Name: Istituzione dellinfezione virale e analisi dellinterazione ospite-Virus in Drosophila Melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-14T13:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Impara a stabilire infezioni virali in vivo in Drosophila melanogaster mediante nanoiniezione e analizza le interazioni virus-ospite. Questo metodo offre controllo preciso del dosaggio virale per studi di virologia.

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Vorremmo ringraziare l'intero laboratorio di Pan in IPS. CAS. Ringraziamo il dottor Lanfeng Wang (IPS, CAS) per assistenza sperimentale e Dr. Gonalo Cordova Steger (natura Springer), Dr. Jessica VARGAS (IPS, Parigi) e Dr. Seng Zhu (IPS, Parigi) per commenti. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da al programma di ricerca strategico prioritario dell'Accademia cinese delle scienze di l. p (XDA13010500) e h. t (XDB29030300), Fondazione della Cina nazionale di scienze naturali l. p (31870887 e 31570897) e J.Y. (31670909). L. p è membro dell'associazione per la promozione dell'innovazione di CAS della gioventù (2012083).

Nota: Prima di iniziare l'esperimento, le linee cellulari e volare scorte utilizzate non devono essere contaminate da altri patogeni, soprattutto per i virus come DCV, FHV, Drosophila X virus (DXV) e nefrite aviaria (ANV). Idealmente, il sequenziamento di RNA o una più semplice identificazione basati sulla PCR sono utilizzati per rilevare la contaminazione10,45. Se la contaminazione si è verificato, gli stock di volare e di linee cellulari non deve essere utilizzato di più fino a quando sono completamente decontaminati46.
1. virus e preparazione volare
<ol><li>Raccolta e diffusione di virus Nota: Drosofila S2 * cellule sono utilizzate per la titolazione e la propagazione di DCV. La linea cellulare S2 * è derivata da una coltura primaria di embrioni in fase tardi di d. melanogaster . Questa linea cellulare è stato ben descritto in precedenza47.<ol>
<li>Crescere cellule S2 * in media della drosofila di Schneider a 25 ° C senza ulteriori CO2, come un monostrato sciolto, semi-aderente in una piastra di coltura delle cellule di 10 cm, ad una densità di 1 x 107 vitali cellule/mL. Utilizzo medio completo per cellule di S2: media della drosofila di Schneider contenente 10% calore inattivato FBS, 100 unità/mL penicillina e 100 μg/mL streptomicina. Nota: Le cellule sane dovrebbero mostrare una forma rotonda e dimensione omogenea per mostre.</li>
		<li>Scongelare rapidamente lo stock DCV da-80 ° C in bagnomaria a 25 ° C. Infettare cellule S2 * con DCV a MOI = 0,01 immediatamente direttamente aggiungendo 1 mL di soluzione di virus per i piatti di cultura cellulare (area di crescita: 55cm2) con 10 mL di terreno completo per cellule di S2.</li>
		<li>Incubare le cellule a 25 ° C per 3-5 giorni. Quando il virus è pronto per la raccolta, la morfologia della cellula sia anormale (forma cellulare sembra sfocatura) e terreno di coltura è pieno di particelle nere indicative di detriti cellulari.</li>
		<li>Raccogliere la cultura di tutta la cella in una provetta da 15 mL pipettando su e giù e congelare a-80 ° C (per fino a un anno). Nota: DCV possono essere memorizzati per periodi prolungati di tempo a-80 ° C con una minima perdita di infettività, fino ad un anno.</li>
		<li>Scongelare la coltura delle cellule in un bagno di acqua di 25 ° C con agitazione costante e poi Centrifugare a 6.000 x g per 15 min a 4 ° C. Raccogliere il surnatante in una provetta sterile da 15 mL e vortex. Aliquota fino a 200 μL di soluzione di virus per tubo. Nota: Le aliquote Virus possono essere memorizzate per brevi periodi fino a 3 giorni a 4 ° C e fino a 1 anno a-80 ° C. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. È sempre meglio usare tutti l'aliquota in una sola volta.</li>
		<li>Scegliere 5 provette contenenti virus casuale per determinare la dose infettiva di coltura del tessuto medio virus (TCID50) da un'analisi di effetto citopatico (CPE) (1 unità di TCID50= 0,7 placca che formano unità [PFU]). Nota: CPE si riferisce ai cambiamenti strutturali nelle cellule dell'ospite causate tramite l'invasione virale. Il virus infettano provoca la lisi della cellula ospite, o quando la cellula muore senza Lisi dovuto un'incapacità di riprodurre48.<ol>
<li>Il giorno 1, raccogliere preparato S2 * cellule pipettando. Contare il numero di cellulare. Centrifugare le cellule per 300 x g per 4 min e scartare il surnatante. Diluire le cellule per la densità di 1 x 106 cellule/mL con terreno completo per S2 * le celle come descritto al punto 1.1.1.</li>
			<li>Semi di 1 x 105 S2 * (100 μL) di cellule per pozzetto di fondo piatto 96 pozzetti (confluency di ~ 30%).</li>
			<li>Effettuare diluizioni seriali 10 volte dello stock DCV con terreno completo per cellule di S2. Aggiungere 50 diluizioni µ l nel pozzo. Aggiungere 50 µ l di terreno di coltura senza virus classificati bene come controllo negativo. Nota: Per ogni tasso di diluizione, 8 pozzetti sono stati usati. Come la resa DCV tipica è circa 108-109 PFU/mL, la diluizione dovrebbe coprire almeno ~ 10-5-10-10.</li>
			<li>Il giorno 4, osservare CPE con un microscopio a campo chiaro con un 20x o obiettivo 40x. Classificare un pozzo in cui le cellule appaiono sfocate e il supporto è pieno di frammenti come un pozzo"positivo" e un pozzo in cui la morfologia cellulare è normale come"negativo".</li>
			<li>Pozzi di positivo o negativi di Mark CPE con + o –, rispettivamente. Calcolare il virus TCID50 la Reed e Muench metodo49.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Smaltire tutti i materiali contaminati e guanti in padella decontaminazione. Se il virus non può raggiungere il desiderato TCID50, concentrato 100 mL di soluzione di virus mediante centrifugazione a 68.000 x g per 1 h a 4 ° C. Nota: a seconda lo scopo dell'esperimento, una gamma di dosi da 102 a 106 TCID50 unità può essere utilizzato per l'infezione del virus. In genere, usiamo 3 x 106 TCID50 unità.</li>
		<li>Scartare il surnatante e risospendere in 1 mL di tampone Tris-HCl (10 mM, pH 7,2). Aliquota 20 μL di soluzione di virus per tubo e conservare a-80 ° C. Scegli 5 tubi casuale per determinare il medio virus TCID50 nuovamente.</li>
	</ol></li>
	<li>Preparazione per l'infezione di volare Nota: Batteri simbiotici Wolbachia possono sopprimere molti tipi di infezione di virus a RNA in insetti30,31,32,33,41. Quindi, è essenziale per eliminare Wolbachia da mosche prima di studiare l'infezione virale in vivo33.<ol>
