Name: Sintesi e caratterizzazione delle nanoparticelle doro dellanfifile (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-07-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Scopri la sintesi di nanoparticelle d'oro anfifile con riproducibilità batch-to-batch. Questo metodo dettagliato include caratterizzazione NMR e TEM per applicazioni biologiche affidabili.

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Ringraziano la Fondazione nazionale svizzera per la scienza e, in particolare, la NCCR "Ingegneria dei sistemi molecolari". Ringraziano il sostegno della Divisione II della Fondazione nazionale svizzera per la scienza. Tutti gli autori ringraziano Quy Ong per le discussioni fruttuose e per la revisione del manoscritto.

1. Sintesi di 11-mercapto-1-undecanesulfonate (MUS)
NOTA: questo protocollo può essere utilizzato su qualsiasi scala desiderata. Qui viene descritta una scala di 10 g di prodotto.
<ol><li>Sodio undec-10-enesulfonato
	<ol>
<li>Aggiungere 11 bromo-1-undecene (25 mL, 111.975 mmol), solfato di sodio (28,75 g, 227,92 mmol) e bromuro di benzyltriethylammo (10 mg) a una miscela di 200 mL di metanolo (MeOH) e 450 mL di acqua deionizzata (DI) (4:9 v/v MeOH:H2O ratio) in un rapporto di 1 lask .</li>
		<li>Reflusso della miscela di reazione a 102 gradi centigradi per 48 h. Cap il sistema con un meccanismo di sollievo della pressione, ad esempio un palloncino con un ago, o semplicemente un ago. Questa reazione non è sensibile ai gas atmosferici. NOTA: la soluzione diventa incolore quando la reazione è completa.</li>
		<li>Collegare la miscela di reazione a un evaporatore rotante per far evaporare MeOH e ridurre il volume a circa 300 mL.</li>
		<li>Trasferire la soluzione rimanente in un imbuto di aggiunta 1 L.</li>
		<li>Estrarre la soluzione acquosa rimanente 5x con etere dietil, utilizzando l'imbuto di addizione. Non reagito 11-bromo-1-undecene rimane nella fase etere dietilee e il prodotto solforato in H2O. AVVISO: Rilasciare frequentemente qualsiasi accumulo di pressione durante l'estrazione e consultare il corretto utilizzo delle imbuti di addizione.</li>
		<li>Raccogliere l'ultima soluzione di acqua estratta in un flacone rotondo collo singolo da 1 L.</li>
		<li>Collegare il pallone di reazione a un evaporatore rotante mettendo un po 'di grasso (o strisce ad anello di Teflon o qualsiasi altro sigillante) tra il pallone e la trappola.</li>
		<li>Diminuire lentamente il vuoto per far evaporare la fase aqueous in un evaporatore rotante. Poiché il prodotto è un surfactant, la schiuma si verificherà durante l'evaporazione. Per aggirare questo problema, seguire le istruzioni nel passaggio successivo.<ol>
<li>Aggiungere etanolo alla miscela per accelerare l'evaporazione di H2O e prevenire la schiuma. Quando la schiuma si riavvia a causa della diminuzione del contenuto di etanolo, interrompere l'evaporazione, rimuovere il pallone dall'evaporatore rotante, aggiungere più etanolo (circa un terzo del volume totale) e ricollegare il pallone all'evaporatore rotante. Ripetere questo processo fino a quando la miscela di soluzione diminuisce in modo significativo e non forma bolle.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Asciugare la polvere bianca direttamente collegando il pallone ad un vuoto elevato. Più secca è la polvere, i sali meno inorganici si insinuano nei passaggi successivi. NOTA: Il calore può essere utilizzato per asciugare il prodotto, ad esempio mantenendo il pallone sotto vuoto in un bagno di 60 gradi centigradi e lasciato durante la notte.</li>
		<li>Sospendere la polvere bianca in 400 mL di metanolo in una fiaschetta. Sonicare per sciogliere la quantità massima di prodotto. NOTA: L'obiettivo di questa fase è quello di sciogliere il prodotto ma non i sottoprodotti inorganici, come l'eccesso di solfato di sodio e il bromuro di sodio, che hanno una limitata solubilità nel metanolo. Utilizzare metanolo con il più basso contenuto di acqua possibile, perché l'acqua nel metanolo aumenterà la solubilità dei sottoprodotti inorganici nel solvente.</li>
		<li>Per aumentare la solubilità del prodotto, il metanolo può essere riscaldato delicatamente vicino al suo punto di ebollizione. AVVISO: Assicurarsi di lavorare sotto un cofano di fume durante il riscaldamento del pallone. I fumi del metanolo evaporato sono pericolosi.</li>
		<li>Filtrare la soluzione per rimuovere il metanolo insolubile sottoprodotti inorganici inorganici. Utilizzare un flacone filtrante collegato a una pompa a vuoto e un imbuto filtrante con carta filtrante quantitativa o un filtro borosilicate. Sia il prodotto che i sali inorganici sono polveri bianche quando sono asciutti: il prodotto è solubile nel metanolo, mentre i sali non lo sono.</li>
		<li>Trasferire la soluzione filtrata dal flacone filtrante a un pallone rotondo-inferiore da 1 L L.</li>
		<li>Collegare il pallone a un evaporatore rotante ed far evaporare la soluzione metanolica a 45 gradi centigradi, risciogliendo la polvere bianca nel metanolo e filtrare la soluzione (passaggi di protocollo 1.1.7, 1.1.8 e 1.1.9). Ripetere questo processo almeno 2x, per diminuire la quantità di sale inorganico.</li>
		<li>Raccogliere la polvere bianca e solubile a metanolo (circa 30 g, a questa scala).</li>
