono lo sperimentatore cercando di rispondere? Questo vale per la maggior parte delle ipotesi guidato ricerca; Tuttavia, è fondamentale per questo test perché determinerà molti dei parametri necessari per accuratamente e completamente rispondere a delle domande. Cosa linea cellulare o linee cellulari (se più) deve essere utilizzati per rappresentare il sistema fisiologico in fase di studio? Ad esempio, in un cutaneo ferita guarigione studio, dei fibroblasti dermici5,6,7, cellule staminali8, o dei cheratinociti epidermici9 potrebbe essere considerato per rappresentare le popolazioni di cellule che si trovano normalmente in abbondanza in pelle tessuto10. In alternativa, i neutrofili, macrofagi e altre cellule infiammatorie potrebbero essere valutati in questo sistema per rappresentare la migrazione delle cellule di altri componenti di guarigione della ferita all'interno della pelle tessuto10. Inoltre, identificare la linea di cella specifica in corso di valutazione contribuirà a identificare quali reagenti sono ottimali da utilizzare per promuovere l'attività metabolica cellulare. Come la migrazione cellulare sarà rintracciato/imaged? Ci sono una serie di tecniche usati per osservare la migrazione delle cellule all'interno di un piatto o un pallone. Ad esempio, tintura o fluorescente tagging cellule e utilizzo di fluorescenza o imaging confocale per rilevare cellule fornisce un contrasto forte, che permette al ricercatore di definire chiaramente cellulare vs non cellulare posizioni e movimento cellulare11 . Un'altra tecnica comune, descritta in questo studio, è l'uso di microscopia chiara invertita con contrasto di fase6,7. Questa alternativa a cella coloranti e fluorescenza permette all'utente di vivere traccia celle senza dover fissare terminalmente cellule prima di formazione immagine e permette anche di catturare le immagini degli stessi singoli pozzetti contenenti feriti monostrati di cellule attraverso punti di tempo. Misure di risultato che verrà utilizzato per l'analisi? Utilizzando le immagini raccolte in tutto lo studio, i dati possono essere generati in cui le modifiche ai tassi di migrazione cellulare possono essere compreso. Nel nostro laboratorio, microscopiche immagini acquisite con il microscopio ottico invertito vengono caricate di software di analisi di immagine e la chiusura della ferita per cento e sommato area sotto la curva (AUC) sono calcolati.
Ci metterà in evidenza l'uso specifico di questo test per delucidare le modifiche alla migrazione dei fibroblasti dermici in presenza di un contaminante ambientale noto, arsenico. L'arsenico è un metalloide naturale trovato all'interno della crosta terrestre. Varie località sono stati trovati con i livelli elevati di arsenico, che rappresenta un rischio per gli individui che vivono vicino a queste posizioni. Di conseguenza, le fonti di cibo e acqua sono stati indicati per hanno aumentato i livelli di contaminazione da arsenico, che aumenta la probabilità per gli individui a diventare esposti ad arsenico. Esposizione arsenica ambientale ha dimostrato di avere conseguenze a lungo termine di salute nelle popolazioni umane sopra o anche sotto l'attuale Agenzia di protezione ambientale Stati Uniti (USEPA) Max contaminante livello (MCL) di 10 ppb (10 µ g/L)12, 13. Sebbene USEPA ha impostato questo MCL e ritenuto sicuro per bere i limiti, le concentrazioni di arsenico che superano questo limite non sono rare nelle sorgenti d'acqua in tutto il mondo. Negli Stati Uniti del sud-ovest, numerosi terra-acqua, acqua di pozzo e molle sono stati documentati per contenere per quanto riguarda i livelli di arsenico14. Ad esempio, nella Valle Verde, AZ, Montezuma Well contiene 210 µ g/L di arsenico15. Acque sotterranee intorno al fiume Verde, AZ contiene 16 µ g/L di arsenico in media, con valori di picco raggiunto 1,3 mg/L15,16. In particolare, le concentrazioni di arsenico in molti pozzi nel capannone fiume Verde acqua superano 50 µ g/L15,16. Con questa conoscenza, ambientali rilevanti concentrazioni di arsenico sono stati selezionati che vanno dal basso il MCL a 0.1 µM (7,5 ppb), sopra il MCL a 10 µM (750 ppb) nell'attuale studiare14,15,16 , 17 , 18 , 19 , 20 .
