Preparazione di Poly(pentafluorophenyl acrylate) funzionalizzati SiO₂ perline per la purificazione della proteina

Questo metodo può essere utilizzato per preparare superfici attivate da biomolecole, che hanno applicazioni in aree come la somministrazione di farmaci, il rilevamento biologico dei bei bei e la bio separazione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che i pennelli poli PFPA sono altamente reattivi con le ammine e l'immobilizzazione degli anticorpi si ottiene incubando in soluzione tampone per alcune ore. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la purificazione proteica attraverso l'immunopurificazione, poiché l'anticorpo immobilizzato può legarsi con successo con gli antigeni bersaglio.

Sebbene questo metodo sia dimostrato per la mobilitazione degli anticorpi e la purificazione delle proteine, può anche essere applicato ad altri sistemi che richiedono mobilizzazione biomolecolare. Per trattare le perle di biossido di silicio con APTES, ottenere prima particelle di biossido di silicio sotto forma di una sospensione acquosa del volume del 5%. Unire 0,8 millilitri di sospensione di biossido di silicio con 40 milligrammi di APTES e otto millilitri di metanolo in una fiala a scintillazione da 20 millilitri dotata di una barra di agitazione.

Lasciare procedere la reazione a temperatura ambiente per cinque ore con agitazione vigorosa. Dopo cinque ore, trasferire la soluzione su un tubo conico. Per isolare le perline di biossido di silicone funzionalizzate APTES, centrifugare la soluzione a 10.000 G per cinque minuti.

Quindi rimuovere il supernatante. Ora lavare le perline ridispurandole in tre millilitri di metanolo fresco. Agitare il tubo a mano per la miscelazione, ma se necessario, migliorare la dispersione per sonicazione in un bagno d'acqua per alcuni secondi.

Centrifugare come prima e ripetere il passaggio di lavaggio ancora una volta. Unire il metanolo lavare le perline di biossido di silicone con tre millilitri di solfossido di dimetile o DMSO. Agitare la miscela a mano o, se necessario, sonicare per alcuni secondi fino a quando le perline non sono completamente disperse nel DMSO.

Dopo la centrifugazione in precedenza, rimuovere il supernatante. Ripetere la fase di centrifugazione un'ultima volta per garantire il completo scambio di solventi dal metanolo al DMSO. Per preparare la soluzione poli PFPA, sciogliere 20 milligrammi di poli PFPA in due millilitri di DMSO in una fiala a scintillazione da 20 millilitri.

Per preparare la soluzione PEG, sciogliere l'ammina funzionalizzata PEG in un millilitro di DMSO. Ora trasferisci la soluzione PEG alla soluzione poly PFPA. Reagire a temperatura ambiente per un'ora con agitazione vigorosa.

Trasferire un millilitro delle perline di biossido di silicio funzionalizzate APTES sospese in DMSO nella soluzione di POLI PFPA sostituita PEG. Lasciare che l'innesto tra perline di biossido di silicio funzionalizzate poli PFPA e APTES proceda a temperatura ambiente per un'ora con agitazione vigorosa. Quindi isolare le perline per centrifugazione a 10.000 G per cinque minuti, seguita dalla rimozione del supernatante.

Lavare le perline aggiungendo tre millilitri di DMSO e mescolare a mano o con alcuni secondi di sonicazione. Centrifuga le perline come prima. E rimuovere il supernatante prima di ripetere il lavaggio DMSO due volte.

Lavare le perline altre due volte con tre millilitri di acqua distillata tripla. Quindi mescolare a mano o con pochi secondi di sonicazione. Centrifugare le perline come prima e rimuovere il supernatante.

Infine asciugare le perline a 40 gradi celsius in un forno a vuoto durante la notte. Aggiungere cinque milligrammi di perline di biossido di silicio innestato in poli PFPA a un tubo di microcentrifugo da 1,5 millilitri. Lavare le perline aggiungendo 800 microlitri di PBS e mescolare bene con il vortice.

Centrifugare le perline a 10.000 G a temperatura ambiente per un minuto. Rimuovere il supernatante e ripetere il passaggio di lavaggio tre volte. Ora aggiungi 350 microlitri di PBS fresco, 50 microlitri dello 0,1% PBST e 6,67 microgrammi dell'anticorpo.

Incubare circa 20 ore su un rotatore a quattro gradi celsius. Il giorno dopo, lavare le perline e la centrifuga a 400 G e quattro gradi celsius per un minuto. Quindi rimuovere il supernatante e aggiungere con cura 400 microlitri di tampone di lisi.

Rimpiorsi delicatamente le perline con pipettando su e giù cinque volte. Ripetere questo passaggio di lavaggio tre volte. Dopo il lavaggio finale, rimuovere il più possibile il supernatante.

Preparare le celle e il buffer di lisi come descritto nel protocollo di testo. Quindi rimescolare il pellet cellulare con 400 microlitri del tampone di lisi. Sonicare le cellule usando un ultra sonicatore.

Dopo la sonicazione, vortice brevemente. Quindi centrifugare il lisato a 20.000 G a quattro gradi celsius per 10 minuti. Trasferire il supernatante in un nuovo tubo di centrifuga da 1,5 millilitri.

Per eseguire l'immunoprecipitazione, trasferire 300 microlitri di lisato cellulare su perline di biossido di silicio innestato poli PFPA immobilizzate precedentemente preparate. Conservare 30 microlitri del lysate cellulare come campione di ingresso in un nuovo tubo di microcentrifugo. Incubare la miscela di perline di lisato per tre ore su un rotatore a quattro gradi celsius.

Dopo l'incubazione, centrifugare la miscela a 400 G a quattro gradi Celsius per un minuto. Rimuovere il supernatante e aggiungere con cura 400 microlitri di tampone di lavaggio. Rimpiorsi delicatamente le perline tubando su e giù circa cinque volte.

Dopo tre lavaggi, rimuovere il più possibile il supernatante. Aggiungere 30 microlitri di colorante di carico SDS 2x alle perline e al campione di ingresso. Quindi scaldarli per 10 minuti a 95 gradi celsius.

Dopo il riscaldamento, analizzare il campione utilizzando l'assorbimento occidentale o conservare il campione a meno 20 gradi celsius. Le perle di silice funzionalizzate vengono esaminate mediante spettroscopia fotoelettronica a raggi X, o XPS, per determinare la composizione superficiale. I dati XPS rappresentativi sono mostrati qui.

Dopo il trattamento con APTES, viene rilevato il picco di azoto 1s associato alla zona del gruppo amminico APTES. A seguito del trattamento poli PFPA, viene rilevato il picco di fluoro 1s associato alle unità PFP sul polimero. Viene attivato l'RNA della protein chinasi, o arricchimento PKR attraverso l'immunoprecipitazione, e il campione proteico alluso viene analizzato usando l'blotting occidentale.

Come previsto, le perline immobilizzate senza anticorpi o una miscela di anticorpi non specifica non mostrano alcun recupero di PKR. Le perline incubate con anti-PKR possono arricchire con successo pkr come indicato dalla presenza di una banda PKR e dall'assenza di banda GAPDH. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che quando si confrontano i sistemi, gli esperimenti IP e la successiva analisi western del gonfiore dovrebbero essere eseguiti contemporaneamente.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica può essere utilizzata per l'immobilizzazione di diversi substrati biomolecolari o materiali. Inoltre, questo metodo ha l'ulteriore vantaggio di ottimizzare solo la proprietà di superficie da adattare alle esigenze di ogni applicazione.