Name: Funzione del recettore nicotinico dellacetilcolina in fettine di cervello del Mouse tramite Laser fotolisi di nicotina fuse di sondaggio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Scopri la funzione dei recettori nicotinici dell'acetilcolina in fettine di cervello di topo usando la fotolisi laser di nicotina fotoattivabile. Questo metodo combina microscopia confocale e patch clamp per studiare la neurobiologia colinergica.

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Gli autori ringraziano i membri di laboratorio dei seguenti ricercatori principali nord-occidentale: Ryan Drenan, D. James Surmeier, Yevgenia Kozorovitskiy e Anis appaltatore. Quest'opera era supportata da il noi National Institutes of Health (NIH) (sovvenzioni DA035942 e DA040626 a R.M.D.), PhRMA Foundation (fellowship per M.C.A) e HHMI.

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<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presynaptic+Excitation+via+GABAB+Receptors+in+Habenula+Cholinergic+Neurons+Regulates+Fear+Memory+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Presynaptic Excitation via GABAB Receptors in Habenula Cholinergic Neurons Regulates Fear Memory Expression.</a> Cell. 166 (3), 716-728 (2016).</li>
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<li>Kolisnyk, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChAT-ChR2-EYFP+mice+have+enhanced+motor+endurance+but+show+deficits+in+attention+and+several+additional+cognitive+domains%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">ChAT-ChR2-EYFP mice have enhanced motor endurance but show deficits in attention and several additional cognitive domains.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (25), 10427-10438 (2013).</li>
<li>Nagy, P. M., Aubert, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+of+the+vesicular+acetylcholine+transporter+enhances+dendritic+complexity+of+adult-born+hippocampal+neurons+and+improves+acquisition+of+spatial+memory+during+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Overexpression of the vesicular acetylcholine transporter enhances dendritic complexity of adult-born hippocampal neurons and improves acquisition of spatial memory during aging.</a> Neurobiology of Aging. 36 (5), 1881-1889 (2015).</li>
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<li>Filevich, O., Salierno, M., Etchenique, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+caged+nicotine+with+nanosecond+range+kinetics+and+visible+light+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Inorganic+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A caged nicotine with nanosecond range kinetics and visible light sensitivity.</a> Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (12), 1248-1251 (2010).</li>
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</ol>

D.L.W. funge da consulente pagato per Bruker Nano microscopia di fluorescenza.

La scelta del metodo di applicazione/consegna PA-Nic è il punto più critico in questa tecnica di foto-stimolazione localizzata. I due metodi, applicazione vasca e perfusione locale, ciascuno offrono diversi vantaggi e limitazioni. La scelta è in gran parte influenzata dal livello di espressione funzionale di nAChR nel tipo di cella di interesse. Spesso è preferibile utilizzare bagno applicazione quando i livelli di espressione funzionale sono alti, come vasca applicazione permette una concentrazione uniforme sonda che circonda la cella registrata, facilitando l'interpretazione dei dati. Applicazione di vasca elimina anche la necessità di una seconda pipetta di aspersione nel tessuto, rendendo l'intero processo più facile. Tuttavia, applicazione vasca dei costosi composti costi ulteriori per esperimento.
Risoluzione dei problemi coinvolge comunemente, cercando di capire perché nessuna attivazione dei nAChR è visto fotolisi seguente. Quando si lavora con un tipo di cellula che precedentemente non è stato studiato con PA-Nic, l'investigatore deve eseguire puff-applicazione locale di ACh o nicotina per determinare se sufficienti recettori sono funzionalmente espresso5. Per convalidare che il sistema è in grado di rilevare le risposte fotolisi, esperimenti di controllo dovrebbe essere fatto in neuroni habenula mediale che esprimono grandi quantità di recettori30. In questa zona del cervello, PA-Nic vasca applicazione è possibile, che è preferibile per esperimenti di convalida. Solo dopo aver eseguito questi esperimenti di convalida dovrebbe uno spostare un tipo di cella. Se il sistema sperimentale è stato convalidato e le risposte rimangono molto piccoli o non rilevabili, esso può essere giustificata per aumentare la concentrazione di PA-Nic, aumentare l'intensità del flash o la durata dell'impulso, aggiungere un modulatore allosterico positivo di nAChR ad usufruire dei nAChR attività6, o una combinazione di questi.
Occasionalmente, uncaging risposte sono troppo grandi, con attivazione dei nAChR significativo conseguente indiretto tensione gated Na+ canale attivazione e sbloccaggio correnti interne a causa di morsetto povero spazio. Questi manufatti, che completamente oscurano correnti interne dei nAChR e rendono impossibile la interpretazione dei dati, possono essere eliminati con l'inclusione di QX-314 (2 mM) nella pipetta di registrazione. Essi possono anche essere eliminati riducendo la concentrazione di PA-Nic o riducendo l'intensità del flash o la durata dell'impulso. In tutti gli esperimenti di foto-stimolazione luminosa visibile, si deve prestare attenzione quando si seleziona siti di stimolazione per evitare indesiderate stimolazione/fotolisi sopra o sotto il piano focale desiderato. Inoltre e quando applicabile, la potenza del laser deve essere titolata sempre per riprodurre risposte fisiologiche. È particolarmente importante essere consapevoli di fotostimolazione asse z quando si lavora con ligandi in gabbia, come ligandi che vengono attivate sopra/sotto la macchia focale possono ancora diffusa e interagire con il sistema biologico (cioè recettori, ) in fase di studio.
PA-Nic laser fotolisi potrebbe non essere appropriato per tutti gli investigatori, come esistono diverse limitazioni. Il primo è il costo relativamente elevato di un allestimento adatto. Quando si lavora con le fette di cervello intatto, uncaging vicino a strutture di piccolo diametro come dendriti richiede un sistema di visualizzazione sofisticata come un microscopio 2-fotone. A parte il costo elevato di una ti, tunable laser pulsato IR per microscopia 2-fotone performante, un sistema dual-galvanometro capace di indipendentemente due fasci laser di posizionamento ulteriormente aumenta il costo del sistema. Costo totale del sistema può essere ridotto utilizzando un sistema casa costruita se il ricercatore ha sufficiente competenza e tempo per costruire, risolvere i problemi e mantenere un tale sistema. Una seconda limitazione spesso comporta dei nAChR bassa espressione funzionale, che può essere parzialmente mitigato adottando misure come accennato in precedenza, ma questo non può garantire il successo. In genere, se uno non può misurare correnti ligando-attivati seguendo puff-applicazione di agonisti, PA-Nic fotolisi sotto morsetto di tensione non può produrre risultati accettabili. Un terzo limite comporta l'intrinseca fluorescenza del PA-NIC PA-Nic assorbe la luce di ~ 405 nm ed emette in una gamma simile come proteina fluorescente verde (GFP) o Alexa 4885. Quando le concentrazioni di PA-Nic superano ~ 1 mM, questa proprietà di fluorescenza può rendere difficile da visualizzare contemporaneamente strutture neuronali. Per ovviare a questo inconveniente, è fondamentale essere in grado di controllare facilmente il flusso di PA-Nic dalla pipetta aspersione. Periodicamente, il flusso di PA-Nic è stata interrotta per consentire molecole fluorescenti diffondere la distanza. Questo permesso di re-imaging del neurone per controllare la posizione spot del fascio uncaging. Una limitazione potenziale quarta parlare implica l'uso di 405 nm luce per fotolisi. Lunghezze d'onda più corta come 405 nm sono più inclini a dispersione nel complesso tessuto come una fetta di cervello. Così, a una determinata intensità del flash e durata, uncaging risposta ampiezze e cinetica di decadimento possono differenzialmente risentire la profondità del fuoco uncaging all'interno della slice. Conclusioni sugli aspetti biologici di nAChR dovrebbero tener conto questo avvertimento importante.
Questa tecnica di fotolisi localizzata laser è stata utilizzata recentemente per scoprire nuovi dettagli sulla neurobiologia dei nAChR. Ad esempio, esposizione cronica alla nicotina migliora la perisomatic e la funzione dei nAChR dendritiche in habenula mediale neuroni5. È stato utilizzato anche per aiutare a dimostrare, per la prima volta, che area tegmentale ventrale del glutammato neuroni esprimono recettori nicotinici funzionale nel loro perisomatic e compartimenti cellulari dendritiche6. Ci sono che molti potenziali futuri usi di questa tecnica, e l'approccio potrebbe essere applicato ad altri tipi di neurone chiave che sono noti per i nAChR espresso, quali neuroni piramidali corticali31 o interneuroni in corteccia cerebrale32, striato33 e ippocampo19. Questa tecnica potrebbe anche essere combinata con gene farmacologia e/o dei nAChR34 per localizzare i sottotipi recettoriali specifici per diversi compartimenti neuronali di editing. L'approccio può essere facilmente adattato ad altri composti di cumarina-messo in gabbia, tra cui, ma non limitati a, quelle sviluppate in parallelo con PA-Nic5. Infine, PA-Nic fotolisi un giorno potrebbe essere utilizzato in un animale sveglio/comportarsi per studiare l'azione di nicotina in paradigmi di romanzo farmacologia comportamentale.

