Induzione di intestinale Graft - versus - host Disease e sua valutazione endoscopica Mini in topi dal vivo

La valutazione mini-endoscopica del colon nei topi vivi fornisce un supporto sperimentale chiave per lo studio delle manifestazioni intestinali della malattia acuta grafo-contro-ospite, GvHD, sul trapianto di cellule staminali allogeniche ed ematopoietiche. La valutazione non invasiva della colite acuta correlata al GvHD può funzionare come sostituto funzionante dell'istopatologia gold standard, rendendo così inutili ripetuti sacrifici animali per ottenere campioni di tessuto. A dimostrare la procedura sarà Vera Buchele, un post-doc del mio laboratorio.

Un giorno dopo l'irradiazione totale del corpo dei topi BALB/c riceventi, posizionare un topo donatore 5B6 SJL vivo CD-45.1 nella posizione prona su una fodera di lavoro pulita e utilizzare una punta curva e seghettata di 13 cm di una forza simkin per sollevare la pelliccia ad un tallone d'Achille. Utilizzando forbici fini indurite da 8,5 cm con punte dritte, incidere la pelle tra le forcep e un tallone, allungando l'incisione cranicamente per facilitare la rimozione della pelle e della pelliccia dagli arti posteriori. Quando la pelle è stata rimossa dagli arti posteriori, tagliare ogni anca, caviglia e articolazione del ginocchio.

Conservare la coscia e il gambo di ogni arto posteriore in un'unica piastra di Petri da 92 mm riempita di PVS sul ghiaccio e rimuovere con cura il maggior numero possibile di muscoli da ogni osso, trasferendo ogni femore e tibia puliti in un tubo da 50 ml di mezzo sterile RPMI 1640 su ghiaccio bagnato. Per isolare il midollo osseo, trasferire un osso alla volta in una nuova piastra di Petri da 92 mL riempita con mezzo RPMI 1640 fresco e utilizzare un bisturi per tagliare le estremità di ogni osso. Successivamente, utilizzare una siringa da 1 ml dotata di un ago calibro 26 per sciacquare le ossa con 1 ml di mezzo fresco alla volta in un tubo di raccolta da 50 ml contenente 5 ml di mezzo.

Una volta che tutte le ossa sono state latte, pipettare delicatamente i pezzi di midollo osseo friabile su e giù più volte per generare una sospensione a cella singola prima di filtrare le cellule attraverso un filtro cellulare a rete da 40 micrometri in un nuovo tubo di raccolta da 50 ml. Pellettare le cellule mediante centrifugazione e sospendere di nuovo le cellule in 5 mL di tampone di lisi del cloruro di ammonio di potassio per un'incubazione di tre minuti a temperatura ambiente. Alla fine dell'incubazione, interrompere la reazione con 10 mL di PVS e centrifugare nuovamente le cellule.

Sospendere di nuovo il pellet in 2 mL di PVS fresco per il conteggio e mettere da parte un'aliquota sei volte 10 alla sesta cella per l'analisi citometrica a flusso a valle. Successivamente, utilizzare un kit di purificazione cellulare disponibile in commercio per esaurire magneticamente le cellule T CD90.2-positive dalla sospensione a cella singola del midollo osseo, secondo le istruzioni del produttore, e mettere da parte un'aliquota di una volta e 10 alla sesta cella dell'eluato impoverito della cellula T per l'analisi citometrica a flusso a valle della purezza e della composizione cellulare prima e dopo la separazione. Quindi, utilizzare una siringa da 1 ml dotata di un ago calibro 30 per iniettare cinque volte 10 alla quinta cellule del midollo osseo impoverite di cellule T in 100 microlitri di PVS per via endovenosa nello spazio retrobulbare del seno venoso di ogni animale ricevente irradiato.

Il giorno successivo, posizionare una milza raccolta da un animale donatore su un colino a rete da 40 micrometri in un tubo di raccolta da 50 ml e utilizzare uno stantuffo per siringhe per premere il tessuto di milza attraverso il colino nel tubo. Lavare il colino e lo stantuffo con PVS per raccogliere tutti gli splenociti e pelletare le cellule mediante centrifugazione. Dopo aver dimostrato lalisi dei globuli rossi, sospendere i globuli bianchi per il conteggio e mettere da parte un'aliquota sei volte 10 alla sesta cella per l'analisi citometrica a flusso a valle.