		<li>Sciogliere circa 10 mg di prodotto in 500 -L di D2O e trasferire la soluzione in un tubo NMR.</li>
		<li>Eseguire la spettrometria NMR 1H sul prodotto in D2O a 400 MHz con 32 scansioni. NOTA: le assegnazioni di picco per 1H NMR (D2O) sono 5,97 (m, 1H), 5,09 (m, 2H), 2,95 (t, 2H), 2,10 (m, 2H), 1,77 (q, 2H), 1,44 (br s, 12H).</li>
	</ol></li>
	<li>Sodio 11-acetilthio-undecanesulfonate
	<ol>
<li>Sciogliere circa 30 g di sodio undec-10-enesulfonato (il prodotto di reazione della sezione 1.1) in 500 mL di metanolo all'interno di una fiaschetta rotonda 1 L. Aggiungere un eccesso di 2,6 x di acido tioacetico alla soluzione e mescolare davanti a una lampada UV (250 W) durante la notte (12 h). Nel caso in cui una lampada UV non sia disponibile, la reazione può essere eseguita refluxing utilizzando un initiator radicale, come azobisisobutyronitrile (AIBN); tuttavia, l'uso di una lampada UV è fortemente raccomandato. AVVISO: Assicurarsi di lavorare sempre sotto il cofano del fume. Se il pallone deve essere trasportato in un altro spazio in cui si trova la lampada UV, sigillare il pallone per evitare di diffondere il forte odore di acido tioacetico. Prestare attenzione all'esercizio fisico quando si utilizza una lampada UV: bloccare completamente lo spazio in cui si trova la lampada e consultare le linee guida di sicurezza dell'istituto su come utilizzare una lampada UV.</li>
		<li>Monitorare la reazione prendendo 2 mL dalla reazione, evaporare solvente, e aggiungere acqua deuterata per controllare con 1H NMR. Una volta che i picchi corrispondenti al doppio legame scompaiono, fermare la reazione. NOTA: Di solito, dopo 12 h davanti alla lampada UV, la reazione è completa. Se la miscela di reazione diventa torbida, aggiungere più MeOH e continuare l'esposizione alla luce UV per sei ore aggiuntive.</li>
		<li>Evaporare tutto MeOH in un evaporatore rotante fino a quando il residuo solido diventa rosso-arancio. Se lasciato abbastanza a lungo, il prodotto diventa marrone a nero. AVVISO: Lavorare consapevolmente a causa dei forti odori dell'acido tioacetico. I forti odori di qualsiasi fuoriuscita di tiolate possono essere neutralizzati utilizzando una soluzione acquosa di candeggina (ipocloreto di sodio).</li>
		<li>Utilizzando un flacone filtrante, lavare il prodotto con etere dietileico per rimuovere qualsiasi acido tioacetico in eccesso, fino a quando non compaiono sostanze più colorate (giallo-arancio) nel supernatante etere etere. Asciugare il solido sotto vuoto elevato e, quindi, scioglierlo in metanolo, producendo una soluzione da giallo a arancione. NOTA: Aggiungere abbastanza metanolo per sciogliere il prodotto. NOTA: il colore può variare in questo passaggio.</li>
		<li>Aggiungere 3 g di nero fumo alla soluzione, mescolare vigorosamente e filtrare la miscela attraverso un mezzo di filtrazione (vedi Tabella deimateriali) coprendo i due terzi di una carta da filtro scanalata. NOTA: La struttura porosa del nero fumo cattura il materiale colorato del prodotto collaterale (e parte del prodotto). La soluzione filtrata deve essere chiara. Se la soluzione filtrata è ancora colorata (giallo), ripetere questo processo.</li>
		<li>Evaporare completamente il solvente in un evaporatore rotante e raccogliere circa 35 g di polvere bianca.</li>
		<li>Sciogliere 10 mg del prodotto in 500 dollari l'L di D2O e trasferire la soluzione ai tubi NMR.</li>
		<li>Eseguire 1H NMR sul prodotto in D2O a 400 MHz con 32 scansioni. NOTA: le assegnazioni di picco per H NMR (D2O) sono 2,93 (t, 4H), 2,40 (s, 3H), 1,77 (m, 2H), 1,62 (m, 2H), 1,45 (br s, 14H).</li>
	</ol></li>
	<li>11-mercapto-1-undecanesulfonate(MUS)
	<ol>
<li>Reflusso sodio 11-acetylthio-undecanesulfonate a 102 gradi centigradi in 400 mL di 1 M HCl per 12 h per fendere il gruppo tioacetato e ottenere un thiol.</li>
		<li>Trasferire il prodotto in un pallone rotondo da 1,5 L o 2 L. Aggiungere 200 mL di 1 M NaOH alla soluzione finale e riempirla con 400 mL di acqua DI per avere un volume finale di 1 L. Questo manterrà la soluzione acida e impedirà la cristallizzazione dei sali inorganici come sottoprodotto. NOTA: Una completa neutralizzazione della soluzione al pH 7 comporterà la cristallizzazione di un prodotto insolubile nel metanolo.</li>
		<li>Mantenere la soluzione chiara a 4 gradi centigradi e si cristallizzerà durante la notte. Il prodotto cristallizza come cristalli fini che sono viscosi quando sono bagnati. NOTA: per accelerare la cristallizzazione, aggiungere MUS presintedimensionato alla soluzione, se disponibile.</li>
		<li>Decant il supernatante chiaro e centrifugare lungo il prodotto bianco viscoso in tubi centrifuga 50 mL per 5 min a 4.000 x g.</li>
		<li>Decant il supernatante in un altro pallone e asciugare i pellet bianchi sotto vuoto elevato, a seconda della centrifuga disponibile, questo può essere 2 - 16 tubi o più. NOTA: il filtraggio non è consigliato a causa della natura surfactant del prodotto; si verificherà un'eccessiva schiuma e la maggior parte del prodotto andrà persa.</li>