Segnalazione colinergici modula numerosi processi cerebrali, tra cui controllo attentivo, movimento volitivo e ricompensa1,2. Farmaci che migliorano la trasmissione dell'acetilcolina (ACh) sono usati per trattare deficit cognitivo associato a malattia di Alzheimer, che implica un ruolo importante per i sistemi colinergici nella cognizione3. Una migliore comprensione dei recettori colinergici e circuiti negli stati sani e malati potrebbe portare a migliori approcci terapeutici per varie malattie neurologiche.
Recettori nicotinici di ACh (nAChR) sono una famiglia di canali ionici ligando che flusso di cationi in risposta a ACh endogeno o esogena nicotina da prodotti del tabacco. Dato il fatto che essi erano tra i recettori del neurotrasmettitore molto primi di essere descritto4, farmacologia dei nAChR e posizione nelle fibre muscolari è ben capito per recettori di tipo muscolare. Al contrario, comparativamente piccolo è conosciuto circa la farmacologia e la distribuzione subcellulare di nativo recettori nicotinici nel cervello. Questa lacuna nella conoscenza è stato recentemente affrontata attraverso lo sviluppo di una sonda chimica romanzo che permette per spazialmente limitato e rapida attivazione di recettori nicotinici nel tessuto cerebrale durante imaging cellulare e registrazioni elettrofisiologiche5. Qui, sono descritti i passaggi metodologici chiave coinvolti in questo approccio, con l'obiettivo generale di rafforzare la capacità di collegare dei nAChR funzione con struttura di un neurone.
Fuse nicotina (PA-Nic; nome chimico: 1-[7-[bis(carboxymethyl)-ammino] cumarina-4-yl] metile-nicotina) possono essere photolyzed con ~ 405 nm laser lampeggia per rilasciare in modo efficiente nicotina5,6. Prima del uncaging, PA-Nic è stabile in soluzione ed esibisce senza spiacevoli caratteristiche farmacologiche o fotochimica5. Dopo fotolisi, nicotina rilasciata prevedibilmente attiva i nAChR e i sottoprodotti uncaging sono farmacologicamente inerte5. Un laser continuo-fluttuano è utilizzato come la sorgente luminosa di fotolisi con potenza > 1 mW misurata al campione. Quando localizzate, foto-stimolazione mirata è combinata con la capacità di individuare le membrane cellulari con laser 2-fotone microscopia (2PLSM), e i due vantaggi chiavi di questo approccio sono pienamente realizzati: fotolisi velocità e precisione spaziale.
In molti aspetti, la fotolisi di PA-Nic sono superiore ad altri metodi di consegna dei nAChR ligandi per recettori all'interno di fette del cervello. Tali approcci includono vasca applicazione7 e droga locale consegna tramite una pipetta di palla8. Considerando che il primo approccio tende a enfatizzare eccessivamente gli effetti a lungo termine del farmaco applicato, quest'ultimo approccio può soffrire di variabilità nella cinetica di risposta tra prove e attraverso le cellule. Nessuno di questi approcci alternativi in grado di distinguere adeguatamente attività del ricevitore in luoghi diversi cellulari dal neurone stesso. Optogenetically-attiva il rilascio di ACh è stato utilizzato per le indagini di nAChR nativi9,10,11, ma non si è dimostrato utile per percorsi di mapping subcellulare dei nAChR. Inoltre, la maggior parte degli studi che utilizzano questo approccio hanno contato su un topo di transgenico artificiali batterici del cromosoma ChR2-esprimendo con trasmissione colinergica anormale12,13,14, 15 , 16 , 17.
PA-Nic fotolisi non sono l'approccio solo ottica di studio dei recettori colinergici. Una gabbia carbachol era utilizzato per il mapping funzionale attività di recettore ACh in cellule coltivate18 e cervello fette19, ma non era disponibile in commercio per studi comparativi durante lo sviluppo del PA-nic. Un bis di rutenio (bipyridine)-nicotina complessa (RuBi-nicotina) è stata segnalata per consentire nicotina uncaging20, ma le preparazioni commerciali di RuBi-nicotina si è rivelata inferiore a PA-Nic in un confronto testa a testa studiano5. Può essere utile ripetere tali esperimenti comparativi con non-commerciale, altamente purificato RuBi-nicotina, come suo assorbimento visibile potrebbe complimento caratteristiche di PA-Nic per studi colinergici. Infine, i nAChR sono anche stati otticamente manipolati utilizzando una combinazione di foto-commutabile ligandi e recettori geneticamente21. Questo approccio è complementare alla PA-Nic fotolisi in tessuto cerebrale, con il requisito di capacità di targeting genetici per i nAChR modificate visto come sia un vantaggio e uno svantaggio.
Diversi requisiti chiavi di questo approccio dovrebbero essere notati. In primo luogo, un metodo di visualizzazione appropriato è necessario per individuare con precisione la membrana di un neurone. Imaging con microscopia convenzionale epi-fluorescenza può essere sufficiente quando studiare cellule coltivate, ma per la registrazione da neuroni in fettine di cervello o altre preparazioni di tessuto spesso, 2PLSM o la microscopia confocale è un requisito. In secondo luogo, è necessario un metodo adatto per posizionare il raggio laser fotolisi. Questo approccio utilizza una testa di scansione dual-galvanometro con due specchi indipendente x-y per raster scansione del fascio imaging e punto fotoattivazione utilizzando il uncaging laser fascio22,23,24. Altri, più limitati soluzioni sono possibili, come (1) una testa di scansione single-galvanometro che in alternativa raster analizza il fascio di imaging e il fascio uncaging o (2) semplicemente dirigere il fascio uncaging al centro del campo di vista tale che la cella è portata a Questa posizione per fotolisi. In terzo luogo, occorre un sistema per la registrazione simultanea di elettrofisiologici se si vuole raccogliere segnali fisiologici durante gli esperimenti. I suddetti requisiti possono essere soddisfatte con una tecnica di imaging ottico adatta, come recentemente descritto5. Di seguito è incluso un protocollo dettagliato che descrive i passaggi chiave di questo approccio.