Per un isolamento totale delle cellule T CD3-positive dagli splenociti totali, utilizzare un kit di purificazione cellulare disponibile in commercio secondo le istruzioni del produttore e mettere da parte un'aliquota della cella a T positiva uno per 10 al sesto CD3 dalla frazione cellulare positiva per l'analisi citometrica a flusso a valle della purezza e della composizione cellulare prima e dopo la separazione. Quindi, iniettare sette volte 10 alla quinta cella T positiva al CD3 alloreattiva in 100 microlitri di PVS per via endovenosa nello spazio retrobulbar di ogni mouse ricevente per indurre GvHD. Per segnare lesioni correlate al GvHD mediante mini-endoscopia della regione colorettale distatale, sollevare la coda di un animale ricevente appena sopra la radice della coda con una mano e utilizzare l'altra mano per inserire con cura l'endoscopio nel retto attraverso l'ano.

Mentre il flusso d'aria gonfia il lume colorettale, spostare lentamente e con attenzione l'endoscopio in avanti nella direzione aborale. Per evitare lesioni intestinali coloniche, mantenere l'endoscopio nella zona centrale del lume utilizzando lo schermo video in diretta per aiutare in questo posizionamento. Inizia a registrare il flusso video e segnare l'infiammazione, valutando l'infiammazione del colon correlata al GvHD segnando i parametri come illustrato.

Quando è stato individuato un punto di punteggio, spostare l'endoscopio delicatamente e leggermente avanti e indietro per valutare i diversi parametri. Per valutare la traslucenza del parametro e la consistenza delle feci, posizionare l'endoscopio a una distanza più ampia in relazione alla parete colonica. Per valutare la granularità e la vascolarizzazione della lesione, posizionare l'endoscopio nelle immediate vicinanze della parete colonica e applicare attentamente la tensione ben dosata alla parete colonica con la punta dell'endoscopio.

Al termine del processo di punteggio, interrompere la registrazione. Rispetto ai controlli, il trapianto di cellule staminali ematopoieiche allogeniche come dimostrato produce un'induzione riproducibilmente robusta di un fenotipo GvHD sistemico, con un progressivo aumento dei punteggi clinici di GvHD negli animali ricevente. Questi criteri mini-endoscopicamente valutabili sono stati specificamente adattati dalla colite sigeneica precedentemente riportata nel contesto dei parametri di punteggio della colite guidati dalla risposta allo per la descrizione precisa, il punteggio e la classificazione delle lesioni intestinali associate alla malattia di GvHD nel colon distale.

Infatti, il sistema di classificazione mini-endoscopicamente basato consente una facile discriminazione dei topi riceventi di linfociti donatori con gravi segni di infiammazione intestinale da parte di topi di controllo che sono essenzialmente privi di GvHD. Invalidazione degli studi istopatologici del sistema di classificazione mini-endoscopicamente basati ha confermato che il colon dei topi gravemente colpito da infiammazione correlata al GvHD mostra segni istopatologici altrettanto forti di infiammazione. Al contrario, i tessuti del colon dei topi di controllo non mostrarono al massimo lievi segni istopatologici di infiammazione, in accordo con l'assenza virtuale di segni mini-endoscopicamente rilevabili di colite.

Inoltre, studi di correlazione tra l'attività della colite mini-endoscopicamente e istopatologicamente valutata e i punteggi sistemici di GvHD dimostrano che i punteggi di infiammazione colon-GvHD mini-endoscopicamente determinati da punteggi inferiori o uguali a tre prevedono in modo affidabile l'assenza di punteggi di infiammazione colon-GvHD intestinali di medio-alto grado ottenuti dalla classificazione istopologica. Inoltre, la gravità del GvHD intestinale valutato endoscopicamente mostra una correlazione con l'attività sistemica della malattia GvHD. Per standardizzare i risultati della valutazione mini-endoscopica dell'infiammazione del colon e per garantire la comparabilità tra diversi topi ed esperimenti nel tempo, è necessario selezionare un sito anatomico definito per il punteggio.

Oltre a segnare l'infiammazione del colon, il canale di lavoro integrato all'interno della configurazione mini-endoscopica consente il recupero di biopsie tissutali guidate dalla vista applicabili a varie analisi a valle, come l'istopatologia standard. A causa della natura non invasiva della mini-endoscopia, la colite acuta correlata al GvHD può essere ripetutamente valutata all'interno dello stesso animale praticamente in qualsiasi momento, fornendo così affascinanti intuizioni sul GvHD intestinale.