Le informazioni raccolte da questi esperimenti verranno essere utilizzate come un indicatore precoce di potenziali modifiche ai tassi di migrazione cellulare in un in vivo della ferita contaminato da arsenico. In seguito, segnalazione molecole possono essere selezionati in base al loro ruolo nel facilitare la guarigione della ferita e la migrazione cellulare, ed esperimenti di espressione del gene di reazione a catena (qPCR) basato futuro della polimerasi quantitativa possono essere impostati al completamento della corrente studi. Se i tassi di migrazione in questo saggio cambiano in presenza di arsenico, specifici geni bersaglio coinvolti nella migrazione cellulare può essere la destinazione per gli effetti deleteri di arsenico e così può essere il meccanismo di rottura.

<table><tbody><tr><td>Cabina di sicurezza biologica di classe II A/B3</td><td>Forma Scientific</td><td>15201-816</td><td></td></tr><tr><td>Guanti in nitrile</td><td>Kimberly-Clark</td><td>55082</td><td></td></tr><tr><td>Bagno d'acqua</td><td>Modello di precisione</td><td>182</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio invertito</td><td>Leica</td><td>Q080318</td><td></td></tr><tr><td>CPR Centrifuga</td><td>Beckman</td><td>349702</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia analitica</td><td>Ohaus</td><td>I093 1125062111P</td><td></td></tr><tr><td>Carta di ponderazione</td><td>VWR</td><td>H351125781212A</td><td></td></tr><tr><td>Sacchetti per rischi biologici</td><td>Fisherbran</td><td>01-830A</td><td></td></tr><tr><td>Water Jacketed CO2 Incubator</td><td>Thermo Scientific</td><td>309739-31053</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina bilanciata Hanks</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Pipettatore automatico</td><td>Drummond</td><td>140685</td><td></td></tr><tr><td>p200 Pipetta</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p20 Pipetta</td><td>Gilson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Denominatore</td><td>Fisher Scientific</td><td>D59707</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Stain</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Pallone per fazzoletti T75</td><td>Corning</td><td>430725U</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 15 mL</td><td>Fisherbrand</td><td>05-539-5</td><td></td></tr><tr><td>Provetta conica da 50 mL</td><td>VWR</td><td>21008-178</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta da 5 mL</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11D</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta da 10 mL</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11E</td><td></td></tr><tr><td>Marcatore tissutale</td><td>Securline</td><td>92167</td><td></td></tr><tr><td>Salviette</td><td>Kintech</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>70% Etanolo</td><td>Fisher</td><td>63-67-0</td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipette senza filtro</td><td>Fisherbrand</td><td>16160210</td><td></td></tr><tr><td>Candeggina</td><td>Ottimo rapporto qualità-prezzo</td><td>220-04</td><td></td></tr><tr><td>96 pozzetti</td><td>Falcon</td><td>353915</td><td></td></tr><tr><td>Cryovial Rack</td><td>Nalgene</td><td>5030-0505</td><td></td></tr><tr><td>Alimentazione per ematocitometro</td><td>Gizmo</td><td>B00SCOGY56</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>Rack per provette coniche</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td>Piastra</tr> a <tr><td>12 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3598</td><td></td></tr><tr><td>Bicchiere per rifiuti</td><td>n/a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta da 1 mL</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11B</td><td></td></tr><tr><td>Righello a bordo dritto</td><td>n/ a</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblasti dermici neonatali umani (hDFn)</td><td>lotto: 1734, 2902</td><td>106-05n</td><td></td></tr><tr><td>Rstudio Statistical Software</td><td></td><td>ver: 3.5.1</td><td></td></tr><tr><td>Immagine J</td><td>NIH</td><td>ver: 1.8.0_112</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro scratch test per dimostrare gli effetti dell'arsenico su migrazione delle cellule della pelle