<table><tbody><tr><td>Strumenti, materiali di consumo e prodotti chimici vari</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multiclamp 700B</td><td>Molecular Devices Corp.</td><td></td><td>Amplificatore a pinza patch</td></tr><tr><td>Pneumatico Picopump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV820</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per micropipette</td><td>Sutter Instrument Co</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura</td><td>Warner Instruments</td><td>TC-324C</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo a lama vibrante</td><td>Leica Biosystems</td><td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td> <td>centrifugo Ultrafree-MCMilliporeSigma</td><td>UFC30GV0S</td><td>filtro soluzione interna</td></tr><tr><td>Capillari in vetro borosilicato</td> World <td>Precision Instruments</td><td>1B150F-4</td><td>patch e applicazione locale pipetta</td></tr><tr><td>(-)-Nicotina sale di tartrato di idrogeno</td><td>Glentham</td><td>GL9693</td><td>sale di nicotina</td></tr><tr><td>7-carbossimetilammino-4-metil cumarina</td><td>Janelia Research Campus</td><td></td><td>PA-Nic sottoprodotto</td></tr><tr><td>1-[7-[bis(carbossimetil)- ammino]cumarina-4-il]metil-nicotina</td><td>Janelia Research Campus</td><td></td><td>PA-Nic</td></tr><tr><td>Euthasol (Pentobarbital sodico e fenitoina sodica)</td><td>Virbac</td><td>ANADA #200-071</td><td></td></tr><tr><td>Alexa FluorTM 488 Hydrazide</td><td>ThermoFisher</td><td>A10436</td><td>colorante di riempimento verde</td></tr><tr><td>Alexa FluorTM 568 Hydrazide</td><td>ThermoFisher</td><td>A10437</td><td>colorante di riempimento rosso</td></tr><tr><td>6- carbossi-AF594 (Alexa Fluor 594)</td><td>Janelia Research Campus</td><td></td><td>colorante di riempimento rosso</td></tr><tr><td>QX 314 cloruro</td><td>Tocris</td><td>2313</td><td>bloccante dei canali del sodio voltaggio-dipendente</td></tr><tr><td>Misuratore di potenza&nbsp;</td><td>ThorLabs</td><td>S120C</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Chemicals for Solutions</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-Methyl-D-glucamine</td><td>Sigma</td><td>M2004</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di potassio</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico monoidrato</td><td>Sigma</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucosio</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>(+)-Sodio L-ascorbato</td><td>Sigma</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>Tiourea</td><td>Sigma</td><td>T8656</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato di sodio</td><td>Sigma</td><td>P2256</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di magnesio eptaidrato</td><td>Sigma</td><td>230391</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio diidrato</td><td>Sigma</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td></td></tr><tr><td>Glicole etilenico-bis(2-amminoetiletere)-N,N,N&prime;,N&prime; -acido tetraacetico</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Adenosina 5&prime;-trifosfato sale di magnesio</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Guanosina 5&prime;-trifosfato sale sodico idrato</td><td>Sigma</td><td>G8877<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Name</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Componenti del microscopio a 2 fotoni</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Scanner laser Ultima per microscopio Olympus BX51</td><td>Bruker Nano, Inc.</td><td></td><td>Software di imaging e galvos</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Galvanometri X-Y per imaging</td><td>Cambridge Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Mai Tai HP1040</td><td>Spectra-Physics</td><td></td><td>Laser IR sintonizzabile</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Pockels cella M350-80-02-BK con M302RM Driver</td><td>Conoptics, Inc.</td><td></td><td>per l'attenuazione del laser IR</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Sensore di potenza con fotodiodo a sfera integrato</td><td>Thorlabs, Inc</td><td></td><td>fotodiodo di prelievo di potenza laser</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Galvanometri X-Y Uncaging</td><td>Cambridge Technology</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Lancio laser a 2 linee Helios</td><td>Bruker Nano, Inc.</td><td></td><td>Sganciamento dei componenti del laser</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; OBIS LX/LS 405 nm (100 mW)</td><td>Coherent, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; OBIS LX/LS 473 nm (75 mW)</td><td>Coherent, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Punto-fotoattivazione / modulo di ingresso in fibra per sidecar limousine - Uncaging</td><td>Bruker Nano, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Microscopio verticale</td><td>&nbsp; Olympus</td><td>BX51WIF</td><td>Telaio per microscopio verticale</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Obiettivo: Olympus M Plan FL 10x; NA 0,3 WD 11 mm</td><td>&nbsp; Obiettivo Olympus</td><td></td><td>10x</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Obiettivo: Olympus M Plan Fluorite 60x/1.0 WD=2mm NIR</td><td>&nbsp; Obiettivo per immersione in acqua Olympus</td><td></td><td>60x</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; X-Cite 110, sorgente luminosa a epifluorescenza accoppiata LLG a quattro LED</td><td>Sorgente luminosa a LED</td> <td>Excelitas Technologies</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Filtro a epifluorescenza: ET-GFP (FITC/CY2) per Epi-Turret</td><td>Chroma Technologies Filtro</td><td></td><td>LED per l'eccitazione della luce blu</td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Filtro a epifluorescenza: ET-DsRed (TRITC/CY3) per Epi-Turret</td><td>Chroma Technologies Filtro</td><td></td><td>LED per l'eccitazione della luce verde</td></tr><tr><td>. &nbsp; &nbsp; B& Telecamera CCD W; Watec, 0,5 pollici B/N CCD</td><td>Watec Co., LTD.</td><td></td><td>Fotocamera CCD per la registrazione del morsetto patch</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Rivelatori esterni - Doppia emissione riflessa - Olympus Upright (Multi-Alkali, GaAsP)</td><td>Bruker Nano, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Multi-alcali side-on PMT</td><td>Hamamatsu</td><td>R3896</td><td>canale rosso PMT</td></tr><tr><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Filtro di emissione a canale rosso 595/50m</td><td>Chroma Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 565lpxr</td><td>Chroma Technologies</td><td></td><td>dicroico dicroico divisore</td></tr><tr><td> &nbsp; &nbsp; GaAsP end-on PMT</td><td>Hamamatsu</td><td>7422PA-40</td><td>canale verde PMT</td></tr><tr><td> &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Filtro emissioni canale verde 525/70m</td><td>Chroma Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Otturatore ad alta velocità per Hamamatsu H7422 PMT</td><td>Vincent Associates / Bruker</td><td>517329</td><td>PMT supporto per otturatore</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Dodt Modulo di rilevamento della trasmissione del contrasto sfumato</td><td>Bruker Nano, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; Multi-alcali side-on PMT</td><td>Hamamatsu</td><td>R3896</td><td>Dodt PMT</td></tr></tbody></table>