		<li>Raccogliere circa 12 g (circa il 30% di rendimento) di MUS solubile a metanolo da questa fase di purificazione. NOTA: Tenere presente che la polvere è fine ed elettrostatica: tende ad attaccarsi alle spatole e alle superfici dei contenitori. Inoltre, più materiale può essere estratto dal supernatore della fase di centrifugazione riducendo il volume (a circa un terzo del suo valore originale) e mantenendolo a 4 gradi centigradi. Diminuire ancora di più il volume (del 75%) per aumentare la resa in questa fase.</li>
		<li>Sciogliere 10 mg del prodotto in 500 dollari l'L di D2O e trasferire la soluzione ai tubi NMR.</li>
		<li>Eseguire 1H NMR sul prodotto in D2O a 400 MHz con 32 scansioni. NOTA: le assegnazioni di picco di H NMR (D2O) sono 2,93 (t, 4H), 2,59 (t, 3H), 1,78 (m, 2H), 1,65 (m, 2H), 1,44 (br s, 14H). La massa molare calcolata (compresa la controzione al sodio) del prodotto è di 290,42 g/mol.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Sintesi di nanoparticelle: preparazione dei reagenti
<ol><li>Pulire tutti i bicchieri (un 250 mL e un pallone rotondo a collo singolo da 500 mL, un imbuto aggiuntivo da 100 mL e un piccolo imbuto) con acqua fresca (tre parti di acido cloridrico ad una parte di acido nitrico). Sciacquare il vetro con una quantità eccessiva di acqua all'interno di un cappuccio e rimuovere tutti i fumi. Quindi, sciacquare la vetreria con l'etanolo e asciugarla in un forno a base di vetro da laboratorio (si consigliano 40 - 60 gradi centigradi).</li>
	<li>Pesare 177,2 mg (0,45 mmol) di triidrato di cloruro in oro (III) (HAuCl4x3H2O) in una piccola fiala di vetro (10 o 20 ml di vetro pulito, o su carta di pesatura).</li>
	<li>Pesare 87 mg (0,3 mmol) MUS in una fiala di vetro di 20 mL.</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di metanolo per sciogliere il MUS. Sonicate in un bagno ad ultrasuoni fino a quando nessun materiale solido è visibile, per garantire la completa dissoluzione. NOTA: In alternativa, utilizzando una pistola termica o un bagno caldo (60 gradi centigradi), riscaldare delicatamente la soluzione. Quando è riscaldata, eseguire l'acqua fredda attraverso l'esterno del pallone per riportarla a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 26 l (0,15 mmol) di OT alla soluzione di metanolo e agitarlo per mescolare i ligandi.</li>
	<li>Pesare 500 mg (13 mmol) di boroidride di sodio (NaBH4) e aggiungerlo a 100 mL di etanolo nella fiaschetta rotonda da 250 mL. Mescolare vigorosamente con agitazione magnetica (600 - 800 giri/min). (Il NaBH4 prende da 10 a 20 min, a seconda del grado, per formare una soluzione chiara in etanolo.)</li>
</ol>3. Sintesi di Nanoparticelle d'Oro
<ol><li>Sciogliere il sale dorato in 100 mL di etanolo nel pallone rotondo-fondo da 500 mL e iniziare a mescolare a 800 giri al secondo con una barra magnetica su una piastra di agitazione. Assicurarsi che il sale d'oro si dissolva completamente.</li>
	<li>Posizionare un imbuto di aggiunta da 100 mL sopra il pallone rotondo. Metti un imbuto nella parte superiore dell'imbuto di addizione con un filtro carta quantitativo all'interno. Quando il NaBH4 viene disciolto in etanolo, iniziare a filtrare la soluzione nell'imbuto di addizione attraverso la carta filtrante nell'imbuto.</li>
	<li>Aggiungere la soluzione di ligando alla miscela di reazione. Attendere 15 min per la formazione di complesso d'oro-thiolate. Il cambiamento di colore della miscela di reazione dal giallo traslucido al giallo torbido indica la formazione di un complesso di thiolate d'oro.</li>
	<li>Iniziare ad aggiungere la soluzione NaBH4 filtrata dall'imbuto di addizione dropwise. Regolare l'intervallo di tempo delle gocce in modo che l'aggiunta di NaBH4 richiede circa 1 h.</li>
	<li>Dopo l'aggiunta completa di NaBH4, rimuovere l'imbuto. Continuare a mescolare la reazione per un'altra ora. Alla fine della reazione, rimuovere la barra di agitazione magnetica utilizzando un magnete posto all'esterno del pallone.</li>
	<li>Utilizzare un setto per chiudere il pallone e forare un ago nel setto per rilasciare il gas H2 che si evolverà dopo la reazione.</li>
	<li>Conservare la miscela di reazione all'interno di un frigorifero di laboratorio (4 gradi centigradi) per far precipitare le nanoparticelle durante la notte.</li>
</ol>4. Funzionamento della Sintesi
<ol><li>Decant l'etanolo supernatante per ridurre il volume.</li>
	<li>Trasferire il precipitazione rimanente a 50 mL di centrifugare tubi e centrifugare per 3 min a 4.000 x g.</li>
	<li>Decant il supernatante, disperdere le nanoparticelle di nuovo con etanolo vortice, e centrifugarli di nuovo. Ripetere questo processo di lavaggio 4x.</li>
	<li>Asciugare le nanoparticelle sotto vuoto per rimuovere l'etanolo residuo.</li>
	<li>Per pulire le nanoparticelle da ligandi/molecole idrofili liberi, sciogliere i precipitati in 15 mL di acqua DI e trasferirli ai tubi centrifugi con una membrana filtrazione di 30 kDa taglio peso molecolare. Anche la dialisi è disponibile per questa procedura.</li>
	<li>Centrifugare questi tubi per 5 min a 4.000 x g per concentrare la soluzione nanoparticella.</li>
	<li>Aggiungere 15 mL di acqua DI a questa soluzione e centrifugare per concentrarsi di nuovo. Ripetere questo processo di pulizia almeno 10x. NOTA: Un'indicazione che le impurità solubili in acqua sono state rimosse è l'assenza di schiuma quando si agitano i rifiuti acquosi; dopo tutto, la maggior parte delle impurità sono disulfide di MUS con se stesso o con OT (questo può essere determinato raccogliendo il materiale ed eseguendo 1H NMR).</li>