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

La comprensione dei meccanismi fisiologici di guarigione della ferita è stato al centro di ricerca in corso per molti anni. Questa ricerca si traduce direttamente in cambiamenti nella clinico standard utilizzati per il trattamento di ferite e diminuire la morbosità e la mortalità per i pazienti. Guarigione delle ferite è un processo complesso che richiede la funzione e l'interazione strategica di cellule e tessuti. Una delle molte funzioni criticamente importante di guarigione della ferita è individuale e collettiva di migrazione cellulare. Dopo un danno, varie cellule del sangue, tessuto connettivi ed epiteliali tessuti circostanti rapidamente la migrazione al sito della ferita mediante stimoli chimici e/o fisici. Questa risposta di migrazione può dettare in gran parte i risultati e il successo di una guarigione della ferita. Comprendere questa specifica funzione cellulare è importante per la medicina traslazionale che può portare a una migliore cicatrizzazione in esiti. Qui, descriviamo un protocollo utilizzato per capire meglio la migrazione cellulare per quanto riguarda la guarigione della ferita, e come le modifiche per l'ambiente cellulare possono alterare significativamente questo processo. In questo studio di esempio, fibroblasti cutanei sono stati coltivati in media completati con siero bovino fetale (FBS) come colture monostrato in recipienti di coltura del tessuto. Le cellule erano asetticamente trasferite in piastre di coltura di tessuti trattato 12-pozzetti e cresciute alla confluenza del 100%. Una volta raggiunta la confluenza, le cellule nello strato monomolecolare del verticalmente sono graffiate utilizzando una punta di pipetta p200. Arsenico diluito in terreno di coltura completato con FBS è stato aggiunto al singoli pozzetti a ecologicamente rilevanti dosi di 0,1-10 M. immagini sono state catturate ogni 4 ore (h) per un periodo di 24 ore utilizzando un microscopio ottico invertito per osservare la migrazione cellulare (ferita chiusura). Immagini singolarmente sono stati analizzati utilizzando software di analisi di immagine, e la chiusura della ferita per cento è stato calcolato. I risultati dimostrano che l'arsenico rallenta la guarigione della ferita. Questa tecnica fornisce una rapida e poco costoso prima schermata per la valutazione degli effetti di contaminanti sulla guarigione della ferita.

Dimensioni del campione (n) per tutti i gruppi di trattamento era n = 28. Cellule sono state coltivate con successo seguenti tecniche asettiche e protocolli del laboratorio (Figura 1). Uniforme graffi sono stati osservati in tutti i gruppi di trattamento con la larghezza media di gratta e Vinci misura 0,8 mm 0,4 mm (Figura 2). Gruppi di controllo avevano un'area sommata media sotto il valore di curva di 1,355.83; 0.01 µM come gruppi di trattamento ha avuto una media ha riassunto la zona sotto il valore di curva di 1,366.21; 0.1 µM come gruppi di trattamento ha avuto una media sommati area sotto il valore di curva di 1,326.24, 1,0 µM come gruppo di trattamento ha avuto una media ha riassunto la zona sotto il valore di curva di 1,295.10; e infine il 10 µM come gruppo di trattamento ha avuto una superficie media di sommati sotto il valore di curva di 535.12, che era statisticamente più basso rispetto a tutti gli altri gruppi (p &lt; 0,05) (Figura 3). R-programma per l'analisi statistica è stato utilizzato per eseguire un one-way ANOVA con una regolazione di post hoc di Tukey per determinare le differenze statistiche tra i gruppi di trattamento (p &lt; 0,05).