funzione del recettore nicotinico dell'acetilcolina in fettine di cervello del mouse tramite laser fotolisi di nicotina fuse di sondaggio

Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine

Acetilcolina (ACh) atti tramite i ricevitori per modulare una varietà di processi neuronali, ma esso è stato impegnativo per collegare la funzione del recettore ACh con subcellulare posizione all'interno delle cellule dove questa funzione è svolta. Per studiare la posizione subcellulare dei recettori nicotinici ACh (nAChR) in tessuto cerebrale nativo, un metodo ottico è stato sviluppato per uscita precisa di nicotina a luoghi discreti vicino a membrane di un neurone durante registrazioni elettrofisiologiche. Patch-premuta di neuroni nel cervello fette sono pieni di tingono di visualizzare la loro morfologia durante la microscopia a scansione laser 2-fotone e nicotina uncaging viene eseguito con un lampo di luce puntando un raggio laser di nanometro 405 vicino a uno o più membrane cellulari. Cellulare attuale deviazioni sono misurati, e immagine in alta risoluzione tridimensionale (3D) del neurone registrato è fatto per permettere la riconciliazione delle risposte dei nAChR con morfologia cellulare. Questo metodo permette l'analisi dettagliata della distribuzione funzionale dei nAChR nelle preparazioni di tessuto complesso, promettente per migliorare la comprensione della neurotrasmissione colinergica.

