Esperimenti di Bilayer del lipido con contatto bolla lipidici per Patch-affrancate
16 gennaio 2019
Qui, presentiamo un protocollo per la formazione di lipidici utilizzando un metodo di doppio strato di contatto bolla. Una bolla di acqua è soffiata in un solvente organico, per cui un monostrato è formato all'interfaccia acqua-olio. Due pipette sono manipolati per ancorare le bolle per formare un doppio strato.
Il metodo Contact Bubble Bilayer è una tecnica alternativa per i bistrati lipidici convenzionali. e questo metodo consente vibrazioni più versatili attraverso la membrana. Il metodo CBB integra i vantaggi del bistrato lipidico planare e del metodo del patch clamp.
Come tecnica lipidica bistrato si può formare una CBB con una composizione lipidica arbitraria. Abbiamo sviluppato una CBB per registrazioni di corrente a canale singolo con un elevato rapporto segnale/rumore. Questo metodo consente varietà di vibrazioni a membrana e offre una vasta piattaforma di tipo all'interfaccia della membrana del canale.
Tutti hanno provato a soffiare una bolla di sapone. Manovre simili vengono prese per la formazione di CBB per perfezionare manualmente la pressione applicata piuttosto che soffiare per bocca. Esercitati e goditi la CBB.
Per essere questa procedura disperdere i fosfolipidi in cloroformio a una concentrazione desiderata in un pallone inferiore rotondo. Posizionare la soluzione fosfolipidica su un evaporatore rotante collegato a una bombola di gas azoto. Ruotare il pallone sotto il flusso di azoto a temperatura ambiente fino a quando non appare una sottile pellicola fosfolipidica.
Quindi posizionare il pallone aperto in un essiccatore collegato a una pompa per vuoto. Utilizzando la pompa per vuoto aspirare l'interno dell'essiccatore per diverse ore per rimuovere accuratamente il cloroformio. Successivamente aggiungere un volume appropriato di soluzione elettrolitica al pallone e sospendere il fosfolipide per ottenere due milligrmi per sospensione fosfolipidica millilitro.
Sonciate la sospensione per 20-30 secondi utilizzando un sonicatore da bagno per ottenere una sospensione vesicolare multistrato. Per la preparazione di proteoliposomes che contengono proteine del canale ionica, aggiungere una soluzione proteica alla sospensione vescicolare multistrato. E sonicare per diversi secondi usando il sonicatore da bagno.
Per preparare pipette di vetro di grandi dimensioni, posizionare un capillare di vetro in un estrattore di pipetta e fabbricare la micropipetta con una punta affusolata fine attraverso la trazione in due gradini. Quindi impostare la micropipetta su una micro fucina e contattare la punta della micropipetta su un filamento di platino nella porzione affusolata con un diametro da 30 a 50 micrometri. Scaldare brevemente il filamento e spegnerlo immediatamente.
Utilizzando acqua distillata ed etanolo pulire la superficie dello scivolo di vetro con un pozzo poco profondo. Successivamente applicare il reagente siliconizzante sullo scivolo di vetro e lasciare asciugare completamente il reagente nell'aria. Quindi posizionare lo scivolo di vetro sul palco di un microscopio invertito.
Aggiungere 100 microlitri di esadecano nel pozzo poco profondo dello scivolo di vetro siliconizzato. L'uso di una siringa tubercorina riempie la soluzione elettrolita fino alla metà della lunghezza della micropipetta. Successivamente impostare la micropipetta sul supporto in micropipetta con la porta di pressione, consentendo all'elettrodo di filo di cloruro argento/argento di immergersi nella soluzione elettrolita pipetta.
Collegare uno dei supporti di micropipetta allo stadio di testa di un amplificatore a morsetto patch e l'altro al terreno elettrico. Successivamente collegare un microiniettore alla porta di pressione del supporto di micropipetta. Regolare la micropipetta in una posizione appropriata sopra lo stadio di un microscopio invertito utilizzando il micromanipolatore.