<img alt="Crescita cellulare sotto esposizione all'arsenico; risultati della microscopia; controllo, 1,0 μM e 10 μM As per oltre 20 ore." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: rappresentanza zero immagini di analisi su un periodo di 20 h. Immagini A-D rappresenta migrazione cellulare delle cellule di controllo; Immagini E-H rappresenta migrazione cellulare delle cellule contaminate con 1,0 µM come; immagini L rappresenta migrazione cellulare delle cellule contaminate con 10 µM come. Da queste immagini, è chiaro che la migrazione cellulare è rallentato in presenza di arsenico. Le immagini di controllo mostrano un graffio "guarito" completamente dopo 20 h, mentre gli altri due gruppi come trattamento non sono state "guariti". I 10 µM come trattamento inibita la chiusura completa complessivamente dopo 24 h. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Grafico a barre che mostra la risposta alla dose di arsenico; sommato AUC a concentrazioni variabili; risultati sperimentali." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58838/58838fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: arsenico rallenta la migrazione cellulare nel dosaggio zero. Immagini sono state catturate su un periodo di 24 h per osservare i cambiamenti a tassi di migrazione cellulare in presenza di diverse concentrazioni di arsenico. Immagini RAW sono state analizzate utilizzando un software automatizzato (ad esempio, in MATLAB), quali larghezza della ferita inizialmente misurato, quindi calcolata percentuale chiusura e, infine, area sotto la curva (AUC). Barre di errore rappresentano errore standard della media. I 10 µM come gruppo di trattamento ha rallentato statisticamente migrazione cellulare dei fibroblasti cutanei umani neonatali (hDFn), indicato da un valore AUC statisticamente inferiore, rispetto a tutti gli altri gruppi di trattamento con un one-way ANOVA con una regolazione di post hoc di Tukey (p &lt; 0.05). Le differenze statistiche sono rappresentate dalle lettere "A" e "B", che sono stati ottenuti attraverso l'utilizzo del metodo di visualizzazione compatta lettera disponibile nel programma di R. Trattamenti che non condividono una comune lettera sono statisticamente significativi, da altro (p &lt; 0,05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58838/58838fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo studio si concentra su un modello in vitro di ferita guarigione (scratch test) come un meccanismo per la determinazione di contaminanti ambientali come migrazione cellulare di influenza di arsenico. I risultati dimostrano che questo test in vitro fornisce indicazioni rapide e precoce dei cambiamenti in materia di migrazione cellulare prima della sperimentazione in vivo .

In Vitro Scratch test per dimostrare gli effetti dell'arsenico su migrazione delle cellule della pelle

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

La migrazione cellulare è un processo critico di guarigione delle ferite che può alterare drasticamente l'esito di una ferita curativa. Questo protocollo consente ai ricercatori di comprendere meglio l'effetto di vari composti sulla migrazione cellulare durante la guarigione delle ferite. Che spesso può portare a strategie di trattamento mirate per la medicina clinica.Il test scratch è un approccio economico e ad alta produttività per generare dati significativi sulla guarigione delle ferite prima di test in vivo costosi e dispendiosi in termini di tempo. Il saggio scratch come metodo è particolarmente rilevante nelle applicazioni di guarigione delle ferite. Più specificamente, la pelle.Tuttavia, il saggio è in realtà un saggio di migrazione, e potrebbe essere applicato a qualsiasi tipo di cella in cui la migrazione delle cellule è interessante da misurare o da catturare. Simile alla classica coltura cellulare e tissutale, alle procedure operative standard, all'allenamento, alla tecnica e alla pratica, alla pratica, alla pratica. Questi sono la chiave del successo con il test scratch.A dimostrare