Per fotolisi stimolazione, la dose di esposizione (intensità e tempo), posizione di esposizione e geometria della trave sono variabili chiave. Il sistema descritto in questo articolo è capace di due fasci diversi fotostimolazione, regolabile tramite lo spostamento di una lente in e out della fotostimolazione luce percorso prima il fascio entra nel sistema di galvanometro. Senza questo obiettivo, il fascio di fotostimolazione riempie la pupilla di entrata della x 60 / 1,0 NA acqua-immersione [60 x WD] obiettivo, producendo una vicino-diffrazione limitata, sub-µm posto al piano focale all'interno del campione. Questo è associato con fotostimolazione luce con una forma a clessidra, che si estende sopra e sotto la macchia focale simmetrica con l'asse ottico. Con la lente inserita nel percorso, luce laser fotostimolazione è focalizzata nella pupilla di entrata della lente dell'obiettivo e poi esce come un fascio di matita-come. Questa trave, che dovrebbe essere di circa 10 µm di diametro per un obiettivo 60 x, si estende uniformemente/verticalmente in tutto il campione. In questa modalità, l'intensità della luce in qualsiasi luogo all'interno lo spot di stimolazione sarà ~ 1% dell'intensità spot piccolo vicino-diffrazione limitata. Quindi, potenze laser superiori sono in genere richiesti quando si utilizza ~ 10 µm stimolazione punto. Per tutti gli esperimenti riportati in questo articolo, è stato usato un fascio di fotostimolazione clessidra-tipo.
La potenza di campione trasportato può essere tracciata contro l'impostazione di tensione in ingresso, dopo aver misurato la potenza del laser al campione utilizzando un misuratore di potenza. Questi studi utilizzano un 60 x diametro obiettivo WD con una distanza di 2 mm, ma non è sommerso in acqua per misure di potenza evitare potenziali danni all'elemento rivelatore. Quando gli obiettivi con elencati NA &gt; 0.95 sono misurati in aria (senza liquido di immersione), possono esserci perdite di riflessione interna totale presso l'elemento frontale dell'obiettivo a causa dell'indice inferiore (aria). In questo caso, per una più accurata misura di potenza di campione (per correggere le perdite di riflessione interna totale), aumentare la potenza misurata da 1,0 NA oggettivi (1.0/0,95)2 misurata nell'aria. Figura 1a Mostra un tipico grafico di ingresso/uscita per 405 nm e laser visibile di 473 nm che sono incorporati nel laser lanciare il sistema in questo studio. Questi sistemi laser sono ideali per controllo di dose di esposizione foto-stimolazione per i seguenti motivi: (1) sono pre-tarati per fornire output di potenza direttamente lineare alla tensione in ingresso (0-5 V), (2) sono dotate di un'operazione di scatto silenzioso (con nessun laser in uscita), e (3) hanno rapida, controllo di sub-ms intensità impulso durata (risposta di 0,1 ms). Quando si utilizza foto-stimolazione punto con un sistema laser/galvo, calibrazione di routine di MarkPoints spot è un compito essenziale. Figura 1b (pannello di sinistra) di seguito viene illustrato un sistema che è fuori taratura (punto desiderato per stimolare la foto non provocare accurata stimolazione di quel punto, come indicato dalla posizione del burn-foro), con un ritorno a un posizionamento accurato dello spot dopo la calibrazione ( Figura 1b, pannello di destra). 
PA-Nic è modestamente fluorescente (picco di emissione a ~ 510 nm), che esibiscono efficace eccitazione tra 350-450 nm (1-fotone eccitazione) o 700-900 nm (2-fotone eccitazione)5. Per visualizzare PA-Nic durante l'applicazione locale, PA-Nic (1 mM) è stato applicato nei pressi di tessuto cerebrale, seguito da formazione immagine simultanea del contesto di trasmissione ottica sezionato del tessuto (1) cervello via Dodt contrasto e (2) la fluorescenza emessa dall'eccitazione (900 nm) di PA PA-Nic-Nic 2PE fluorescenza era facilmente rilevabile durante l'espulsione di pressione da una pipetta di applicazione locale (Figura 2a). Nicotina e un monoalkylcoumarin, 7-carboxymethylamino-4-metil cumarina, sono i principali prodotti fotochimici del PA-Nic fotolisi reazione5. Utilizzando le stesse impostazioni/parametri che sono stati utilizzati per PA-Nic imaging di imaging, il tessuto era imaged durante la consegna di nicotina (1 mM) o 7-carboxymethylamino-4-metil cumarina (1 mM). È stato rilevato alcun segnale fluorescente (Figura 2a, pannelli di medio e Bassi), dimostrando la specificità dei risultati PA-Nic. Infine, PA-Nic è stato applicato all'interno del tessuto cerebrale e l'emissione di fluorescenza PA-Nic era imaged (Figura 2b). Questo approccio conferma che PA-Nic è presente all'interno di 100-200 µm della pipetta applicazione locale. Insieme, questi dati confermano che la PA-Nic efficacemente sia consegnato al cervello del tessuto tramite applicazione locale.
Registrazioni di elettrofisiologia con simultanea 2PLSM per la visualizzazione di strutture cellulari richiede al ricercatore di considerazioni di equilibrio per entrambe le componenti dell'esperimento, e spesso è disponibile per una finestra di tempo stretto (~ 20 min) valido acquisizione di dati di esempio da una cella con patch. Senza considerare la visualizzazione cellulare, è consigliabile iniziare la registrazione appena possibile dopo il rodaggio perché registrazione stabilità tende a diminuire con il tempo. Tuttavia, quando la formazione immagine è un requisito, elettrofisiologici considerazioni devono consentire tempo sufficiente per l'aumento di concentrazione di fluorescenza in strutture di piccole/remoto. Questo è esemplificato esaminando una concentrazione di tintura riempimento curva28, che a volte è utile per derivare quando un nuovo tipo di cella di imaging. La figura 3 Mostra diversi neuroni esempio imaged come Z-stack tramite 2PLSM e crollato in una proiezione di massima intensità per scopi di presentazione. Figura 3a Mostra le immagini di alta qualità dove morfologia neuronale sembra essere completo, è ridotto al minimo rumore e detriti non interferiscano con l'interpretazione della morfologia cellulare. Figura 3b Mostra le immagini di qualità inferiore, a causa