	<li>Dopo la centrifugazione, trasferire le nanoparticelle concentrate in un tubo di centrifuga di 15 mL. Per trasformare le nanoparticelle in una polvere gestibile, o precipitarle in un solvente come l'acetone o congelare la soluzione acquosa rimanente. Quando liofilizzate, le nanoparticelle tendono a formare una polvere sciolta che si attacca alle superfici e può essere difficile da manipolare.</li>
</ol>5. Caratterizzazione delle Nanoparticelle
<ol><li>
purezza
	<ol>
<li>Per verificare se le nanoparticelle sono libere da leganti non legati, sciogliere 5 mg di nanoparticelle secche in 600 - L di D2O ed eseguire una misurazione NMR 1HH delle particelle. Se non ci sono picchi taglienti dei ligandi, significa che le nanoparticelle sono prive di piccole molecole organiche.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rapporto ligando
	<ol>
<li>Preparare una soluzione di 20 mg/mL di metanolo-d4 di iodio. Aggiungete 600 l di questa soluzione ai 5 mg di nanoparticelle in una fiala di vetro, per incidere le nanoparticelle.</li>
		<li>Avvolgere il tappo della fiala con pellicola di paraffina e sonicarlo in un bagno ad ultrasuoni per 20 min. Trasferire la soluzione a un tubo NMR e acquisire uno spettro 1H NMR (400 MHz) con 32 scansioni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Densità di ligando
	<ol>
<li>Trasferire da 2 a 8 mg di nanoparticelle in un crogiolo TGA. Scegli un intervallo di temperatura compreso tra 30 e 900 gradi centigradi e una velocità di 5 gradi al minuto sotto il gas N 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Distribuzione delle dimensioni
	<ol>
<li>
Tem
		<ol>
<li>Preparare la soluzione di nanoparticelle da 0,1 mg/mL in acqua DI. Eliminare 5 l l della soluzione preparata sulla griglia di rame a 400 maglie di rame in carbonio. Aspetta che si asciughi.</li>
			<li>Trasferire la griglia in un supporto TEM e inserirla nel microscopio. Acquisire 5 - 10 immagini con un ingrandimento di almeno 64.000X, operato a 200 kV. NOTA: per aumentare il contrasto, è possibile inserire un'apertura obiettiva di 20 nm.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Spettri UV-Vis
		<ol>
<li>Preparare una soluzione di nanoparticelle da 0,2 mg/mL in acqua DI.</li>
			<li>Inserire la quantità necessaria di questa soluzione nella cuvette di quarzo e eseguire la scansione da 200 nm a 700 nm.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Huang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+surface+compositional+and+structural+heterogeneity+on+nanoparticle-protein+interactions%3A+Different+protein+configurations%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Effects of surface compositional and structural heterogeneity on nanoparticle-protein interactions: Different protein configurations.</a> ACS Nano. 8 (6), 5402-5412 (2014).</li>
<li>Van Lehn, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+energy+change+for+insertion+of+charged%2C+monolayer-protected+nanoparticles+into+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Free energy change for insertion of charged, monolayer-protected nanoparticles into lipid bilayers.</a> Soft Matter. 10 (4), 648-658 (2014).</li>
<li>Ong, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Ligand+Shell+for+Mixed-Ligand+Coated+Gold+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Accounts+of+Chemical+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of Ligand Shell for Mixed-Ligand Coated Gold Nanoparticles.</a> Accounts of Chemical Research. 50 (8), 1911-1919 (2017).</li>
<li>Marbella, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+techniques+for+noble+metal+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+of+Materials%22%5BJournal%5D)">NMR techniques for noble metal nanoparticles.</a> Chemistry of Materials. 27 (8), 2721-2739 (2015).</li>
<li>Templeton, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactivity+of+Monolayer-Protected+Gold+Cluster+Molecules+Steric+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Reactivity of Monolayer-Protected Gold Cluster Molecules Steric Effects.</a> Journal of American Chemical Society. 120 (8), 1906-1911 (1998).</li>
<li>Harkness, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+mass+spectrometry+strategy+for+the+relative+quantitation+of+ligands+on+mixed+monolayer-protected+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A structural mass spectrometry strategy for the relative quantitation of ligands on mixed monolayer-protected gold nanoparticles.</a> Analytical Chemistry. 82 (22), 9268-9274 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo descrive prima la sintesi del ligando MUS e, quindi, la sintesi e la caratterizzazione delle nanoparticelle d'oro dell'anfihiphilico MUS:OT. La sintesi del MUS con un contenuto di sale minimo consente una migliore affidabilità del rapporto stoichiometrico tra i ligandi durante la sintesi delle nanoparticelle, che è un fattore chiave per la sintesi riproducibile delle nanoparticelle MUS:OT con un bersaglio idrofobico contenuto (Figura 8). L'uso del metanolo come solvente com...