Per regolare il potenziale di offset dell'elettrodo, posizionare un microliter della stessa soluzione elettrolitica utilizzata per riempire la micropipetta sulla superficie piana attorno al pozzo poco profondo dello scivolo di vetro per creare una cupola elettrolitica. Immergere la punta di entrambe le micropipette nella cupola dell'elettrolita. Successivamente regolare il potenziale di offset dell'elettrodo dell'amplificatore del morsetto patch.
Per disegnare la soluzione liposoma dalla punta, aggiungere un microlitro di soluzione liposoma sulla superficie piana attorno al pozzo poco profondo del vetro scorrevole. Quindi posizionare la punta della micropipetta nel liposoma contenente cupola. Aspirare la soluzione contenente liposoma utilizzando il microiniettore.
Ripetere la procedura per l'altro mircopipette per l'aspirazione dei liposomi ricostituiti del canale. Ora posizionare la micropipetta nell'esadecano nel pozzo poco profondo. Soffiare lentamente una bolla d'acqua aumentando la pressione fino a quando la bolla raggiunge la dimensione desiderata e mantenere la stessa pressione in seguito.
Scartare la bolla passando la punta attraverso l'interfaccia olio-aria se è difficile mantenere stabili le dimensioni della bolla. Ripetere le procedure fino a formare due bolle stabili. Stabilire un contatto tra le due bolle.
Mettere a punto la pressione per mantenere le dimensioni della bolla, perché le dimensioni possono cambiare gradualmente anche alla pressione costante intra-bolla. Impostare il potenziale della membrana sul valore appropriato utilizzando l'amplificatore di attestazione della patch e attendere che la corrente del canale emerga. Per una formazione stabile dei due livelli lipidici è essenziale pulire i blotter.
La preparazione capillare del vetro o della pipetta deve essere lavata accuratamente ed evitare la contaminazione da parte delle molecole di detergente. Una volta che la CBB aveva formato le molecole di canale in soluzione acquosa o nel liposoma sono state spontaneamente inserite nel bistrato nell'arco di pochi o decine di minuti. Gli inserimenti dei canali sono stati confermati dal saggio aumento dell'ampiezza di corrente sotto il potenziale della membrana applicata.
Un bistrato formato dal metodo CBB può essere disintegrato in due monostrati. La corrente del canale pTB è emersa immediatamente dopo aver collegato i due monostrati. E la corrente divenne più grande man mano che le sono di contatto aumentavano l'ampiezza della corrente era sincronizzata con la manipolazione del detach attach della CBB.
Se il numero soffia fuori dalle bolle aumenta la concentrazione lipidica nella soluzione acquosa diminuisce e il monostrato non si forma. Quindi cerca di alleviare la pressione sulla sezione liposoma. Una volta stabilita la formazione di CBB e la ricostituzione del canale, puoi provare a variare le composizioni di soluzione acquosa e membrana tramite profusione o iniettando sostanze idrofile o idrofobiche.
Il metodo CBB ha aperto modi versatili per esplorare gli interplay canale-membrana.
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Panoramica
Questo studio introduce il metodo Contact Bubble Bilayer (CBB) per formare bilayer lipidici, offrendo un'alternativa innovativa alle tecniche convenzionali. Il metodo consente vibrazioni versatili della membrana e registrazioni ad alto rapporto segnale-rumore di correnti di singolo canale, migliorando lo studio delle interazioni canale-membrana.
Componenti chiave dello studio
Area di scienza
- Biofisica
- Eletrofisiologia
- Tecnologia delle membrane lipidiche
Sfondo
- I bilayer lipidici sono vitali per studiare le proteine di membrana.
- I metodi convenzionali hanno limitazioni in termini di flessibilità e stabilità.
- Il metodo CBB combina i vantaggi dei bilayer lipidici planari e delle tecniche patch clamp.
- Questa tecnica facilita registrazioni di alta qualità delle attività dei canali ionici.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo robusto per la formazione di bilayer lipidici utilizzando un approccio a bolla di contatto.