di un rapporto di segnale--fondo inferiore e detriti sostanziali. Questo detriti compare spesso come tasche sferiche della fluorescenza intensa, derivanti da espulsione di imaging colorante dalla pipetta patch mentre si avvicina la cella. In particolare, l'inclusione di 100 µM PA-Nic nel bagno (durante l'esecuzione dell'applicazione bagno) tende a ridurre il rapporto segnale--fondo e conduce al contrasto dell'immagine ottimale. Alexa Fluor 568 o 594 è spesso molto utile negli esperimenti di applicazione locale come un colorante finder o come un segnale di riferimento/normalizzazione 2PE normalizzante. Un'efficace lunghezza d'onda per l'eccitazione del due-fotone di questi coloranti è ~ 780 nm27, che consente la visualizzazione simultanea dei PA-Nic e identificazione dei compartimenti cellulari. Questa lunghezza d'onda, tuttavia, non completamente evitare fotolisi del due-fotone di PA-Nic5. Alexa Fluor 488 è vantaggioso negli esperimenti di bagno-applicazione del PA-Nic; Quando sono eccitati con un nm di lunghezza d'onda adatta ≥900, fotolisi del due-fotone di PA-Nic5 possono essere evitato mantenendo comunque adatto visualizzazione dei compartimenti cellulari.
La figura 4 Mostra i dati di esempio per localizzata PA-Nic laser fotolisi a neuroni MHb nelle fette del cervello. Figura 4a (pannelli superiori) viene illustrato un esempio di un'immagine di "riferimento", che è un bloccaggio di schermo dell'ultima immagine 2PLSM preso prima il protocollo MarkPoints è stato eseguito, sovrapposti con la posizione del punto di foto-stimolazione. Figura 4a (pannelli di immagine in basso) Mostra una vista ingrandita della foto-stimolazione spot sovrapposta la morfologia cellulare. La risposta elettrofisiologica correlati nel tempo corrispondente a PA-Nic fotolisi è mostrata nei pannelli inferiori di Figura 4a. Lavoro precedente ha dimostrato che queste correnti sono sensibili a nAChR antagonisti5. Figura 4b Mostra dati rappresentativi da diverse cellule dove singolo spot fotolisi è stata eseguita ad intervalli di 1 s o 10 s. considerando che un intervallo di 10 s consentito sufficiente tempo di recupero per la linea di base corrente di tenuta, un intervallo più breve 1 s ha condotto ad un aumento graduale nell'azienda corrente come il protocollo procedeva. L'aumento attuale suggerisce che la nicotina non aveva abbastanza tempo per diffondersi lontano dal sistema con l' intervallo di 1 Hz29. Tale risposta temporale di analisi devono essere eseguita de novo su qualsiasi nuovo tipo di cella in fase di studio, come la Neurofarmacologia di nAChR può differire tra tipi cellulari.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig1.jpg"> Figura 1: Calibrazione laser fotostimolazione. (una) foto-stimolazione laser potenza di uscita. Potenza piano di campione (attraverso un x 60 / 1.0 obiettivo di immersione in acqua di NA) è stato misurato per 405 nm e 473 nm foto-stimolazione laser presso l'impostazione di output indicato. (b) Calibrazione laser foto-stimolazione. Schermo cattura immagini mostrano la relazione spaziale tra il luogo di destinazione foto-stimolazione e la corrispondente posizione dove foto-stimolazione si è verificato (burn-hole) prima (a sinistra) e dopo (a destra) in esecuzione calibrazione in MarkPoints. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig2.jpg"> Figura 2: PA-Nic locale applicazione. (a) rilevazione del PA-Nic da un locale applicazione pipetta. 1 mM PA-Nic, sottoprodotto di fotolisi o nicotina sono stati disciolti in ACSF, caricati in una pipetta di applicazione locale ed erogata sul tessuto cerebrale durante 2PLSM (eccitazione 900 nm) imaging utilizzando le stesse impostazioni di formazione immagine per ogni farmaco. Scansione immagine Dodt contrasto trasmissione laser Mostra il tessuto/pipetta mentre un catodo GaAsP PMT è stato usato per catturare l'emissione di fluorescenza. (b), PA-Nic (1 mM) è stato irrorato nel tessuto cerebrale ed imaged tramite 2PLSM come (un) per mostrare la diffusione laterale di PA-Nic usando la fluorescenza intrinseca. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig3.jpg"> Figura 3: acquisizione di immagini di microscopia a scansione laser di 2 fotoni. (un) ottimale 2PLSM Z-stack. Due esempi di proiezioni di intensità massima dello stack Z 2PLSM sono mostrato per i neuroni di MHb con dendriti ben risolti e poco o nessun detriti d'interferenza. (b) sub-ottimale 2PLSM Z-stack. Due esempi di proiezioni di intensità massima dello stack Z 2PLSM sono indicati per i neuroni di MHb circondati da detriti (tintura espulso dalla pipetta durante l'approccio delle cellule). Tali immagini sono più difficili da interpretare rispetto alle immagini come quelli mostrati in (un). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58873/58873fig4.jpg"> Figura 4: Laser fotolisi di PA-NIC (un) MarkPoints riferimento immagini e correnti interne evocate da PA-Nic fotolisi. Per un neurone di MHb, immagini raw riferimento sono indicati per le prove di foto-stimolazione MarkPoints in un'unica sede cellulare (indicata). Si noti che per alcune località di foto-stimolazione (l'immagine più a destra in questa serie), la struttura dendritica è a fuoco ma il soma e dendrite prossimale non sono. Sotto ogni immagine di riferimento, viene tracciata la corrente entrante nicotina uncaging-evocati. (b) Inter-stimolo intervalli per fotolisi PA-Nic. Registrazioni di esemplare sono indicate per MHb neuroni dove nicotina era ripetutamente uncaged nella stessa posizione di perisomatic con un intervallo di Inter-stimolo di 1 s o 10 s. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58873/58873fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Questo articolo presenta un metodo per lo studio dei recettori nicotinici per l'acetilcolina (nAChR) nelle fette del cervello del mouse di nicotina uncaging. Quando accoppiato con simultanea patch clamp registrazione e microscopia a scansione laser di 2 fotoni, nicotina uncaging collega la funzione del recettore nicotinico con morfologia cellulare, fornendo una più profonda comprensione della neurobiologia colinergico.