la procedura saranno Nathan Cruz, uno studente di master, e Oscar Lujan, un ricercatore universitario. Per iniziare questa procedura, preparare l'armadio biosicurezza II utilizzando una soluzione acquosa isopropile al 70% per eseguire una salvietta igienica, a partire dalle pareti posteriori e laterali e lavorando fino alla piastra di base. Pulire anche tutti i materiali che verranno utilizzati nel saggio prima di metterli nell'armadio.Quindi, ottenere fiale contenenti la linea cellulare crioconservata desiderata e posizionarne una in un bagno d'acqua profondo un centimetro a 37 gradi Celsius per scongelarsi. Aggiungere 10 millilitri di mezzo integrati con 10%FBS in un pallone da coltura tissutale T75. Aprire il flaconcino contenente il materiale cellulare e aspirare con cura la soluzione.Quindi trasferire le cellule nel pallone T75. Rimuovere un millilitro di supporto dal pallone e trasferirlo di nuovo nel flaal, quindi trasferirlo di nuovo nel pallone per massimizzare la resa cellulare dal flaal. Stringere il cappuccio del pallone e scuoterlo delicatamente per disperdere uniformemente le cellule in sospensione su tutta la superficie.Successivamente, etichettare il pallone con le informazioni mostrate qui e posizionarlo in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per 72 ore. In primo luogo, recuperare il pallone di coltura tissutale dall'incubatore e osservare le cellule aderenti come delineato nel protocollo di testo. Aspirare l'intero volume di supporti dal pallone e trasferirlo in un contenitore di rifiuti.Aggiungere cinque millilitri di soluzione salina bilanciata al pallone e scuoterlo delicatamente per risciacquare qualsiasi supporto in eccesso, cellule morte o prodotto di scarto. Quindi rimuovere l'intero volume di soluzione salina dal pallone e scartarlo in un contenitore di rifiuti. Successivamente, aggiungere due millilitri di tripina al pallone e scuoterlo delicatamente per disperdere l'enzima sulle cellule aderenti.Assicurarsi che la superficie aderente sia completamente satura e posizionare il pallone di tessuto nell'incubatrice per due o tre minuti. Successivamente, toccare delicatamente il lato del pallone da tre a cinque volte per facilitare il distacco della cellula. Pulire il pallone con il 70% di alcol e posizionare nell'armadio per la biosicurezza.Aggiungere cinque millilitri di mezzi stock al pallone tissutale per fermare la reazione del substrato enzimatico. Aspirare l'intero volume di liquido dal pallone e trasferirlo in un tubo conico sterile da 15 millilitri. Centrifuga a 200 volte g e a 25 gradi Celsius per cinque minuti.Quindi utilizzare il 70% di alcol per pulire il tubo contenente le cellule pellettate e posizionarlo all'interno dell'armadio per la biosicurezza. Pipetta fuori dal supporto, lasciando dietro di sé circa 250 microlitri di fluido con il pellet cellulare. Eseguire la parte inferiore del tubo conico attraverso le fessure del flaconcino di un rack per tubi a microcentrifugo per creare una vibrazione rapida e disturbare e rimescolare il pellet di cella.Una volta completata correttamente, la nuova soluzione cellulare apparirà come una miscela torbosa senza pellet rimanente. Aggiungere due millilitri di supporto alla resospensione cellulare. Pipettare delicatamente le celle su e giù per il lato del tubo 20 volte per rompere eventuali grumi.E registrare il volume totale delle sospensioni cellulari. Quindi, utilizzare una pipetta sterile per aggiungere 20 microlitri di calcio blu trypan a un pozzo vuoto di una piastra da 96 po '. Utilizzando una punta sterile di pipetta, trasferire 20 microlitri di calcio cellulare dal tubo da 15 millilitri al pozzo contenente la soluzione blu del trypan.Pipettare delicatamente per mescolare il contenuto e trasferire 10 microlitri della miscela tra lo slittamento del coperchio e la camera di conteggio su un emocitometro. Contare solo le celle al centro e quattro quadrati d'angolo, sommando separatamente sia il conteggio totale delle celle che il conteggio delle