<li>Preparare il cibo volo contenenti tetraciclina aggiungendo 400 μL di 50 tetraciclina µ g/mL (in etanolo al 70%) a 4 g di alimento fresco standard farina di mais (1 L di cibo contiene 77,7 g di farina di mais, 32,19 g di lievito, 10,6 g di agar, 0,726 g di CaCl2 31,62 g di saccarosio, 63,3 g di glucosio, 2 g di potassio sorbato e 15 mL di 5% C8H8O3). Mescolare accuratamente e mettere gli alimenti a 4 ° C durante la notte per far evaporare di etanolo. Nota: Una dose elevata di etanolo può influire sulla fertilità volare, così non omettere questo passaggio.</li>
		<li>Caldo il cibo a temperatura ambiente e mettere appena obtecta mosche adulte (20 femmine e 10 maschi) nel flaconcino. Allevare le mosche a 25 ° C, umidità 60% nell'ambito di un normale ciclo luce/buio. Nota: In genere, ci vogliono 3-4 giorni per le mosche a deporre abbastanza uova. Troppe uova inibiscono lo sviluppo di larve e diminuiscono l'efficienza della tetraciclina.</li>
		<li>Raccogliere appena mosche adulte obtecta (entro 3 ~ 5 giorni) sotto un flusso luminoso di CO2e ripetere il passaggio ~ 1.2.1-1.2.2. In genere, almeno 3 generazioni sono necessari per l'eliminazione completamente di Wolbachia.</li>
		<li>Dopo 3 generazioni con trattamento tetraciclina, raccogliere 5 mosche sotto un flusso luminoso di CO2 per la prova di infezione di Wolbachia . Macinare le mosche per 1 min con 250 μL di acqua bidistillata (ddH2O) e alcune perle di ceramica sterile di 0,5 mm in una provetta da 1,5 mL utilizzando un omogeneizzatore. Aggiungere un altro 250 μL di 2 x tampone A (0.2 M Tris-HCl, pH 9.0; 0,2 M EDTA; 2% SDS) per il campione e il vortice. Nota: Poiché SDS impedirà il movimento del tallone, 1x tampone A non può essere direttamente utilizzato per macinare le mosche. Se le mosche hanno gli occhi rossi, rimuovere teste prima della rettifica, in quanto questo può influenzare il colore del prodotto del DNA.</li>
		<li>Congelare i campioni a-80 ° C (tenere fino ad un anno). Scongelare rapidamente il campione da-80 ° C in bagnomaria a 25 ° C fino a completa dissoluzione. Incubare i campioni a 70 ° C per 30 min.</li>
		<li>Aggiungere 190 µ l di 5 M KOAc, vortex e incubare in ghiaccio per 15 minuti o più.</li>
		<li>Centrifugare i campioni a 13.000 x g per 5 min a temperatura ambiente, raccogliere il surnatante e trasferirli in nuove provette.</li>
		<li>Ripetere il passaggio 1.2.7 ottenere il DNA con una migliore qualità.</li>
		<li>Aggiungere 750 μL di isopropanolo per ogni campione e capovolgere delicatamente un paio di volte a mano. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.</li>
		<li>Centrifugare i campioni a 13.000 x g per 5 min a temperatura ambiente e scartare il surnatante. Il pellet di DNA genomico bianco rimarrà nella parte inferiore del tubo.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di etanolo al 70% per il pellet, centrifuga a 13.000 x g per 5 min e scartare il surnatante. Asciugare all'aria il DNA fino a quando non diventa trasparente.</li>
		<li>Sciogliere il DNA in 100 μL di ddH2O, titolare di concentrazione di DNA mediante spettrofotometria di assorbimento UV-Vis e diluire il DNA a 100 ng/μL.</li>
		<li>Uso 200 ng di DNA per la reazione di PCR (in un sistema di 20 μL, vedere la Tabella materiali). PCR per eseguire il seguente programma: 95 ° C per 15 min; ciclo di 36 di 95 ° C per 45 s, 50 ° C per 45 s e 72 ° C per 1 min; e un passo di estensione finale (72 ° C per 1 min) in un termociclatore. Nota: Basato su Wolbachia 16S rRNA, utilizzare i seguenti primer: 5' TGAGGAAGATAATGACGG 3' (avanti) e 5' CCTCTATCCTCTTTCAACC 3' (inverso). Per wsp, erano i primer 5' CATTGGTGTTGGTGTTGGTG 3' (avanti) e 5' ACCGAAATAACGAGCTCCAG 3' (inverso).</li>
		<li>Analizzare i prodotti di PCR con elettroforesi su gel di agarosio all'1%. Il formato del prodotto PCR di Wolbachia 16S rRNA e wsp è circa 200 bp e 600 bp, rispettivamente.</li>
		<li>Posteriore Wolbachia stock fly free su alimento standard farina di mais. Raccogliere 3-5 giorni appena obtecta uomo vola per infezione. Nota: Trattamento tetraciclina può colpire anche la composizione del microbiota intestinale, che successivamente influenza le risposte antivirali nell'ospite. Si consiglia che tutte le mosche dovrebbero ricevere gli stessi trattamenti di tetraciclina. Tenere mosche privo di Wolbachia cresce in condizioni standard per almeno 3 generazioni ripristinare microbiota dell'intestino.</li>
	</ol></li>
	<li>Genotipizzazione Pastrel Nota: La presenza dell'allele del gene di pst in background genetico S o R è stata segnalata per interessare l'infezione DCV in Drosophila34,35. È necessario controllare il genotipo di pst , soprattutto per l'infezione DCV. Ci sono pochi SNPs in pst che possono influenzare l'infezione del virus, il SNP major è 512 C/T. Il gradiente di temperatura PCR è un metodo rapido per identificare il genotipo di pst .<ol>
<li>Estratto di volare DNA genomico, come descritto in precedenza (punto 1.2.4 - 1.2.15).</li>
		<li>Uso 100 ng di DNA come il modello, il primer 512C, 5' CAGCATGGTGTCCATGAAGTC 3' (avanti) e 5' ACGTGATCAATGCTGAAAGT 3' (indietro) per rilevare l'allele R, il primer 512T, 5' CAGCATGGTGTCCATGAAGTT 3' (avanti) e 5' ACGTGATCAATGCTGAAAGT 3' (indietro) per rilevare il Allele S.</li>
		<li>Impostare i gradienti di Tm (temperatura di fusione) come segue: 54 ° C, 54,7 ° C, 55,5 ° C, 58 ° C, 59,7 ° C, 62,2 ° C, 63,7 ° C e 64 ° C (45 s ad ogni temperatura). Nota: 30 cicli di PCR reazione a catena sono raccomandati (sistema 20 μL).</li>
		<li>Visualizzare il prodotto di PCR 100-bp mediante elettroforesi su gel di agarosio al 2%.</li>
	</ol></li>
</ol>2. virale infezione in Drosophila
<ol><li>
Infettare mosche di nano-iniezione ed eseguire le analisi di sopravvivenza.
	<ol>
<li>Tirare i capillari per preparare gli aghi per iniezione, retro-riempimento l'iniezione dell'ago con olio e montare l'iniettore come precedentemente descritto50.</li>
		<li>Anestetizzare mosche sul tappetino sotto un flusso luminoso di CO2. Inoculare mosche da iniezione intra-toracica44 50,6 nL di soluzione virus (100 PFU, diluito con soluzione tampone Tris-HCl, pH 7,2). Iniettare almeno 3 flaconcini di mosche (20 mosche per flaconcino). Nota: L'iniezione è che richiede tempo (generalmente 100 mosche ogni ora) e replica DCV è molto rapida, quindi è molto importante annotare l'ora esatta sul tubo una volta finitura ogni flaconcino (20 mosche). Buffer solo iniezione è impostato come un finto controllo. Di solito, mosche adulte maschi sono preferiti, sono risultati più stabili e riproducibili rispetto all'utilizzo di femmine poiché variazioni ormonali durante l'accoppiamento e riproduzione possono influenzare la lettura di femmine51.</li>
