Name: Determinazione dei sottoinsiemi di regolamentazione delle cellule T nel timo murino, pancreatico drenante linfonodi e milza mediante citometria a flusso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: Impara a preparare sospensioni cellulari da timo, milza e linfonodi drenanti pancreatici murini per citometria a flusso. Questo metodo manuale ed economico permette di analizzare i sottoinsiemi delle cellule T regolatorie nello studio delle risposte immunitarie.

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Il presente studio è stato sostenuto finanziariamente dal Consiglio svedese della ricerca, EXODIAB, la Fondazione svedese per il diabete, fondo di diabete bambino svedese, SEB Diabetesfonden e O.E. och Edla Johanssons vetenskapliga stiftelse. Autori vorrebbero anche grazie Per-Ola Carlsson e Stellan Sandler per loro supporti e discussioni.

Il Comitato di etica animale locale all'Università di Uppsala ha approvato esperimenti sugli animali.
1. gli organi da animali di raccolta
<ol><li>Sacrificare i topi da dislocazione cervicale.</li>
	<li>Posizionare le ghiandole del timo e milze in 20 mL scintillazione fiale o provette coniche da 15 mL riempite con 5 mL di Hanks´ soluzione salina (HBSS) equilibrata. Posto PDLNs in microprovette da 1,5 mL riempite con 1 mL di RPMI 1640. Utilizzare intero timo e milza e tutti i PDLNs. Nota: Organi dovrebbero essere tenuti su ghiaccio durante tutta la procedura e l'investigatore dovrebbe cercare di essere veloci durante la preparazione di sospensioni di cellule singole, soprattutto quando si gestisce il tessuto timico poiché timiche cellule del sistema immunitario possono essere rapidamente degradate ad alte temperature.</li>
</ol>2. singola cella isolamento da timo e la milza
<ol><li>Spremere bene il timo e la milza con un paio di pinzette per rilasciare le cellule immunitarie. Scartare la restante capsula timica e splenica.</li>
	<li>Trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 mL e centrifugare a 433 x g per 5 min a 4 ° C per formare una pallina. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Per lisare le cellule del sangue rosso, Risospendere la sospensione cellulare in 5 mL di 0,2 M NH4Cl e incubare a temperatura ambiente per 10 min. invertire i tubi capovolta delicatamente ogni 2 minuti aggiungere 5 mL di HBSS alla fine dell'incubazione per interrompere la lisi.</li>
	<li>Centrifugare le provette a 433 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in circa 5 mL di HBSS. Riempire le provette con HBSS.</li>
	<li>Centrifugare le provette a 433 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in circa 5 mL di HBSS. Riempire le provette con HBSS.</li>
	<li>Centrifugare le provette a 433 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 5 mL di HBSS per Timo e 10 mL per la milza.</li>
	<li>Trasferimento 1 mL della sospensione delle cellule timiche e 500 µ l della sospensione delle cellule spleniche di 5ml rotondo fondo tubi con tappi filtro cella. Applicare la sospensione cellulare i tappi filtro cella. Nota: Una rete di nylon 35 µm è incorporata nella PAC. Circa 5 milioni di cellule sono stati raccolti in ciascun tubo.</li>
</ol>3. singola cella isolamento da PDLN
<ol><li>Posiziona una maglia di metallo 250 µm sterile in una provetta conica da 15 mL in un rack. Sciacquare la mesh con 1 mL di RPMI.</li>
	<li>Trasferire i linfonodi per la rete metallica e li pestava attraverso la mesh usando un paio di pinzette. Applicare 1 mL di RPMI sulla maglia metallica per svuotare le cellule nel tubo. Ripetere 3 volte e rimuovere la mesh.</li>
	<li>Centrifugare le provette a 433 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in circa 5 mL di RPMI. Riempire le provette con RPMI.</li>
	<li>Centrifugare le provette a 433 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in circa 5 mL di RPMI. Riempire le provette con RPMI.</li>
	<li>Centrifugare le provette a 433 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 2 mL di RPMI. Trasferimento 2 mL di sospensione cellulare a 5 mL rotondo fondo tubi con tappi filtro cella. Applicare la sospensione cellulare i tappi filtro cella.</li>
</ol>4. flusso Cytometry
<ol><li>Centrifugare le sospensioni delle cellule da timo, PDLN e milza a 433 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Macchia le celle con i seguenti anticorpi di superficie in 100 µ l di citometria a flusso macchiatura buffer (buffer di FACS): 0,75 µ g/100 µ l coniugato FITC CD4 anticorpo, 0,60 anticorpo coniugato APC-H7 CD8 µ g/100 µ l, 0.30 µ g/100 µ l CD25 PE-coniugato anticorpo, 5 µ l (01:20) Anticorpo Nrp1 coniugato APC. Incubare le provette in ghiaccio per 40 min.</li>
	<li>Aggiungere 200 µ l di tampone di FACS in ogni provetta. Centrifugare le provette a 433 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante. Ripetere un'altra volta.</li>
	<li>Difficoltà e permeabilize le cellule da risospendere il pellet cellulare in 500 µ l di permeabilizzazione fissazione Buffer (PFB). Nota: PFB è preparata mescolando 1 parte di fissazione/Permeabilization concentrato con 3 parti di fissazione/Permeabilization diluente.</li>
	<li>Mantenere le provette in frigorifero a 4 ° C durante la notte. Nota: Un'incubazione di 1 h funziona anche.</li>
	<li>Centrifugare le provette a 433 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 500 µ l di Buffer di lavaggio di permeabilizzazione (PWB). Centrifugare le provette a 433 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante. Nota: PWB si prepara diluendo Permeabilization Buffer (10x) a 01:10 in acqua distillata.</li>
	<li>Macchia le celle con i seguenti anticorpi intracellulari in 100 µ l di PWB: 0,30 µ g/100 µ l Foxp3 PE-Cy7-coniugato anticorpo, anticorpo coniugato PacificBlue Helios 4 µ l (01:25). Incubare le provette in ghiaccio per 1h.</li>
	<li>Aggiungere 500 µ l di PWB in ogni provetta. Centrifugare le provette a 433 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare in 500 µ l di PWB. Centrifugare le provette a 433 x g per 5 min a 4 ° C. Scartare il surnatante.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare a 300 µ l di tampone di FACS.</li>
	<li>Analizzare le cellule su un citometro a flusso.</li>
	<li>Le singole cellule basate su zona Side Scatter, altezza e larghezza e Forward Scatter-Area, altezza e larghezza del cancello. Eseguire 1 milione gli eventi per l'analisi.</li>
	<li>Esportare i file FCS di esperimenti e analizzarli utilizzando un software analizzatore di citometria a flusso.</li>
</ol>