Il guscio di ligando di nanoparticelle d'oro può essere progettato per esibire diverse proprietà che possono essere applicate per affrontare le sfide in biomedicina1,2,3,4. Tale versatilità consente il controllo delle interazioni intermolecolari tra nanoparticelle e biomolecole5,6,7. L'idrofobicità e la carica svolgono un ruolo decisivo, così come altri parametri di superficie che influenzano il modo in cui le nanoparticelle interagiscono con le biomolecole5,8,9. Per ottimizzare le proprietà superficiali delle nanoparticelle, la scelta delle molecole tiolate che compongono il guscio del ligando offre una miriade di possibilità, secondo le caratteristiche ricercate. Ad esempio, una miscela di molecole di ligandocon gruppi finali idrofobici e idrofili (ad esempio, caricata) viene spesso utilizzata per generare nanoparticelle anfifili 10,11.
Un esempio prominente di questo tipo di nanoparticelle è protetto da una miscela di nanoparticelle OT e MUS (qui chiamata NANOparticelle MUS:OT) che ha dimostrato di possedere molte proprietà rilevanti12,13,14. In primo luogo, con una composizione di guscio di ligando del 66% MUS (in seguito 66:34 MUS:OT), la stabilità colloidale delle nanoparticelle è elevata, raggiungendo fino al 33% di peso nell'acqua deionizzata, così come nella salina tampone fosfata (1x, 4 mM fosfato, 150 mM NaCl)15. Inoltre, queste particelle non precipitano a valori di pH relativamente bassi: ad esempio, a pH 2.3 e con concentrazioni di sale di 1 M NaCl15, queste nanoparticelle rimangono colloidalmente stabili per mesi. Il rapporto stoichiometrico tra le due molecole sul guscio del ligando è importante perché detta la stabilità colloidale nelle soluzioni con un'elevata resistenza ionica16.
Queste particelle hanno dimostrato di attraversare la membrana cellulare senza porating esso, attraverso un percorso indipendente dall'energia1,12. La fusione spontanea tra queste particelle e bistrati lipidici è alla base della loro diffusività attraverso le membrane cellulari17. Il meccanismo alla base di questa interazione è la minimizzazione del contatto tra una superficie idrofobica accessibile dal solvente e molecole d'acqua dopo la fusione con bistrati lipidi18 . Rispetto alle nanoparticelle all-MUS (nanoparticelle che hanno solo il ligando MUS sul guscio), la maggiore idrofobicità sulle nanoparticelle miste MUS:OT (ad esempio, a una composizione MUS:OT 66:34) aumenta l'intervallo del diametro del nucleo che può fondersi con i lipidi bistrati18. Diverse organizzazioni di auto-assemblaggio del guscio di ligando sono correlate a modalità di legame distinte di nanoparticelle 66:34 MUS:OT con varie proteine, come albumina e ubiquitina, rispetto alle particelle all-MUS19. Recentemente, è stato riferito che le nanoparticelle 66:34 MUS:OT possono essere utilizzate come un agente antivirale ad ampio spettro che distrugge irreversibilmente i virus a causa di attacchi elettrostatici multivalenti di leganti MUS e accoppiamenti non locali di leganti OT al capside proteine14. In tutti questi casi, è stato scoperto che il contenuto idrofobico, così come la dimensione del nucleo delle nanoparticelle, determina come avvengono queste interazioni bio-nano. Queste diverse proprietà delle nanoparticelle MUS:OT hanno spinto molti studi di simulazione al computer che miravano a chiarire i meccanismi alla base delle interazioni tra particelle MUS:OT e varie strutture biologiche come i bistrati lipidici20.
La preparazione delle nanoparticelle Au protette da MUS:OT pone alcune sfide. In primo luogo, il ligando caricato (MUS) e il ligando idrofobico (OT) sono immiscibili. Pertanto, la solubilità delle nanoparticelle e dei ligandi deve essere presa in considerazione in tutta la sintesi, così come durante la caratterizzazione. Inoltre, la purezza delle molecole di ligando MUS, in particolare il contenuto di sali inorganici nel materiale di partenza, influenza la qualità, la riproducibilità, nonché la stabilità colloidale a breve e lungo termine delle nanoparticelle.