Funzione del recettore nicotinico dell'acetilcolina in fettine di cervello del Mouse tramite Laser fotolisi di nicotina fuse di sondaggio

Acetylcholine (ACh) acts through receptors to modulate a variety of neuronal processes, but it has been challenging to link ACh receptor function with ...

Questa tecnica sfrutta la microscopia a scansione laser multi-fotone in combinazione con la fotolisi laser-flash di una molecola di nicotina fotoattivabile. Consentire l'attivazione precisa dei recettori colinergici nicotinici. Questa tecnica consente un controllo spatiotemporale fine sull'applicazione agonista del recettore nicotinico, fornendo un potente strumento per lo studio dei modelli di espressione funzionale del recettore e della trasmissione sinaptica o volumecolinergica.Prima di iniziare la procedura, utilizzare un estrattore di pipetta programmabile per tirare una micropipetta di vetro con un diametro di apertura da 20 a 40 micrometri. Filtrare circa un millilitro di soluzione di registrazione attraverso un filtro da 0,22 micron. E resospendare abbastanza nicotina fotoattivabile lyophilizzata nella soluzione di registrazione filtrata per produrre una concentrazione finale di due millimolari.Riempire la micropipetta di applicazione locale tirata con 50 microlitri del farmaco fotoattivabile e fissare la pipetta in un supporto per pipette montato su un micromanipolatore. Collegare il supporto della pipetta tramite un'adeguata lunghezza del tubo a un sistema di espulsione della pressione in grado di applicazione sostenuta a bassa pressione. E utilizzare il micromanipolatore per manovrare la pipetta di applicazione locale nella soluzione di registrazione extracellulare.Posizionare la punta della pipetta leggermente sopra un campione di tessuto cerebrale del topo, a circa 50 micrometri dalla cellula di interesse. E applicare brevemente da uno a due libbre per pollice quadrato di pressione alla pipetta. Ci dovrebbe essere minimo o nessun spostamento della cellula di interesse.Dopo aver ottenuto un morsetto stabile per patch a celle intere, accendere l'applicazione bassa sul dispositivo di espulsione della pressione e saturare il tessuto che circonda la cellula con nicotina fotoattivabile per uno o due minuti. L'applicazione locale introduce ulteriore complessità all'esperimento. Ma risparmia il composto e consente di utilizzare concentrazioni più elevate di PA-Nic.Per l'applicazione a bagno della nicotina fotoattivabile, sciogliere prima abbastanza del farmaco liofilizzato in un volume di soluzione di registrazione appropriato per il ricircolo continuo a una concentrazione finale di 100 micromolari. E caricare la miscela risultante in un sistema di perfusione. Quindi iniziare il ricircolo della soluzione di nicotina fotoattivabile a una velocità da 1,5 a 2 millimetri al minuto, utilizzando tubi con un diametro interno minimo e una lunghezza complessiva per ridurre al minimo il volume di ricircolo richiesto.Durante il ricircolo, bollare continuamente la soluzione con carbogeno e mantenere la temperatura del bagno a 32 gradi Celsius in condizioni di scarsa illuminazione. L'applicazione del bagno beneficia della semplicità e dell'uniformità della permeazione PA-Nic del tessuto. Ma utilizza necessariamente concentrazioni di PA-Nic micromolare più basse e spende quantità totali più elevate di composto.Per la visualizzazione dal vivo di un neurone di habenula mediale, utilizzare ottiche a contrasto di interferenza differenziale della luce trasmessa o infrarossa e una videocamera per stabilire una registrazione stabile del morsetto patch a celle intere. Dopo aver stabilito la configurazione collegata alle celle ad alta resistenza, ma prima dell'e-in, passare dalla configurazione e dal software alla modalità di scansione laser. Dopo l'es-in, utilizzare la scansione laser per verificare che il colorante di imaging di interesse riempia passivamente il neurone per diffusione.Lasciare che il colorante riempia i compartimenti cellulari per almeno 20-30 minuti prima di utilizzare la funzione di scansione dal vivo per visualizzare il neurone e il compartimento subcellulare di interesse. Selezionare i parametri di imaging che consentono una visualizzazione dal vivo accurata delle caratteristiche neuronali, manipolando le impostazioni appropriate per influenzare o modificare la visualizzazione dello schermo, la risoluzione, il rapporto segnale-rumore e il tempo di acquisizione del fotogramma dell'immagine, se necessario. Per migliorare il contrasto del segnale, aprire la finestra della tabella di ricerca e regolare le impostazioni del pavimento e del soffitto del tavolo di ricerca.Per individuare un'area di interesse all'interno del tessuto, selezionare lo zoom ottico 1X e utilizzare i controlli di panoramica. Utilizzare lo strumento Serie Z per selezionare una posizione iniziale e di arresto contenente la cella di interesse. Impostare una dimensione del passaggio di un micrometro e selezionare una dimensione dell'immagine che produca un'immagine con la risoluzione più alta.Spesso 1.024 per 1.024 pixel per linea. Quindi immagini consecutivamente il neurone in ogni piano Z che contiene la cellula. Per calibrare la stimolazione laser, avviare la scansione del sistema con una potenza laser di imaging superiore al minimo e ottimizzare la messa a fuoco oggettiva sul sottile strato di fluorescenza del marcatore rosso.Selezionare un'area all'interno del campo di fluorescenza libera dai detriti e patinata uniformemente con marcatore e aprire il menu strumenti, calibrazione e allineamento per selezionare la funzione di ricalibrazione galvocalibrazione. Segui il tutorial sui punti di combustione per la calibrazione spaziale della seconda coppia di specchi galvanometrici, selezionando il laser da 405 nanometri, una potenza di stimolazione laser di 400 e una durata di stimolazione di 20 millisecondi. Per produrre fori di diametro da uno a cinque micrometri nel marcatore rosso.Selezionate aggiorna (Update) per stimolare e aggiornare l'immagine dopo la masterizzazione del punto centrale e spostate l'indicatore rosso rotondo nella posizione effettiva del punto centrale, destro e centro inferiore per ottenere una griglia di nove punti. Per testare la calibrazione, aprire la finestra dei punti di contrassegno e attivare manualmente i parametri di stimolazione dei punti definiti in una nuova area del campione, facendo attenzione che il file di calibrazione più recente corretto sia caricato nella finestra dei punti di contrassegno. Quindi applicare un impulso di prova per verificare la calibrazione corretta.Per visualizzare brevemente e individuare l'area subcellulare di interesse, selezionare la scansione dal vivo e utilizzare aumenta lo zoom ottico per visualizzare eventuali piccole strutture in base alle esigenze. Posizionare il mirino a punto singolo del punto di marcatura immediatamente adiacente alla membrana cellulare e impostare i parametri di fotostimolazione su una durata da uno a 50 millisecondi, una potenza laser da uno a quattro milliwatt e almeno una prova. Quindi selezionare i punti di selezione per avviare il protocollo dei punti di riferimento e osservare l'acquisizione dei dati di elettrofisiologia in tempo reale.La fluorescenza fotoattivabile a nicotina 2PE di PA-Nic millimolare viene facilmente rilevata durante l'espulsione di pressione da una pipetta di applicazione locale, come dimostrato. Mentre la consegna dei principali prodotti fotochimici della reazione fotolisi fotoattivabile alla nicotina non genera alcun segnale fluorescente alla stessa concentrazione e potenza di eccitazione e lunghezza d'onda. Dimostrare la specificità dei risultati della nicotina fotoattivabile.L'imaging della nicotina fotoattivabile applicata al tessuto cerebrale come dimostrato rivela la presenza del farmaco entro 100-200 micrometri dalla pipetta di applicazione locale. Confermando che la nicotina fotoattivabile può essere efficacemente consegnata al tessuto cerebrale tramite applicazione locale. Qui, vengono mostrate immagini di alta qualità all'interno delle quali la morfologia neuronale sembra essere completa, il rumore è ridotto al minimo e i detriti non interferiscono con l'interpretazione della morfologia cellulare.Queste immagini, tuttavia, sono di qualità inferiore. A causa di un minore rapporto segnale-sfondo e detriti sostanziali. L'associazione della microscopia a scansione laser a due fotoni dei neuroni dell'habenula mediale nelle fette cerebrali con la fotolisi flash laser di PA-Nic come dimostrato, consente la riconciliazione delle risposte elettrofisiopatiche con la morfologia cellulare.La fotolisi a punto singolo eseguita a intervalli di 10 secondi consente un tempo di recupero sufficiente per la corrente di tenuta di base. Mentre un intervallo di un secondo più breve porta a un graduale aumento della corrente di partecipazione man mano che il protocollo procede. Suggerendo che la nicotina non ha abbastanza tempo per diffondersi lontano dal sistema con gli intervalli più brevi.Nella progettazione di esperimenti che utilizzano molecole fotoattivabili, è importante ricordare di selezionare indicatori fluorescenti e segnalare fluorofori con spettri di emissione di eccitazione compatibili. PA-Nic è compatibile con i fluorofori più comuni grazie al suo picco di fotolisi a lunghezza d'onda corta. Quando si sceglie la tecnica di applicazione PA-Nic più appropriata, è importante considerare attentamente l'espressione funzionale, l'attività fisiologica dei recettori nicotinici nei neuroni di interesse.L'uso qualificato di questa tecnica consente un controllo spatiotemporale fine dell'applicazione della nicotina, che consente nuove entusiasmanti possibilità per studiare la cinetica dell'impegno nativo del recettore nicotinico, la localizzazione subcellulare e la modulazione dell'attività neuronale mediante attivazione del recettore nicotinico.