		<li>Crescere le mosche iniettati a 25 ° C, umidità 60% nell'ambito di un normale ciclo luce/buio. Fornitura di mosche con cibo fresco ogni giorno e registrare il numero di morti ﬂies.</li>
		<li>Eseguire almeno 3 repliche biologiche e tracciare la curva di sopravvivenza.</li>
		<li>Per l'analisi statistica dei dati di sopravvivenza, generare le curve di sopravvivenza di Kaplan-Meier di software statistico. Eseguire test log-rank aggiustato per calcolare i valori di P. Sul tavolo di sopravvivenza, immettere le informazioni per ogni soggetto. Il software quindi Calcola percentuale sopravvivenza in ogni momento e trame di un complotto di sopravvivenza di Kaplan-Meier. Nota: Non aggiungere ulteriore lievito nel flaconcino. Rispetto ai comandi finti, DCV-infettati mosche occasionalmente avere ascite e sono goffi, che li rendono vulnerabili al lievito appiccicoso. È meglio registrare più punti di tempo nell'esperimento preliminare per scoprire un lasso di tempo in cui la morte di massa accadrà per le mosche infette. Generalmente, le mosche infette raramente muoiono entro i primi due giorni, anche per le linee mutanti Dcr-2 . Per il Wolbachia volare gratis w1118 (Bloomington 5905) infettati con 100 PFU di DCV, questa finestra di tempo è circa 3-5 giorni dopo infezione. Mosche della frutta che muoiono entro ore di 0,5 h post iniezione non devono essere contate come una fatalità perché possono essere uccisi da ferita dell'ago non da un'infezione virale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
DCV caricare misura dall'analisi di CPE Nota: Carica virale viene misurata analogamente alla titolazione dello stock virus (punto 1.1.6) ma richiede una preparazione campione supplementare (punto 2.2.1-2.2.4).<ol>
<li>Il giorno 1, infettare mosche maschii come descritto nel passo 2.1.1-2.1.2. Gruppo iniettati mosche in gruppi di 20 e tenerli in crescita su cibi freschi volare per il tempo desiderato (in genere per 24 h o 3 giorni). Forniscono mosche con cibo fresco ogni giorno.</li>
		<li>Il giorno 2, seme della drosofila S2 * cellule in una piastra di coltura delle cellule di 10 cm alla densità di circa 5 x106 a 1 x 107 cellule/mL come descritto al punto 1.1.1.</li>
		<li>Il giorno 3, raccogliere 5 mosche (sotto un flusso luminoso di CO2) e li pestava in una provetta da centrifuga da 1,5 mL per 30 s con 200 μL di tampone Tris e perle di ceramica utilizzando omogeneizzatore. Conservare i campioni a-80 ° C o immediatamente procedere al passaggio successivo.</li>
		<li>Accuratamente Vortexare il campione. Utilizzare una siringa da 1 mL e 0,22 μm filter per filtrare il surnatante in una nuova provetta da 1,5 mL. Procedere con la titolazione, come descritto nella procedura 1.1.6.1-1.1.6.5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Carico DCV misurato mediante qRT-PCR
	<ol>
<li>Il giorno 1, infettare mosche come descritto sopra. Gruppo iniezione maschio vola (20 mosche/gruppo) e crescere il cibo fresco di volare per il tempo desiderato, in genere per 24 h o 3 giorni. Forniscono mosche con cibo fresco ogni giorno.</li>
		<li>Il giorno 3, raccogliere 5 mosche sotto un flusso luminoso di CO2 in una provetta da 1,5 mL con 200 μL di tampone di lisi e 20 perle in ceramica (diametro = 0,5 mm), macinare i campioni di omogeneizzatore ad alta velocità per 30 s. aggiungere 800 μL di tampone di lisi aggiuntive in ogni provetta e memorizzare il s estrazione del RNA e qRT-PCR condurre ampie a-80 ° C o immediatamente.</li>
		<li>Preparare le punte libere di RNasi, tubi e deionizzata, dietilpirocarbonato (DEPC) trattati e 0,22 µm membrana-filtrata acqua. Aggiungere 200 µ l di cloroformio (≥ 99.5%) nel campione e vigorosamente agitare per 15 s a mano. Incubare per 5 minuti o più a lungo a temperatura ambiente fino a quando la fase acquosa e la fase organica sono chiaramente separati. Nota: Cloroformio è estremamente pericoloso e deve essere maneggiato con cura. Non centrifugare il campione, che aumenterà il rischio di contaminazione da DNA.</li>
		<li>Centrifugare i campioni a 13.000 x g per 15 min a 4 ° C.</li>
		<li>Raccogliere 400 μL del surnatante e trasferire il surnatante in nuove provette. Mescolare con la stesso volume di isopropanolo (≥ 99.5%), capovolgere delicatamente a mano i campioni per 20 volte e poi precipitare per 10 minuti o più a lungo a temperatura ambiente. Nota: Precipitazioni a-20 ° C aumenterà il rendimento del RNA.</li>
		<li>Centrifugare i campioni a 13.000 x g per 10 min a 4 ° C. Pellet di RNA di bianco sono visibili nella parte inferiore del tubo.</li>
		<li>Scartare il surnatante e aggiungere 1 mL di etanolo al 70% (etanolo in acqua DEPC) ed invertire alcune volte per lavare il RNA.</li>
		<li>Centrifugare i campioni a 13.000 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante e asciutto RNA per 5-10 min; RNA dovrebbe diventare trasparente.</li>
		<li>Aggiungere 50 μL di acqua DEPC a campione, pipetta per poche volte e vortex.</li>
		<li>Prendere 3 μL di RNA per titolazione la concentrazione di RNA. Quantificare il RNA a 260 nm. Normalmente, la concentrazione di RNA estratta dal presente protocollo è circa 100-500 μg/μL, che è adatto per la sintesi di cDNA.</li>
		<li>Utilizzare 2 μg di RNA per la sintesi di cDNA. Diluire il campione a 100 μL con ddH2O e conservare a-20 ° C.</li>
		<li>Eseguire qRT-PCR secondo le istruzioni del produttore e i qRT-PCR. Nota: Per la sintesi di cDNA di DCV, primer casuale lavorato molto meglio di primer poli A nelle nostre mani. L'espressione del mRNA DCV è normalizzato a endogena della proteina ribosomiale 49 (rp49) mRNA. Iniettori del oligonucleotide utilizzati in questa parte: rp49 5' AGATCGTGAAGAAGCGCACCAAG 3' (avanti) e 5' CACCAGGAACTTCTTGAATCCGG 3' (retromarcia); DCV, 5' TCATCGGTATGCACATTGCT 3' (avanti) e 5' CGCATAACCATGCTCTTCTG 3' (retromarcia); vago, 5' TGCAACTCTGGGAGGATAGC 3' (avanti) e 5' AATTGCCCTGCGTCAGTTT 3' (retromarcia); virus-indotta (in avanti) RNA 1 (vir-1) 5' GATCCCAATTTTCCCATCAA 3' e 5' GATTACAGCTGGGTGCACAA 3' (inverso).</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo articolo, presentiamo una procedura dettagliata su come stabilire un sistema virale infettivo in adulto Drosophila melanogaster usando nano-iniezione. I protocolli prevedono la preparazione di adeguate linee di volare e stock di virus, tecniche di infezione, la valutazione degli indicatori infettivi e la misura della risposta antivirale. Sebbene DCV è usato come un esempio di un agente patogeno virale, decine di diversi tipi di virus sono state applicate con successo per lo studio del sistema di Drosop...