<ol><li>Fontenot, J. D., Gavin, M. A., Rudensky, A. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Foxp3+programs+the+development+and+function+of+CD4%2BCD25%2B+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Foxp3 programs the development and function of CD4+CD25+ regulatory T cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 330-336 (2003).</li>
<li>Khattri, R., Cox, T., Yasayko, S. A., Ramsdell, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+Scurfin+in+CD4%2BCD25%2B+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">An essential role for Scurfin in CD4+CD25+ T regulatory cells.</a> Nature Immunology. 4 (4), 337-342 (2003).</li>
<li>Hori, S., Nomura, T., Sakaguchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+regulatory+T+cell+development+by+the+transcription+factor+Foxp3%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3.</a> Science. 299 (5609), 1057-1061 (2003).</li>
<li>Sakaguchi, S., Sakaguchi, N., Asano, M., Itoh, M., Toda, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunologic+self-tolerance+maintained+by+activated+T+cells+expressing+IL-2+receptor+alpha-chains+%28CD25%29.+Breakdown+of+a+single+mechanism+of+self-tolerance+causes+various+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains (CD25). Breakdown of a single mechanism of self-tolerance causes various autoimmune diseases.</a> The Journal of Immunology. 155 (3), 1151-1164 (1995).</li>
<li>Vignali, D. A., Collison, L. W., Workman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+regulatory+T+cells+work%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Review+Immunology%22%5BJournal%5D)">How regulatory T cells work.</a> Nature Review Immunology. 8 (7), 523-532 (2008).</li>
<li>Thornton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Helios%2C+an+Ikaros+transcription+factor+family+member%2C+differentiates+thymic-derived+from+peripherally+induced+Foxp3%2B+T+regulatory+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells.</a> The Journal of Immunology. 184 (7), 3433-3441 (2010).</li>
<li>Weiss, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin+1+is+expressed+on+thymus-derived+natural+regulatory+T+cells%2C+but+not+mucosa-generated+induced+Foxp3%2B+T+reg+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuropilin 1 is expressed on thymus-derived natural regulatory T cells, but not mucosa-generated induced Foxp3+ T reg cells.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), 1723-1742 (2012).</li>
<li>Yadav, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropilin-1+distinguishes+natural+and+inducible+regulatory+T+cells+among+regulatory+T+cell+subsets+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuropilin-1 distinguishes natural and inducible regulatory T cells among regulatory T cell subsets in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 209 (10), S1711-S1719 (2012).</li>
<li>Singh, K., Hjort, M., Thorvaldson, L., Sandler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concomitant+analysis+of+Helios+and+Neuropilin-1+as+a+marker+to+detect+thymic+derived+regulatory+T+cells+in+naive+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Concomitant analysis of Helios and Neuropilin-1 as a marker to detect thymic derived regulatory T cells in naive mice.</a> Scientific Reports. 5, 7767(2015).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+spleen+with+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of single-cell suspensions from mouse spleen with the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (22), (2008).</li>
<li>Jungblut, M., Oeltze, K., Zehnter, I., Hasselmann, D., Bosio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+preparation+of+single-cell+suspensions+from+mouse+lung+tissue+using+the+gentleMACS+Dissociator%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Standardized preparation of single-cell suspensions from mouse lung tissue using the gentleMACS Dissociator.</a> Journal of Visualized Experiments. (29), (2009).</li>
<li>Singh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-35+administration+counteracts+established+murine+type+1+diabetes--possible+involvement+of+regulatory+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Interleukin-35 administration counteracts established murine type 1 diabetes--possible involvement of regulatory T cells.</a> Scientific Reports. 5, 12633(2015).</li>
<li>Digre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+heparanase+enhances+T+lymphocyte+activities+and+intensifies+the+inflammatory+response+in+a+model+of+murine+rheumatoid+arthritis%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Overexpression of heparanase enhances T lymphocyte activities and intensifies the inflammatory response in a model of murine rheumatoid arthritis.</a> Scientific Reports. 7, 46229(2017).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pro-tumoral+immune+cell+alterations+in+wild+type+and+Shb-deficient+mice+in+response+to+4T1+breast+carcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Pro-tumoral immune cell alterations in wild type and Shb-deficient mice in response to 4T1 breast carcinomas.</a> Oncotarget. 9 (27), 18720-18733 (2018).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In questo studio, abbiamo isolato cellule singole ghiandole del timo, PDLNs e milze di topi NOD e studiato l'espressione di Helios e Nrp1 in CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg cellule mediante citometria a flusso. Nel presente studio, sono stati utilizzati topi NOD, che è un modello murino di diabete di tipo 1. In uno studio precedente, abbiamo utilizzato il CD-1 diversi ceppi di topi wild-type e topi C57BL/6 di indagare se Helios o Nrp1 è un migliore indicatore per distinguere le cellul...