Qui, una sintesi dettagliata e la caratterizzazione di questa classe di nanoparticelle d'oro anfihiphilico protette da una miscela di MUS e OT sono delineate. Un protocollo per la sintesi del ligando MUS caricato negativamente è segnalato per garantire la purezza e, quindi, la riproducibilità di diverse sintesi di nanoparticelle. Quindi, la procedura per generare queste nanoparticelle, sulla base di una sintesi comune di una fase, seguita da una purificazione approfondita, è riportata in dettaglio. Varie tecniche di caratterizzazione necessarie21, come TEM, UV-Vis, TGA e NMR, sono state combinate per ottenere tutti i parametri necessari per qualsiasi ulteriore esperimento biologico.

<table><tbody><tr><td>11-bromo-1-undecene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>467642-25 ml</td><td></td></tr><tr><td>Solfito di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0505-250 g</td><td></td></tr><tr><td>Bromuro di benziltrietil-ammonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>147125-25 g</td><td></td></tr><tr><td>Metanolo</td><td>VWR</td><td>BDH1135-2,5 LP</td><td></td></tr><tr><td>DI acqua</td><td>Millipore</td><td>ZRXQ003WW</td><td>Acqua deionizzata</td></tr><tr><td>1 L rotondo pallone inferiore</td><td>DURAN</td><td>24 170 56</td><td></td></tr><tr><td>Etere etilico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1.00930 EMD Millipore</td><td></td></tr><tr><td>Barra di agitazione</td><td>Sigma</td><td>Aldrich Z329207,Dow</td><td></td></tr> <tr><td>Corning Grasso per alto vuoto</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z273554 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Pallone filtrante</td><td>DURAN</td><td>20 201 63</td><td></td></tr><tr><td>Imbuto filtrante</td><td>Buchner FisherSci</td><td></td><td></td>11707335</tr><tr><td>Etanolo >99,8%, ACS, Reagente</td><td>VWR</td><td>2081.321DP</td><td></td></tr><tr><td>Biossido di deuterio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>151882 ALDRICH</td> Acido tiocetico <td></td></tr><tr><td>96%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T30805 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Nero di carbonio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05105-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Celite</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D3877 SIGMA-ALDRICH</td><td>Mezzo di filtrazione</td></tr><tr><td>Condensatore</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z531154</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico, reagente ACS 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331 SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio, BioXtra, pellet (anidro)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045 SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga</td><td>VWR</td><td>525-0155P</td><td></td></tr><tr><td>250 mL pallone a fondo tondo</td><td>DURAN</td><td>24 170 37</td><td></td></tr><tr><td>500 mL pallone a fondo tondo</td><td>DURAN</td><td>24 170 46</td><td></td></tr><tr><td>Acido nitrico, reagente fACS 70%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>438073 SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro d'oro(III) triidrato >99,9% base di metalli in tracce</td><td>Sigma Aldrich</td><td>520918 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>1-ottanetiolo >98,5%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>471836 ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Boroidruro di sodio purum p.a.>96%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71320 Funnel addizionale ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td></td><td>SIgma Aldrich</td><td>Z330655 SIGMA</td><td></td></tr><tr><td>Funnel</td><td>DURAN</td><td>21 351 46</td><td></td></tr><tr><td>2V carte filtranti piegate Whatman</td><td></td><td>1202-150</td><td></td></tr><tr><td>Filtri Amicon</td><td>Merck</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Iodio, reagente ACS, >99,8%, solido</td><td>Sigma Aldrich</td><td>207772 SIGMA-ALDRICH</td><td></td></tr><tr><td>Tubi NMR da 5 mm, tipo 5HP (alta precisione)</td><td>Armar</td><td>32210.503</td><td>Lunghezza 178 mm</td></tr><tr><td>Metanolo-d4 99,8 atomi%D</td><td>Armar</td><td>16400.2035</td><td></td></tr><tr><td>Crogiolo TGA</td><td>Thepro</td><td>9095-9270.45</td><td></td></tr><tr><td>Griglia in rame supportata da carbonio da 400 mesh</td><td>Microscopia elettronica Science</td><td>CF400-Cu</td><td></td></tr><tr><td>cuvetta al quarzo</td><td>Hellma Analytics</td><td>100-1-40</td><td></td></tr></tbody></table>

sintesi e caratterizzazione delle nanoparticelle d'oro dell'anfifile

Synthesis and Characterization of Amphiphilic Gold Nanoparticles

Le nanoparticelle d'oro ricoperte da una miscela di 1-ottanethiol (OT) e 11-mercapto-1-undecane sulfonic acid (MUS) sono state ampiamente studiate a causa delle loro interazioni con le membrane cellulari, i bistrati lipidici e i virus. I ligandi idrofili rendono queste particelle colloidalmente stabili in soluzioni acquose e la combinazione con ligando idrofobico crea una particella anfofica che può essere caricata con farmaci idrofobici, si fonde con le membrane lipidiche e resiste non specifica adsorbire le proteine. Molte di queste proprietà dipendono dalle dimensioni delle nanoparticelle e dalla composizione del guscio del ligando. È quindi fondamentale avere un metodo sintetico riproducibile e tecniche di caratterizzazione affidabili che consentano la determinazione delle proprietà delle nanoparticelle e la composizione della conchiglia. Qui, viene presentata una riduzione chimica di una fase, seguita da una purificazione approfondita per sintetizzare queste nanoparticelle con diametri inferiori a 5 nm. Il rapporto tra i due ligandi sulla superficie della nanoparticella può essere sintonizzato attraverso il loro rapporto stoichiometrico utilizzato durante la sintesi. Dimostriamo come varie tecniche di routine, come la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), la risonanza magnetica nucleare (NMR), l'analisi termogravimetrica (TGA) e la spettrometria ultravioletta-visibile (UV-Vis), sono combinate in modo completo caratterizzano i parametri fisici delle nanoparticelle.