Emergenti di infezioni virali, soprattutto da arbovirus, come la Chikungunya virus1, il virus Dengue, la febbre gialla virus2 e ilvirusdi Zika3, sono state un'enorme minaccia per la salute pubblica di causare pandemie 4. così, una migliore comprensione dell'interazione virus-ospite è diventato sempre più importante per il controllo delle epidemie e trattamento di malattie virali negli esseri umani. Per questo obiettivo, è necessario stabilire modelli più appropriati ed efficaci per studiare i meccanismi alla base di infezione del virus.
Moscerino della frutta, Drosophilamelanogaster (d. melanogaster), fornisce un potente sistema per studiare l'interazione virus-ospite5,6 e ha dimostrato di essere uno dei modelli più efficienti per lo studio di malattie virali umane7 , 8 , 9. antivirale altamente conservato segnalazione percorsi e strumenti genetici incomparabile rendono vola un grande modello per produrre risultati significativi con reali implicazioni per gli studi umani di antivirali. Inoltre, mosche sono facile e poco costoso da mantenere in laboratorio e sono convenienti per lo screening su larga scala di nuovi fattori di regolazione6,10 il virus e l'host durante l'infezione.
Quattro importanti vie antivirale altamente conservate (ad es., il RNA interference (RNAi) via11, la via JAK-STAT12, il pathway di NF-κB e l'autofagia via13) sono ben studiati in Drosophila negli ultimi anni6. La via di RNAi è un ampio meccanismo antivirale che può sopprimere la maggior parte dei generi di virus infezione6,14. Interruzione di questa via di mutazione nei geni come Dicer-2 (Dcr-2) o 2 Argonaute (AGO2) può portare a maggiore virus titolo e host mortalità15,16,17. La via JAK-STAT è stata implicata nel controllo dell'infezione da un virus della famiglia Dicistroviridae e famiglia Flaviviridae negli insetti, ad es., Drosophila C virus (DCV) mosche16 e virus del Nilo occidentale (WNV) e il Virus della Dengue nel zanzara18,19. Il pedaggio di Drosophila (omologo al pathway di NF-κB umano) e i percorsi di immunodeficienza (IMD) (simile alla via n-f-κB e TNF umana) sono entrambi coinvolti nella difesa virus invasione20,21, 22. l'autofagia è un altro meccanismo conservato coinvolti nella regolazione dell'infezione virale, che è ben caratterizzato in Drosophila23,24. Così, identificazione di nuovi fattori regolatori di questi meccanismi e dissezione diafonia tra questi antivirali di segnalazione e altri percorsi biologici, come il metabolismo, invecchiamento, reazione neurale e così via, possono essere facilmente impostati in Drosophila sistema.
Anche se più affermati modelli infettive virali in Drosophila sono indotte da virus a RNA, infezione dall'invertebrato iridescente Virus 6I (IV-6) e virus di Kallithea hanno dimostrato il potenziale per lo studio di virus a DNA in mosche25, 26. Inoltre, il virus può anche essere modificato per consentire infezione di Drosophila, come il virus dell'influenza9. Questo ha notevolmente ampliato l'applicazione della piattaforma di screening di Drosophila . In questa procedura, usiamo DCV come esempio per descrivere come sviluppare un sistema virale infettivo in drosofila. DCV è un virus a RNA incagliato singolo senso positivo di circa 9300 nucleotidi, codifica 9 proteine27. Come agente patogeno naturale di d. melanogaster, DCV è considerato come un virus adatto per studiare fisiologici, comportamentali e basale risposta immunitaria durante host-virus interazione e co-evoluzione28. Inoltre, il tasso di mortalità rapida dopo l'infezione in wild-type mosche rende DCV utile alla schermata per geni resistenti o sensibili nel host29.
Tuttavia, ci sono diversi aspetti di preoccupazione quando si studia le infezioni virali in drosofila. Ad esempio, batteri simbiotici Wolbachia hanno una capacità di inibire un ampio spettro di proliferazione di virus a RNA in Drosophila e zanzara30,31,32. Dati recenti indicano un possibile meccanismo in cui Wolbachia blocchi Sindbis virus (SINV) l'infezione attraverso il upregulation della metiltransferasi Mt2 espressione in host33. Inoltre, il background genetico degli insetti è critico per l'infezione virale. Per esempio, il polimorfismo naturale nel gene, pastrel (pst), determina la suscettibilità all'infezione di DCV in Drosophila34,35, mentre i loci di Ubc-E2H e CG8492 sono coinvolti in Flock house virus (FHV) infezione, rispettivamente36e virus di paralisi di Cricket (CrPV).
I particolari modi per stabilire l'interazione virus-ospite in mosche, devono essere scelti secondo scopi di ricerca come ad esempio uno schermo ad alta produttività per componenti cellulari di host in Drosophila cella linee37,38, orale infezione di studiare la risposta antivirale specifica gut22,39,40, ago che pungono41,42 o nano-iniezione passando le barriere epiteliali per stimolare immunitario sistemico risposte. Nano-iniezione può controllare con precisione la dose virale per indurre una reazione controllata di antivirale e una lesione fisiologico43, garantendo così un'elevata riproducibilità sperimentale44. In questo studio, descriviamo un metodo di nano-iniezione per studiare le interazioni virus-ospite in Drosophila, evidenziando l'importanza di effetti di sfondo dei mosche.