Cellule regolarici di T (Treg) sono critiche per l'omeostasi del sistema immunitario. Le cellule Treg sono definite dall'espressione di antigeni di superficie CD4 e CD25 e la trascrizione fattore forkhead box P3 (Foxp3)1,2,3. Sakaguchi et al. in primo luogo ha mostrato che CD25 è costitutivamente espresso sulle cellule del soppressore di T in topi4, che ha fornito un'osservazione pionieristica per l'identificazione di cellule Treg umane. Le cellule Treg svolgono un ruolo centrale nella tolleranza immunitaria esercitando una soppressiva capacità attraverso una varietà di meccanismi, tra cui citolisi attraverso la secrezione di granzimi per indurre apoptosi, consumo di citochina e inibizione attraverso l'espressione di citotossici T-linfociti antigene 45. Inoltre, essi possono secernere citochine inibitorie come trasformazione di fattore di crescita beta (TGF-β), interleukin-10 (IL-10) e IL-355. Le cellule Treg naturalmente possono essere derivate dal timo, nel qual caso sono designati timica derivate cellule Treg (tTreg), o può essere indotta negli organi periferici, nel cui caso sono chiamati marginalmente indotto le cellule Treg (pTreg).
Helios, un membro della famiglia di fattore di trascrizione Ikaros, è stato segnalato per essere un indicatore per la distinzione tra cellule tTreg e cellule pTreg6. Più tardi, altri due gruppi ha riferito che Neuropiline 1 (Nrp1), un recettore III semaforine, potrebbe servire come un indicatore della superficie per le cellule di tTreg sotto certe condizioni7,8. Tuttavia, Singh et al hanno dimostrato che l'Helios è un migliore indicatore in questo contesto ingenuo topi9.
I sottoinsiemi di cellule Treg giocano un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'omeostasi del sistema immunitario e nella protezione contro l'autoimmunità e infezione. Pertanto, è importante determinare i numeri e le proporzioni di queste popolazioni nei tessuti non linfoidi e linfoidi. Per raggiungere questo obiettivo, bisogna preparare sospensioni singola cella da questi organi. Diversi protocolli sono stati descritti o utilizzato negli studi precedenti. Principalmente, Dissociatori automatici sono stati utilizzati in rapporti precedentemente pubblicati10,11. Utilizzo automatici Dissociatori è conveniente e risparmio di tempo, ma è una procedura costosa. Di conseguenza, abbiamo utilizzato un metodo manuale per preparare sospensioni di cellule singole da murini ghiandole del timo, linfonodi drenanti del pancreas (PDLNs) e milze di topi diabetici non obesi (NOD) di normoglycemic e cellule singole isolate da questi organi. Questo metodo è stato utilizzato nei nostri studi precedenti e abbiamo trovato che il metodo manuale per la preparazione di sospensione unicellulare è efficiente come dissociatore automatico metodo9,12,13,14. Inoltre, abbiamo utilizzato la citometria a flusso per determinare le proporzioni di CD4+CD8–CD25+Foxp3+ Treg le cellule e i sottoinsiemi di Treg cells in tTreg e pTreg. Le cellule tTreg e pTreg sono stati distinti con Helios e Nrp1 come marcatori per tTreg cella. Quindi, i nostri risultati indicano che il metodo manuale per la preparazione di singole cellule funziona in modo efficiente e le sospensioni preparate singola cella possono essere ulteriormente utilizzate per gli studi mediante citometria a flusso.