celle non vitali per i cinque quadrati identificati. Dopo aver calcolato il conteggio delle celle vitali, contrassegnare una linea orizzontale sul fondo di una piastra da 12 poggia-porsi per fungere da segno di riferimento durante l'imaging.Diluire il materiale cellulare con il supporto a una densità di 19.000 cellule per millilitro. Quindi seminare ogni pozzo della piastra da 12 pozzi con un millilitro del calcio cellulare diluito, mescolando periodicamente il calcio cellulare per garantire una semina uniforme delle cellule in tutti i 12 pozzi. Etichettare ogni piatto con le informazioni mostrate qui.E posizionarlo in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica fino a quando le cellule non crescono al 100% di confluenza. Recuperare una piastra di 12 po 'con le celle dall'incubatore. Utilizzando un microscopio con un obiettivo 10x, osservare le cellule e determinare la confluenza all'interno di ogni pozzo.Successivamente, aspirare e smaltire i mezzi di crescita da ogni pozzo. Assemblare un pipetter P200 con una punta sterile da 1-200 microliter. In ogni pozzo, scivolare la punta della pipetta attraverso la superficie della cella dalla posizione delle 12:00 alla posizione delle 6:00 per produrre una ferita finta di graffio.Risciacquare ogni bene con un millilitro di soluzione salina bilanciata per rimuovere detriti in eccesso e ciuffi cellulari. Scuotere la piastra da un lato all'altro per facilitare il lavaggio. Quindi rimuovere e smaltire la soluzione salina bilanciata da ogni pozzo.Utilizzando un pipetter P1000 con una punta da 1.000 microlitri, aggiungere 1.000 microlitri dalle scorte di arsenico preparate in pozzi che sono stati assegnati casualmente con un gruppo di trattamento. Utilizzare una nuova punta di pipetta per ogni pozzo e registrare l'ora in cui vengono aggiunti i trattamenti. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.Per immagini le lastre, cattura le immagini di ogni pozzo con un ingrandimento obiettivo di 10 volte ogni quattro ore in un periodo di 24 ore. Fare riferimento alla linea precedentemente disegnata sul fondo della piastra per immaginere la stessa posizione lungo il graffio all'interno di ogni pozzo in ogni punto di tempo. In questo studio, un test di graffio in vivo viene utilizzato per osservare gli effetti dell'arsenico sulla migrazione cellulare.Graffi uniformi si osservano in tutti i gruppi di trattamento, con una larghezza media dei graffi di circa 0,8 millimetri. Le cellule di controllo mostrano un graffio completamente guarito dopo 20 ore. I due gruppi arsenici non mostrano questo livello di guarigione.Con il trattamento 10 micromolare che inibisce completamente la chiusura per 24 ore. Questi risultati dimostrano che la presenza di arsenico rallenta la migrazione cellulare. Le immagini grezze acquisite durante il test vengono analizzate utilizzando un software automatizzato per misurare la larghezza della ferita, quindi calcolare la chiusura percentuale e infine calcolare l'area sotto la curva.Il gruppo di trattamento a 10 micromolari mostra una migrazione cellulare statisticamente rallentata dei fibroblasti dermici neonatale umani rispetto a tutti gli altri gruppi di trattamento. È importante praticare a fondo questa tecnica per aumentare la coerenza quando si graffiano le cellule. La variabilità involontaria tra i saggi può potenzialmente distorcere i dati e alterare le conclusioni.Ulteriori tecniche molecolari come la reazione quantitativa a catena della polimerasi e i saggi immunoassorbenti legati agli enzimi possono essere utilizzate test post-graffio per identificare segnali messenger e proteine che possono essere il bersaglio per i cambiamenti nella migrazione cellulare osservati nel saggio. Questo saggio ha contribuito alla comprensione da parte dei ricercatori della metastasi tumorale, delle nuove terapie oncologiche emergenti, delle cellule staminali e della medicina rigenerativa e di molte altre pietre miliari scientifiche.

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