<table><tbody><tr><td>Filtro da 0,22 um</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 ml</td><td>Marca</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,5 ml senza RNasi</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per coltura cellulare da 10 cm</td><td>Sigma</td><td>CLS430167</td><td>Cell culture</td></tr><tr><td>100 Provette di ricambio</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da 15 ml</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Sistema ABI 7500 qPCR</td> Incubatore cellulare <td>ABI</td><td>7500</td><td>qPCR</td></tr><tr><td></td><td>Sanyo</td><td>MIR-553</td><td></td></tr><tr><td>Centriguge</td><td>Eppendof</td><td>5810R</td><td></td></tr><tr><td>Centriguge</td><td>Eppendof</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma</td><td>151858</td><td>Estrazione dell'RNA</td></tr><tr><td>Acqua</td> <td>DEPCSigma</td><td>95284-100ML</td><td>Estrazione dell'RNA</td></tr><tr><td>Incubatore di Drosophila</td><td>Percival</td><td>I-41NL</td><td>Allevamento di Drosophila</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Invitrogen</td><td>12657-029</td><td>Coltura cellulare</td></tr> a <tr><td>fondo piatto Piastra a 96 pozzetti</td><td>Sigma</td><td>CLS3922</td><td>Microscopio</td></tr> a <tr><td>fluorescenza</td><td>Olympus</td><td>DP73</td><td></td></tr><tr><td>Alcool isopropilico</td><td>Sigma</td><td>I9516</td><td>Estrazione dell'RNA</td></tr><tr><td>Tampone di lisi (estrazione dell'RNA)</td><td>Reagente Thermo Fisher</td><td>15596026</td><td>TRIzol</td></tr><tr><td>Tampone di lisi (estrazione di RNA del campione liquido)</td><td>Thermo Fisher</td><td>10296028</td><td>TRIzol LS</td></tr><tr><td>Reagente Microscopio</td><td>Olympus</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II Iniettore di auto-nanolitri</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td>Iniettore automatico Nanoject II a volume variabile (da 2,3 a 69 nL) con capillari in vetro (110V)</td></tr><tr><td>Pellicola adesiva ottica</td><td>ABI</td><td>4360954</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina,</td><td>Invitrogen</td> liquido <td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Piastra qPCR</td> per colture cellulari <td>ABI</td><td>A32811</td><td>qPCR</td></tr><tr><td>Schneider' s Insect Medium</td><td>Sigma</td><td>S9895</td><td>Software</td></tr><tr><td>statistico</td> per colture cellulari <td>GraphPad Prism 7</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TransScript Fly First-Strand cDNA Synthesis SuperMix</td><td>TransScript</td><td>AT301</td><td>Estrazione dell'RNA</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>IKA</td><td>VORTEX 3</td><td>Estrazione dell'RNA</td></tr></tbody></table>