I passaggi di reazione per sintetizzare MUS sono mostrati figura 1. Gli spettri NMR 1H del prodotto di ogni passo sono rappresentati nella Figura 2. Il flusso di lavoro di sintesi delle nanoparticelle binarie in oro MUS:OT anfifiancico è descritto nella Figura 3. Dopo la sintesi, l'esotto delle nanoparticelle consisteva nel lavare le particelle più volte con etanolo e acqua DI. Prima di qu...

Le nanoparticelle d'oro anfifilico possono essere utilizzate in molte applicazioni biologiche. Viene presentato un protocollo per sintetizzare nanoparticelle d'oro rivestite da una miscela binaria di ligandi e una caratterizzazione dettagliata di queste particelle.

Sintesi e caratterizzazione delle nanoparticelle d'oro dell'anfifile

Gold nanoparticles covered with a mixture of 1-octanethiol (OT) and 11-mercapto-1-undecane sulfonic acid (MUS) have been extensively studied because of ...

Questo protocollo affronta la riproducibilità batch-to-batch delle nanoparticelle d'oro sulfonate e anfifile che il nostro laboratorio utilizza negli esperimenti con cellule, virus e proteine. Questa tecnica affronta i contaminanti inorganici comuni a questo tipo di sintesi. Introduce anche controlli ed equilibri dopo ogni fase per garantire la riproducibilità delle nanoparticelle d'oro anfifiliche.Questa tecnica è laboriosa e richiede pazienza. Il livello di difficoltà dipende dalla scala, quindi inizia su piccola scala e familiarizza con ogni strumento e passo prima di scalare. In primo luogo, aggiungere 11-bromo-1-undecene, solfito di sodio e bromuro di benziltrietilammonio a 200 millilitri di metanolo e 450 millilitri di acqua deionizzata, in un pallone di fondo rotondo da un litro.Reflusso della miscela di reazione a 102 gradi Celsius per 48 ore fino a quando la soluzione diventa incolore. Dopo il lavoro, sospendere la polvere bianca isolata in 400 millilitri di metanolo in un pallone inferiore rotondo. Utilizzando un pallone filtrante e un filtro borosilicato, filtrare la soluzione per rimuovere i sottoprodotti inorganici insolubili al metanolo.Successivamente, sciogliere circa 30 grammi di sodio undec-10-enesulfonato in 500 millilitri di metanolo, in un pallone inferiore rotondo da un litro. Aggiungere 2,6 volte l'eccesso di acido tioacetico alla soluzione e mescolarlo davanti a una lampada UV da 250 watt durante la notte. Una volta completata la reazione, evaporare completamente il metanolo.Asciugare la polvere sotto vuoto, quindi disperderla nell'etere dietile. Filtrare la miscela e lavare il prodotto solido con etere dietile per rimuovere l'acido tioacetico in eccesso fino a quando non compaiono più sostanze colorate nel supernatante dell'etere dietile. Dopo aver asciugato il solido sotto alto vuoto, sciogliere in metanolo, producendo una soluzione da gialla a arancione.Successivamente, aggiungere tre grammi di nero fumo alla soluzione e mescolare vigorosamente. Quindi, filtrare la miscela attraverso Celite, coprendo 2/3 di una carta filtrante scanalata. Per sintetizzare MUS, combinare circa 400 millilitri di un acido cloridrico molare e 35 grammi di sodio 11-acetiltio-undecanesulfonato in un pallone dal fondo rotondo da un litro.Reflusso la miscela a 102 gradi Celsius per 12 ore per scindere il gruppo tioacetato e ottenere un tiolo. Il giorno seguente, trasferire il prodotto in un pallone inferiore rotondo da due litri. Per mantenere acida la soluzione e prevenire la cristallizzazione di sali inorganici, aggiungere 200 millilitri di un idrossido di sodio molare e 400 millilitri di acqua deionizzata al pallone per dare un volume finale di un litro.Conservare la soluzione chiara a quattro gradi Celsius durante la notte per cristallizzare il prodotto come solidi fini viscosi quando bagnati. Il giorno seguente, decantare il chiaro supernatante. Quindi, trasferire il prodotto in tubi di centrifuga da 50 millilitri e centrifugare per cinque minuti a 4000 volte g.Dopo la centrifugazione, decantare il supernatante in un altro pallone inferiore rotondo. Trasferire i pellet bianchi in tubi di centrifuga e asciugare sotto vuoto elevato per ottenere MUS solubile in metanolo in una resa di circa il 30%. Pesare 177,2 milligrammi di cloruro d'oro(III)triidrato in una piccola fiala di vetro.In seguito, sciogliere 87 milligrammi di MUS in 10 millilitri di metanolo, in una fiala di vetro da 20 millilitri. Sonicare la soluzione in un bagno ad ultrasuoni fino a quando non è visibile alcun materiale solido, per garantire la completa dissoluzione. Aggiungere 26 microlitri di 1-ottanetiolo alla soluzione di metanolo e agitarlo per mescolare i ligandi.Aggiungere 500 milligrammi di boroidro di sodio a 100 millilitri di etanolo in un pallone inferiore rotondo da 250 millilitri. Mescolare vigorosamente fino a quando la soluzione non è chiara. Sciogliere il