- Consentire registrazioni di singolo canale con qualità migliorata.
- Esplorare la dinamica della membrana e le interazioni canale-membrana.
Metodi utilizzati
- Il metodo CBB utilizza la manipolazione controllata di bolle d'acqua in un solvente organico per creare bilayer.
- I fosfolipidi sono preparati e sonificati per formare vescicole multistrato, seguite dall'incorporazione di proteine del canale ionico.
- Le micropipette sono fabbricate per un'applicazione precisa e stabilizzazione delle bolle durante la formazione del bilayer.
- Gli setup sperimentali coinvolgono amplificatori patch clamp per monitorare le correnti dei canali ionici dopo la formazione del bilayer.
Risultati principali
- Il metodo CBB supporta efficacemente l'inserimento di proteine del canale nei bilayer, confermato da cambiamenti nell'ampiezza della corrente.
- Sono stati formati bilayer stabili, dimostrando la capacità di registrare correnti di singolo canale.
- Il metodo ha dimostrato che le regolazioni della dimensione della bolla possono influenzare la stabilità della membrana e la continuità della corrente.
Conclusioni
- Il metodo CBB rappresenta un significativo progresso nella formazione di bilayer lipidici, consentendo applicazioni versatili negli studi elettrofisiologici.
- Questo approccio innovativo migliora la nostra comprensione della dinamica canale-membrana.
- I risultati sottolineano il potenziale di adattare le tecnologie dei bilayer lipidici per varie condizioni sperimentali.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
The Contact Bubble Bilayer (CBB) method addresses a key challenge in ion channel research by enabling high signal-to-noise ratio recordings while allowing precise control over lipid composition and membrane mechanics. This capability supports mechanistic de-risking of therapeutic targets by clarifying channel-membrane interactions under physiologically relevant conditions. The method enhances predictive confidence in early discovery by providing a reproducible platform for functional validation of ion channel targets.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by studying ion channel function in defined lipid environments.
- Operational Value: Supports functional target validation through reproducible single-channel current measurements with low electrical noise.
- Predictive Value: Facilitates biological de-risking by elucidating how lipid composition modulates channel activity and stability.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated lipid bilayer systems for downstream compound screening by incorporating channel-reconstituted liposomes.
- Operational Value: Enables assay standardization via controlled bubble formation and consistent bilayer renewal.
- Scalability: Supports platform reuse through repeated CBB formation and disruption cycles.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains relevance from discovery through preclinical work by modeling disease-relevant lipid compositions.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of how membrane perturbations affect channel function, informing safety and efficacy predictions.
- Biomarker Alignment: Supports identification of lipid-dependent channel phenotypes that may correlate with clinical responses.
Pipeline & Workflow Integration
The CBB method fits within the discovery continuum from target validation to lead identification, providing a lipid-controllable platform for ion channel characterization prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling controlled variation of membrane lipid composition.
- Screening: Delivers assay readiness through reproducible bilayer formation and stable ion channel incorporation.
- Analytics: Provides quantitative single-channel current readouts that allow comparison of channel behavior under different conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical work by enabling study of channel-membrane interactions in disease-relevant lipid environments.
- Enterprise Reuse: Functions as a renewable capability rather than a single-use technique, supporting sustained use across projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in channel-membrane interactions.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through controlled bubble size maintenance and bilayer renewal.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing reliable functional data on ion channel targets early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of ion channel programs based on validated membrane-dependent activity.
Implementation Considerations
- Requires expertise in lipid handling, electrophysiology, and microfluidic manipulation.
- Depends on patch-clamp amplifiers, glass capillary pullers, and microinjectors for bubble formation and pressure control.
- Necessitates cross-team standardization of lipid preparation, bubble size control, and cleaning protocols.
- Involves adaptation considerations when applying the method to different ion channel types or lipid mixtures.
- Includes practical limitations such as the need for meticulous bubble size maintenance and contamination avoidance during pipette preparation.