istituzione dell'infezione virale e analisi dell'interazione ospite-virus in drosophila melanogaster

Establishment of Viral Infection and Analysis of Host-Virus Interaction in Drosophila Melanogaster

Diffusione del virus è delle principali cause delle malattie epidemiche. Così, capire l'interazione tra il virus e l'host è molto importante per estendere la nostra conoscenza della prevenzione e trattamento dell'infezione virale. Moscerino della frutta Drosophila melanogaster ha dimostrato di essere uno degli organismi modello più efficiente e produttivo allo schermo per fattori antivirali e indagare l'interazione virus-ospite, a causa di potenti strumenti genetici e altamente conservato immune innata vie di segnalazione. La procedura descritta qui di seguito viene illustrato un metodo di nano-iniezione per stabilire l'infezione virale e inducono risposte antivirali sistemiche in mosche adulte. Il controllo preciso della dose iniezione virale in questo metodo consente un'elevata riproducibilità sperimentale. Protocolli descritti in questo studio includono la preparazione di mosche e il virus, il metodo di iniezione, analisi del tasso di sopravvivenza, la misurazione del carico di virus e una valutazione del percorso antivirale. Gli effetti di influenza dell'infezione virale di sfondo dei mosche sono stati menzionati qui. Questo metodo di infezione è facile da eseguire e quantitativamente ripetibile; può essere applicato allo schermo per host/virali fattori coinvolti nell'interazione virus-ospite e dissezionare il crosstalk tra immuni innate di segnalazione e altre vie biologiche in risposta all'infezione virale.

Risultati di questa sezione sono ottenuti dopo l'infezione di DCV di d. melanogaster. La figura 1 Mostra il diagramma di flusso dell'infezione virale in drosofila. Mosche sono iniettati intra-thoracically, e quindi i campioni sono raccolti per la misurazione del virale TCID50 e livello di RNA del genoma (Figura 1). Infezione da virus può indurre la lisi cellulare e CPE è osservato a 3 giorni post infezione (Figura 2A). Il carico del virus mis...

Questo protocollo viene descritto come stabilire l'infezione virale in vivo in Drosophila melanogaster utilizzando il metodo di nano-iniezione e tecniche di base per analizzare l'interazione virus-ospite.

Istituzione dell'infezione virale e analisi dell'interazione ospite-Virus in Drosophila Melanogaster

Virus spreading is a major cause of epidemic diseases. Thus, understanding the interaction between the virus and the host is very important to extend our ...