<table><tbody><tr><td>Topi</td><td></td><td></td> NOD <td>Panatura interna</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Statens veterin&auml; </td><td>991750</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R0883-500ML</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>EMD Millipore</td><td>1011450500</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience Foxp3 / Set di tamponi per colorazione del fattore di trascrizione</td><td>ThermoFisher</td><td>00-5523-00</td><td>Contiene concentrato di fissazione/permeabilizzazione, diluente di fissazione/permeabilizzazione e tampone di permeabilizzazione (10x)</td></tr><tr><td>eBioscience Tampone di colorazione per citometria a flusso</td><td>ThermoFisher</td><td>00-4222-26</td><td></td></tr><tr><td>CD4 Anticorpo monoclonale (RM4-5), FITC, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0042-85</td><td></td></tr><tr><td>CD25 Anticorpo monoclonale (PC61.5), PE, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>12-0251-83</td><td></td></tr><tr><td>BD Pharmingen&nbsp; APC-H7 Ratto anti-topo CD8a</td><td>BD Biosciences</td><td>560182</td><td></td></tr><tr><td>Topo Neuropilin-1 APC-coniugato Anticorpo</td><td>R & D Systems</td><td>FAB5994A</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo monoclonale FOXP3 (FJK-16s), PE-Cianina7, eBioscience</td><td>ThermoFisher</td><td>25-5773-82</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Helios umano anti-topo Pacific Blue</td><td>BioLegend</td><td>137220</td><td></td></tr><tr><td>Provetta in polistirene a fondo tondo Falcon 5 mL, con filtro cellulare Tappo a scatto</td><td>CORNING</td><td>352235</td><td>A 35 &; m la rete di nylon è incorporata nel tappo a scatto a doppia posizione</td></tr><tr><td>Provetta 15 mL, 120 mm x17 mm, PP</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td></td></tr><tr><td>Microprovetta 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>Fiale a scintillazione monouso</td><td>Citometria a flusso WHEATON</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Software di analisi per</td> citometria a flusso BD <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Inivai Technologies</td><td>Flowlogic</td><td></td></tr></tbody></table>