sale d'oro in 100 millilitri di etanolo in un pallone inferiore rotondo da 500 millilitri e mescolare a 800 giri/min fino a quando il sale d'oro non si dissolve completamente.Quindi, aggiungere la soluzione di ligando alla miscela di reazione. Attendere 15 minuti per la formazione del complesso oro-tiolato, che è indicato da un cambio di colore dal giallo traslucido al giallo torbido. Aggiungere la soluzione di boroidro di sodio precedentemente preparata per quanto riguarda la goccia alla miscela di reazione, utilizzando un imbuto separatore.Regolare il tempo di intervallo delle gocce in modo che l'aggiunta di boroidro di sodio richiede circa un'ora. Una volta completata l'aggiunta di boroidro di sodio, rimuovere l'imbuto di addizione e lasciare mescolare la miscela di reazione per un'altra ora. Quindi, rimuovere la barra di agitazione magnetica utilizzando un magnete posizionato all'esterno del pallone inferiore rotondo.Conservare la miscela di reazione a quattro gradi Celsius durante la notte per far precipitare le nanoparticelle. Dopo aver decantato l'etanolo supernatante, trasferire il precipitante rimanente a tubi di centrifuga da 50 millilitri e centrifugare per tre minuti a 4000 volte g. Dopo la centrifugazione, decantare il supernatante.Disperdere di nuovo le nanoparticelle con l'etanolo con il vortice. Quindi, centrifuga di nuovo i campioni. Asciugare le nanoparticelle sotto vuoto per rimuovere l'etanolo residuo.Per pulire le nanoparticelle dai ligandi idrofili liberi, sciogliere i precipitati in 15 millilitri di acqua deionizzata e trasferire le soluzioni a tubi di centrifuga con membrane di filtrazione di 30 kilodalton tagliano il peso molecolare. Concentrare le soluzioni di nanoparticelle mediante centrifugazione per cinque minuti a 4000 volte g. Dopo la centrifugazione, aggiungere 15 millilitri di acqua deionizzata e centrifugare per concentrarsi di nuovo.Per trasformare le nanoparticelle in una polvere gestibile, congelare la soluzione acquosa rimanente. Per caratterizzare le nanoparticelle per rapporto ligando, preparare una soluzione di iodio da 150 milligrammi per millilitro metanolo-d4. Aggiungere 600 microlitri della soluzione a circa cinque milligrammi di nanoparticelle in una fiala di vetro per incidere le nanoparticelle.Avvolgere il cappuccio della fiala con pellicola di paraffina e sonicarlo in un bagno ad ultrasuoni per 20 minuti. Quindi, trasferire la soluzione su un tubo NMR e acquisire uno spettro NMR protonico con 32 scansioni. La sintesi MUS è mostrata qui.Qui sono rappresentati gli spettri NMR protoni del prodotto di ogni passo. Il flusso di lavoro di sintesi delle nanoparticelle d'oro anfifile mus ottanetiolo binarie è descritto qui. Prima della caratterizzazione, la pulizia delle nanoparticelle dai ligandi liberi non vincolati era monitorata dal protone NMR.La distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle è stata caratterizzata da TEM, che mostra che il diametro medio è di 2,4 nanometri che puntano a circa 18,08 nanometri quadrati di superficie e 7,23 nanometri a cubetti di volume per particella. Il plasma superficiale localizzato e l'assorbimento della risonanza sono stati misurati acquisendo spettri UV-vis. Qui sono mostrati spettri nmr protoni rappresentativi con assegnazioni di picco e integrazione per determinare il rapporto ligando nelle nanoparticelle incise allo iodio.Lo spettro NMR delle nanoparticelle ha mostrato che il rapporto tra MUS e ottanetiolo è da 85 a 15. La copertura superficiale delle nanoparticelle è stata esaminata dalla TGA. Sulla base dei dati TGA, la densità del ligando può essere stimata in 4,8 ligandi per nanometro al quadrato.Qui vengono confrontati i rapporti stechiometrici rispetto ai rapporti NMR di ottanetiolo risultanti da varie sintesi. Le cose più importanti da ricordare in questa procedura sono, da un lato, la rimozione delle impurità inorganiche durante la preparazione dei ligandi MUS e, dall'altro, il lavoro delle nanoparticelle. Questa procedura è suscettibile a varie combinazioni di ligandi, ma assicurati di caratterizzare sempre ogni lotto individualmente.Una domanda a cui questa procedura può rispondere, ad esempio, è in che misura il rapporto ligando corrisponde alla stechiometria trovata sulla superficie delle nanoparticelle. Aumentare la produzione del ligando e dimostrare la riproducibilità lotto per lotto delle nanoparticelle, ci ha permesso di affrontare importanti questioni legate alla biologia e alla medicina. Per esempio, abbiamo stabilito le proprietà virucide di queste nanoparticelle.Si prega di lavorare con attenzione quando si utilizza la lampada UV e indossare sempre guanti protettivi quando si maneggia azoto liquido. Seguire sempre le regole di sicurezza chimica.

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