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'interazione virus-host su come stabilire efficacemente un'infezione virale in Drosophila melanogaster. Questo metodo di nanoiniezione consente un controllo preciso della dose di infezione del virus e può essere facilmente applicato alle infezioni con altri agenti patogeni microbici. Inizia coltivando uno per 10 alla settima cella stellare S2 praticabile per millilitro come monostrato sciolto e semi-aderente in un piatto di coltura cellulare di 10 centimetri con 10 millilitri di Drosophila Medium completo di Schneider senza anidride carbonica aggiuntiva a 25 gradi Celsius per un'ora.Durante l'incubazione, resuspend appena scongelato Drosophila C Virus o DCV a una molteplicità di infezione di 0,01 in un millilitro di mezzo completo e aggiungere soluzione virale ai piatti di coltura cellulare. Quindi riportare il piatto all'incubatore di 25 gradi Celsius per tre o cinque giorni. Il virus è pronto per la raccolta quando la morfologia cellulare sembra sfocata e il mezzo di coltura è pieno di particelle nere indicative di detriti cellulari.Mescolare il supernatante pipettando alcune volte prima di trasferire l'intera coltura cellulare in un tubo da 15 millilitri per la lisi delle cellule ospiti a meno 80 gradi Celsius. Per generare concentrazioni di lavoro del virus, scongelare la sospensione cellulare in un bagno d'acqua di 25 gradi Celsius con scuotimenti costanti prima di pellettare i detriti cellulari per centrifugazione. Quindi trasferire il supernatante in un nuovo tubo sterile da 15 millilitri per vortice e aliquote fino a 200 microlitri di soluzione virale per tubo.Per determinare la dose infettiva media di coltura del tessuto virale, primo seme uno per 10 alle cinque cellule stellari S2 in 100 microlitri di mezzo completo in otto pozzi per colonna in 12 file di una piastra di pozzo 96. Quindi riportare la piastra all'incubatore di 25 gradi Celsius. Selezionare casualmente cinque tubi di virus da meno 80 gradi Celsius di stoccaggio.Mentre le cellule si stanno depositando, riempire 10 tubi sterili a microcentrifugo da 1,5 millilitri con 450 microlitri di mezzo sterile completo e aggiungere 50 microlitri di materiale virale al primo tubo da 1,5 millilitri contenente 450 microlitri di mezzo sterile completo diluendo le sospensioni di 10 volte per passo al 12 ° pozzo. Al termine dell'incubazione, aggiungere 50 microlitri di ogni diluizione al pozzo appropriato in ogni colonna per quel tubo di virus e aggiungere 50 microlitri di mezzo di coltura senza virus a un pozzo per colonna come pozzo di controllo negativo. Quindi posizionare la piastra nell'incubatore di 25 gradi Celsius per tre giorni e valutare l'effetto citopatico di ogni stock di virus sotto un microscopio Brightfield con un ingrandimento 20 volte al giorno.Classificare un pozzo in cui le cellule sembrano sfocate e il mezzo è pieno di frammenti come un pozzo positivo e un pozzo in cui la morfologia cellulare è normale come pozzo negativo. Prima dell'allevamento, mescolare accuratamente 400 microlitri di 50 microgrammi per millilitro di Tetraciclina con quattro grammi di cibo fresco standard a mosca di farina di mais e posizionare il cibo a quattro gradi Celsius durante la notte per evaporare l'etanolo. La mattina seguente, riscaldare il cibo a temperatura ambiente e posizionare il cibo e 20 mosche adulte femmine e 10 maschi appena racchiuse in una fiala riproduttiva per un'incubazione riproduttiva di tre o quattro giorni a 25 gradi Celsius e 60% di umidità sotto un normale ciclo chiaro / scuro.Quando sono state deposte abbastanza uova, raccogli le mosche adulte appena echiuse sotto un leggero flusso di anidride carbonica e alleva di nuovo la Drosophila altre due volte come appena dimostrato. Dopo tre generazioni di trattamento tetraciclina, raccogli cinque mosche sotto un leggero flusso di anidride carbonica e omogeneizza le mosche con 250 microlitri di acqua distillata doppia e alcune perle in ceramica sterile da 0,5 millimetri. Dopo un minuto, aggiungere 250 microlitri di 2X Buffer A al campione per il vortice prima di congelare i campioni a meno 80 gradi Celsius.Successivamente, scongelare rapidamente i campioni da meno 80 gradi Celsius in un bagno d'acqua di 25 gradi Celsius, seguito da un'incubazione di 30 minuti in un bagno d'acqua di 70 gradi Celsius prima di estrarre il DNA genomico e amplificare il DNA con la reazione a catena della polimerasi secondo protocolli standard. Confermare l'assenza di Wolbachia 16 piccolo RNA e wsp in ogni mosca omogeneato da elettroforesi gel secondo protocolli standard. Quindi alleva il fly stock senza Wolbachia sul cibo di mosca di farina di mais standard come dimostrato.Per l'infezione virale, utilizzare prima uno stereomicroscopio e pini sottili per rompere la punta di un ago capillare di vetro al diametro appropriato per la nanoiniezione. Per assemblare l'iniettore, posizionare l'O-ring del soffitto e un distanziale bianco sul pistone metallico dell'iniettore con la grande fossette rivolta verso l'esterno. Utilizzare una siringa dotata di un ago calibro 30 per riempire l'ago di vetro con olio minerale e posizionare l'ago attraverso il colletto.Posizionare l'O-ring più grande intorno alla base del collare a circa un millimetro dall'estremità smussata dell'ago e montare l'ago sullo stantuffo dell'iniettore. Fissare l'ago sullo stantuffo e premere il pulsante vuoto per estendere lo stantuffo del microiniettore fino a quando non viene sentito un segnale acustico. Ora premere fill per ritrarre lo stantuffo di cinque millimetri e immergere l'ago in una sospensione virale dell'unità di formatura della placca da 100 placche.Agitare delicatamente una o almeno tre fiale di 20 Drosophila maschio senza Wolbachia sul piatto di iniezione. Le mosche dotate di maschio sono preferite durante l'accoppiamento e la riproduzione può influenzare le femmine. Quindi iniettare il torace di ogni mosca con 50,6 nanolitri di soluzione virale nella regione di colore leggermente più chiaro tra il mesopleura e lo pteropleura e misurare il carico DCV per saggio di effetto citopatico e RT PCR quantitativo dalle mosche terrestri come appena dimostrato.Dopo l'iniezione, trasferire accuratamente le mosche in una fiala fresca e posizionare il flaconcino in posizione orizzontale per evitare che le mosche si attacchino al mezzo mentre si riprendono dall'anestesia. L'iniezione richiede molto tempo, ma la replicazione DCV è molto rapida, quindi è molto importante annotare l'ora esatta sul tubo una volta che tutte le mosche di ogni fiala sono state iniettate. L'infezione da virus può indurre llisi cellulare ed effetti citopatici si osservano a tre giorni dopo l'infezione.Wolbachia 16s rRNA e wsp primer possono essere usati per rilevare la presenza di Wolbachia e Drosophila come dimostrato. Le mosche senza Wolbachia mostrano un tasso di sopravvivenza significativamente diminuito dopo l'infezione da DCV e in modo dipendente dalla dose. Dcv attiva percorsi di segnalazione antivirale nell'ospite che sono fondamentali per l'infezione antivirale in Drosophila come evidenziato dalla diminuzione del tasso di sopravvivenza e dall'aumento della carica virale nelle mosche mutanti Dicer-2.Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che la contaminazione con il genotipo wolbachia può influenzare la suscettibilità della Drosophila melanogaster vola all'infezione DCV. Seguendo questa procedura, altri metodi come uno schermo genetico su larga scala possono essere eseguiti al fine di rispondere a domande aggiuntive sui geni ospiti sotto definiti necessari per l'infezione virale o le risposte antivirali. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo delle malattie virali umane per esplorare i meccanismi alla base dei focolai di infezioni virali umane endemiche nel modello drosophila melanogaster.Non dimenticare che lavorare con il virus può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come indossare i dispositivi di protezione appropriati dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Ematociti concentrati Drosophila disperdere sulla totalità dello sviluppo dell'embrione. Questo protocollo dimostra come montare e immagine queste migrazioni uso di embrioni con ematociti concentrati fluorescente.