determinazione dei sottoinsiemi di regolamentazione delle cellule t nel timo murino, pancreatico drenante linfonodi e milza mediante citometria a flusso

Determination of Regulatory T Cell Subsets in Murine Thymus, Pancreatic Draining Lymph Node and Spleen Using Flow Cytometry

Il nostro sistema immunitario è costituito da un numero e una varietà di cellule immuni compreso le cellule T regolatorie (Treg) di cellule. Le cellule Treg possono essere diviso in due sottoinsiemi, cellule Treg (tTreg) derivate timiche e marginalmente indotto le cellule Treg (pTreg). Sono presenti in diversi organi del nostro corpo e possono essere distinti dagli indicatori specifici, quali Helios e Neuropiline 1. È stato segnalato che le cellule tTreg sono funzionalmente più soppressive rispetto alle cellule pTreg. Pertanto, è importante determinare la proporzione di cellule tTreg e pTreg durante l'analisi di popolazioni eterogenee delle cellule. Nel presente documento, abbiamo raccolto ghiandole del timo, linfonodi drenanti pancreatici e milze dai topi diabetici non obesi normoglicemici di distinguere le cellule di tTreg dalle cellule pTreg mediante citometria a flusso. Abbiamo preparato manualmente sospensioni di cellule singole da questi organi. Fluorocromo coniugato superficie CD4, CD8, CD25 e Neuropiline 1 anticorpi sono stati utilizzati per colorare le cellule. Erano tenute in frigorifero durante la notte. Il giorno successivo, le cellule sono state macchiate con fluorocromo coniugato anticorpi intracellulari di Foxp3 e Helios. Questi indicatori sono stati usati per caratterizzare i due sottoinsiemi di cellule Treg. Questo protocollo viene illustrato un modo semplice ma pratico per preparare singole cellule da timo murino, pancreatico drenante linfonodi e milza e utilizzarli per l'analisi citofluorimetrica.

Per studiare l'espressione di Nrp1 e Helios sulle cellule tTreg e pTreg, abbiamo preparato le celluli dalle ghiandole del timo, PDLNs e milze di topi NOD normoglicemici e li macchiato con gli indicatori delle cellule Treg CD4, CD25, Foxp3, Helios e Nrp1 per flusso cytometric analisi. I risultati sono stati analizzati come mostrato nel rappresentante gating strategie (Figura 1). Abbiamo trovato che la proporzione di cellule di Helios+ tra CD4+<...

