Esperimenti di Bilayer del lipido con contatto bolla lipidici per Patch-affrancate

Il metodo Contact Bubble Bilayer è una tecnica alternativa per i bistrati lipidici convenzionali. e questo metodo consente vibrazioni più versatili attraverso la membrana. Il metodo CBB integra i vantaggi del bistrato lipidico planare e del metodo del patch clamp.

Come tecnica lipidica bistrato si può formare una CBB con una composizione lipidica arbitraria. Abbiamo sviluppato una CBB per registrazioni di corrente a canale singolo con un elevato rapporto segnale/rumore. Questo metodo consente varietà di vibrazioni a membrana e offre una vasta piattaforma di tipo all'interfaccia della membrana del canale.

Tutti hanno provato a soffiare una bolla di sapone. Manovre simili vengono prese per la formazione di CBB per perfezionare manualmente la pressione applicata piuttosto che soffiare per bocca. Esercitati e goditi la CBB.

Per essere questa procedura disperdere i fosfolipidi in cloroformio a una concentrazione desiderata in un pallone inferiore rotondo. Posizionare la soluzione fosfolipidica su un evaporatore rotante collegato a una bombola di gas azoto. Ruotare il pallone sotto il flusso di azoto a temperatura ambiente fino a quando non appare una sottile pellicola fosfolipidica.

Quindi posizionare il pallone aperto in un essiccatore collegato a una pompa per vuoto. Utilizzando la pompa per vuoto aspirare l'interno dell'essiccatore per diverse ore per rimuovere accuratamente il cloroformio. Successivamente aggiungere un volume appropriato di soluzione elettrolitica al pallone e sospendere il fosfolipide per ottenere due milligrmi per sospensione fosfolipidica millilitro.

Sonciate la sospensione per 20-30 secondi utilizzando un sonicatore da bagno per ottenere una sospensione vesicolare multistrato. Per la preparazione di proteoliposomes che contengono proteine del canale ionica, aggiungere una soluzione proteica alla sospensione vescicolare multistrato. E sonicare per diversi secondi usando il sonicatore da bagno.

Per preparare pipette di vetro di grandi dimensioni, posizionare un capillare di vetro in un estrattore di pipetta e fabbricare la micropipetta con una punta affusolata fine attraverso la trazione in due gradini. Quindi impostare la micropipetta su una micro fucina e contattare la punta della micropipetta su un filamento di platino nella porzione affusolata con un diametro da 30 a 50 micrometri. Scaldare brevemente il filamento e spegnerlo immediatamente.

Utilizzando acqua distillata ed etanolo pulire la superficie dello scivolo di vetro con un pozzo poco profondo. Successivamente applicare il reagente siliconizzante sullo scivolo di vetro e lasciare asciugare completamente il reagente nell'aria. Quindi posizionare lo scivolo di vetro sul palco di un microscopio invertito.

Aggiungere 100 microlitri di esadecano nel pozzo poco profondo dello scivolo di vetro siliconizzato. L'uso di una siringa tubercorina riempie la soluzione elettrolita fino alla metà della lunghezza della micropipetta. Successivamente impostare la micropipetta sul supporto in micropipetta con la porta di pressione, consentendo all'elettrodo di filo di cloruro argento/argento di immergersi nella soluzione elettrolita pipetta.

Collegare uno dei supporti di micropipetta allo stadio di testa di un amplificatore a morsetto patch e l'altro al terreno elettrico. Successivamente collegare un microiniettore alla porta di pressione del supporto di micropipetta. Regolare la micropipetta in una posizione appropriata sopra lo stadio di un microscopio invertito utilizzando il micromanipolatore.

Per regolare il potenziale di offset dell'elettrodo, posizionare un microliter della stessa soluzione elettrolitica utilizzata per riempire la micropipetta sulla superficie piana attorno al pozzo poco profondo dello scivolo di vetro per creare una cupola elettrolitica. Immergere la punta di entrambe le micropipette nella cupola dell'elettrolita. Successivamente regolare il potenziale di offset dell'elettrodo dell'amplificatore del morsetto patch.

Per disegnare la soluzione liposoma dalla punta, aggiungere un microlitro di soluzione liposoma sulla superficie piana attorno al pozzo poco profondo del vetro scorrevole. Quindi posizionare la punta della micropipetta nel liposoma contenente cupola. Aspirare la soluzione contenente liposoma utilizzando il microiniettore.

Ripetere la procedura per l'altro mircopipette per l'aspirazione dei liposomi ricostituiti del canale. Ora posizionare la micropipetta nell'esadecano nel pozzo poco profondo. Soffiare lentamente una bolla d'acqua aumentando la pressione fino a quando la bolla raggiunge la dimensione desiderata e mantenere la stessa pressione in seguito.

Scartare la bolla passando la punta attraverso l'interfaccia olio-aria se è difficile mantenere stabili le dimensioni della bolla. Ripetere le procedure fino a formare due bolle stabili. Stabilire un contatto tra le due bolle.

Mettere a punto la pressione per mantenere le dimensioni della bolla, perché le dimensioni possono cambiare gradualmente anche alla pressione costante intra-bolla. Impostare il potenziale della membrana sul valore appropriato utilizzando l'amplificatore di attestazione della patch e attendere che la corrente del canale emerga. Per una formazione stabile dei due livelli lipidici è essenziale pulire i blotter.

La preparazione capillare del vetro o della pipetta deve essere lavata accuratamente ed evitare la contaminazione da parte delle molecole di detergente. Una volta che la CBB aveva formato le molecole di canale in soluzione acquosa o nel liposoma sono state spontaneamente inserite nel bistrato nell'arco di pochi o decine di minuti. Gli inserimenti dei canali sono stati confermati dal saggio aumento dell'ampiezza di corrente sotto il potenziale della membrana applicata.

Un bistrato formato dal metodo CBB può essere disintegrato in due monostrati. La corrente del canale pTB è emersa immediatamente dopo aver collegato i due monostrati. E la corrente divenne più grande man mano che le sono di contatto aumentavano l'ampiezza della corrente era sincronizzata con la manipolazione del detach attach della CBB.

Se il numero soffia fuori dalle bolle aumenta la concentrazione lipidica nella soluzione acquosa diminuisce e il monostrato non si forma. Quindi cerca di alleviare la pressione sulla sezione liposoma. Una volta stabilita la formazione di CBB e la ricostituzione del canale, puoi provare a variare le composizioni di soluzione acquosa e membrana tramite profusione o iniettando sostanze idrofile o idrofobiche.

Il metodo CBB ha aperto modi versatili per esplorare gli interplay canale-membrana.