Immagini dal vivo di Drosophila melanogaster Migrazioni Hemocyte embrionali

Fattori dell'ospite romanzo coinvolti nella infezione virale può essere identificato tramite cell-based genome-wide perdita della funzione di screening RNAi.

Lo screening RNAi per fattori di accoglienza che partecipano Vaccinia Infezione da virus utilizzando Drosophila Celle

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Infezione orale di Drosophila melanogaster con batteri patogeni

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Stabilimento dell'infezione batterica nelle larve di Drosophila

In questo video, descriviamo una procedura per eseguire una nano-iniezione di un virus a RNA a singolo filamento a senso positivo in mosche Drosophila maschi adulti e successivamente studiamo le risposte antivirali avviate a causa dell'infezione. L'analisi della reazione a catena della polimerasi identifica la sovraregolazione di geni specifici nei moscerini infetti che indicano l'attivazione di vie di risposta immunitaria, tra cui l'interferenza dell'RNA e la segnalazione JAK/STAT.

Nano-iniezione virale intratoracica per studiare le interazioni ospite-virus nei moscerini adulti

In questo video, dimostriamo il test dell'effetto citopatico per determinare la dose virale infettiva in coltura tissutale del virus Drosophila C sulle cellule Drosophila S2*. Una serie di concentrazioni virali viene utilizzata per infettare le cellule in coltura. Viene determinata la percentuale di cellule che presentano cambiamenti strutturali e questi dati vengono utilizzati per calcolare la dose infettiva della coltura tissutale.

Test per determinare la dose infettiva virale del virus Drosophila C in cellule di insetto in coltura

Drosophila melanogaster è un eccezionale organismo modello per lo studio del sistema immunitario innato e delle conseguenze fisiologiche di infezioni e malattie. Questo protocollo descrive come somministrare infezioni batteriche robuste e quantitativamente ripetibili a D. melanogaster e come misurare successivamente la gravità dell'infezione e quantificare la risposta immunitaria dell'ospite.

Sistemica infezione batterica e immunitario Difesa fenotipi in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Questo metodo viene illustrato come visualizzare l'invasione del patogeno nelle cellule di insetto con modelli tridimensionali (3D). Emociti da larve di Drosophila sono stati infettati con agenti patogeni virali o batterici, ex vivo o in vivo. Emociti infetti erano quindi fissi e macchiati per l'imaging con un microscopio confocale e la successiva ricostruzione cellulare 3D.

Estrazione di emociti da larve di Drosophila melanogaster per infezione microbica e l'analisi

Questo protocollo descrive metodi per esporre oralmente e di infettare il moscerino della frutta Drosophila melanogaster con batteri patogeni e per misurare il numero di batteri infettivi capannone dopo l'infezione dell'intestino. Descriviamo ulteriormente l'effetto di mutanti immuni sulla sopravvivenza vola dopo l'infezione batterica orale.

Infezione batterica orale e spargimento in Drosophila melanogaster

Qui, presentiamo i protocolli per identificare gli immunomodulatori 1) virus-messo che promuovono la replica da arbovirus e fattori ospite 2) eucariotica che limitano la replica da arbovirus. Questi metodi basati su fluorescenza e luminescenza permettono ai ricercatori di ottenere rapidamente letture quantitative della replica da arbovirus nelle analisi semplicistiche con bassi rapporti segnale-rumore.

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Questo protocollo descrive un test di fagocitosi in vivo in adulto Drosophila melanogaster quantificare fagocita riconoscimento e liquidazione delle infezioni microbiche.

Valutare la risposta immunitaria cellulare del moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, utilizzando un test di fagocitosi In Vivo

Impara a stabilire infezioni virali in vivo in Drosophila melanogaster mediante nanoiniezione e analizza le interazioni virus-ospite. Questo metodo offre controllo preciso del dosaggio virale per studi di virologia.

Istituzione dell'infezione virale e analisi dell'interazione ospite-Virus in Drosophila Melanogaster

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