Qui, presentiamo un protocollo per preparare singole cellule da timo murino, pancreatico drenante linfonodi e milza per studiare ulteriormente queste cellule mediante citometria a flusso. Inoltre, questo protocollo è stato utilizzato per determinare le sottopopolazioni di cellule T regolatorie mediante citometria a flusso.

Determinazione dei sottoinsiemi di regolamentazione delle cellule T nel timo murino, pancreatico drenante linfonodi e milza mediante citometria a flusso

Our immune system consists of a number and variety of immune cells including regulatory T cells (Treg) cells. Treg cells can be divided into two subsets, ...

Questo protocollo aiuta a indagare il ruolo delle cellule immunitarie in particolari organi in salute e patologia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che questa è una tecnica economica poiché è una tecnica manuale. A dimostrare la procedura sarà Zhengkang Luo, dottorando del mio laboratorio.Per iniziare, posizionare le ghiandole timiche e le milza di topi precedentemente eutanasiati in fiale a scintillazione da 20 ml, o tubi conici da 15 ml, riempiti con 5 ml della soluzione salina bilanciata di Hank. Posizionare i linfonodi drenante pancreatico in micro-tubi da 1,5 ml riempiti con 1 ml di RPMI-1640. Assicurarsi di utilizzare l'intero timo e milza e tutti i PDLN.Tenere gli organi sul ghiaccio per tutta la procedura. Usando un paio di forbici, spremere accuratamente il timo e la milza per rilasciare le cellule immunitarie. Scartare le restanti capsule timiche e spleniche.Trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 ml. Centrifugare a 433 volte g e a 4 gradi celsius per cinque minuti, e scartare il supernatante. Per liscire i globuli rossi, sospendere di nuovo la sospensione cellulare in 5 ml di cloruro di ammonio molare e incubare a temperatura ambiente per dieci minuti.Invertire delicatamente i tubi ogni due minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere 5 ml di HBSS per interrompere la lisi. Centrifugare i tubi a 433 volte g e a 4 gradi celsius per cinque minuti.Scartare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in circa 5 ml di HBSS. Quindi, riempire i tubi con HBSS. Ripetere questo processo, dalla centrifugazione dei campioni al riempimento del tubo con HBSS, una volta.Centrifugare i tubi ancora una volta a 433 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in HBSS. Ottenere tubi a fondo tondo da 5 ml con tappi a filtro cellulare.Trasferire 1 ml della sospensione della cella timica e 500 microlitri della sospensione cellulare splenica ai tubi applicando la sospensione ai tappi del filtro cellulare. Per prima cosa, metti un tubo conico da 15 ml in un rack. Posizionare una rete metallica sterile da 250 micrometri sul tubo.Risciacquare la rete con 1 ml di RPMI. Successivamente, trasferire i linfonodi sulla rete metallica e utilizzare un paio di pinzette per macinarli attraverso la rete. Applicare 1 ml di RPMI sulla rete per sciacquare le celle nel tubo.Ripetere questo processo di trasferimento e macinazione dei linfonodi tre volte per ogni campione, quindi rimuovere la rete. Centrifugare i tubi a 433 volte g e a quattro gradi celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in circa 5 ml di RPMI.Quindi, riempire i tubi con RPMI. Ripetere questo processo, dalla centrifugazione dei campioni al riempimento del tubo con RPMI, una volta. Centrifugare nuovamente i tubi a 433 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti.Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare in 2 ml di RPMI. Trasferire 2 ml della sospensione cellulare in tubi a fondo tondo da 5 ml con tappi a filtro cellulare. In primo luogo, centrifugare la sospensione cellulare dai campioni di timo, milza e PDLN a 433 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti.Scartare il supernatante. Macchiare le cellule con anticorpi superficiali come delineato nel protocollo di testo e incubare i tubi sul ghiaccio per 40 minuti. Aggiungere quindi 200 microlitri di tampone FACS a ciascun tubo.Centrifugare a 433 volte g e a quattro gradi celsius per cinque minuti, e scartare il supernatante. Ripetere questo processo, aggiungendo il buffer, centrifugando e scartando il supernatante, una volta. Sospendere di nuovo il pellet cellulare in 500 microlitri di tampone di fissaggio permeabilizzazione per fissare e permeabilizzare le cellule.Trasferire i tubi in frigorifero a quattro gradi celsius durante la notte. Il giorno dopo, centrifuga i tubi a 433 volte g e a quattro gradi Celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare in 500 microlitri di tampone di lavaggio permeabilizzazione.Centrifugare nuovamente le cellule a 433 volte g e a quattro gradi celsius per cinque minuti e scartare il supernatante. Macchiare le cellule con anticorpi intracellulari, come delineato nel protocollo di testo. Incubare i tubi sul ghiaccio per 1 ora.Successivamente, aggiungere 500 microlitri di tampone di lavaggio permeabilizzazione a ciascun tubo. Centrifuga a 433 volte g e a quattro gradi celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet in 500 microlitri di tampone di lavaggio permeabilizzazione.Centrifuga ancora una volta a 433 volte g e a quattro gradi celsius per cinque minuti. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet cellulare in 300 microlitri di tampone FACS. Quindi, analizzare le celle su un citometro di flusso, come descritto nel protocollo di testo.In questo studio, le singole cellule sono isolate da ghiandole timemiche, PDLN e milza di normali topi NOD glicemici, e sono macchiate con marcatori cellulari Treg, CD4, CD25, Foxp3, Helios e neuropilina-1 per l'analisi citometrica del flusso. I risultati vengono analizzati e qui vengono mostrati come strategie rappresentative di gating. La proporzione di cellule elios-positive tra le cellule Treg cd4 positive, CD8-negative, CD25-positive, Foxp3-positive è vista come superiore a quella delle cellule Nrp1-positive in tutti e tre gli organi.Più dell'80% delle cellule di Treg nel timo sono viste esprimere Helios, che è più alto che nel PDLN, e la milza. La proporzione di cellule NrP1-positive tra le cellule Treg elios-positive è considerata più alta nel PDLN rispetto a quelle nel timo o nella milza. La maggior parte delle cellule treg positive nrp1 esprimono anche Helios, e la proporzione di cellule elios-positive tra le cellule Treg positive Nrp1 è vista come più alta nel timo e nella milza che nel PDLN.Insieme, questi risultati indicano che Helios è un marcatore migliore per rilevare le cellule T Treg rispetto a Nrp1. I linfonodi sono piccoli, ma alcuni marcatori intracellulari richiedono un gran numero di cellule per dare un buon segnale nella citometria del flusso. Altri metodi non possono essere eseguiti dopo questa procedura perché le celle sono già macchiate e morte.Ma i quattro marcatori cellulari dell'animale possono essere sostituiti per studiare altri tipi di cellule immunitarie.

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Mouse Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento T cellulare e<em&gt; In vitro</em&gt; Differenziazione in T sottopopolazioni cellulari

Questo articolo descrive spettrale citometria, un nuovo approccio per citometria di flusso che utilizza le forme di spettri di emissione per distinguere fluorocromi. Un algoritmo sostituisce compensazioni e può trattare auto-fluorescenza come parametro indipendente. Questo nuovo approccio permette la corretta analisi delle cellule isolate da organi solidi.

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Determinazione dei sottoinsiemi di regolamentazione delle cellule T nel timo murino, pancreatico drenante linfonodi e milza mediante citometria a flusso (Video) | JoVE Journal

Determinazione dei sottoinsiemi di regolamentazione delle cellule T nel timo murino, pancreatico drenante linfonodi e milza mediante citometria a flusso

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