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Abbiamo sviluppato una nuova tecnica di quantificazione dei recettori nicotinici dell'acetilcolina cambiamenti all'interno delle regioni subcellulari di sottotipi specifici di neuroni del sistema nervoso centrale per comprendere meglio i meccanismi della dipendenza da nicotina utilizzando una combinazione di approcci tra tagging proteina fluorescente del recettore con il knock-in approccio e spettrale confocale.

Spectral Imaging di fluorescenza confocale tag recettori nicotinici a Knock-in topi con la somministrazione cronica alla nicotina

Questo video dimostra come l'attivazione mediata dalla nicotina dei recettori nicotinici dell'acetilcolina nell'ippocampo ventrale del topo si traduca in una segnalazione sostenuta del calcio lungo gli assoni.

Imaging della segnalazione del calcio indotta dalla nicotina lungo gli assoni dell'ippocampo ventrale in co-colture sinaptiche

In questo articolo, si descrive un metodo utile per lo studio ligando funzione di canale ionico in neuroni di fettine di cervello acuto isolato. Questo metodo comporta l'uso di un farmaco-riempita micropipetta per applicazione locale di farmaci per neuroni registrati utilizzando tecniche standard di patch clamp.

Applicazione locale di farmaci allo studio delle funzioni recettore nicotinico in fettine di cervello del mouse

Abbiamo sviluppato una preparazione gene-chimerica del circuito ventrale ippocampale – accumbens in vitro che consente l'imaging diretto dal vivo per analizzare i meccanismi presinaptici della trasmissione sinaptica mediata dai recettori nicotinici dell'acetilcolina (nAChR). Questa preparazione fornisce anche un approccio informativo per studiare i meccanismi pre- e post-sinaptici della plasticità sinaptica.

Immagini dal vivo di nicotina indotta segnalazione Calcio e neurotrasmettitori uscita Lungo ventrali Hippocampal assoni

Qui vi presentiamo un romanzo di Ca 2+ approccio -imaging utilizzando un reporter bioluminescente. Questo approccio viene utilizzato un costrutto fuso GFP-equorina che si lega al Ca 2+ ed emette luce, eliminando la necessità di luce di eccitazione. Significativamente questo metodo permette di imaging lungo continuo, l'accesso alle strutture cerebrali profonde e alta risoluzione temporale.

In Vivo cervello Imaging funzionale approccio basato sul calcio bioluminescente Indicatore GFP-equorina

Questo protocollo descrive l'espressione e la quantificazione delle sottounità dei recettori neuronali dell'acetilcolina nicotinica utilizzando la linea cellulare Neuro-2a dei mammiferi. I tag fluorescenti sensibili al pH e la microscopia confocale permettono una valutazione precisa della localizzazione dei recettori nella membrana plasmatica rispetto a quelli espressi nei compartimenti intracellulari a pH neutro, facilitando lo studio del traffico e della modulazione farmacologica della nAChR.

Localizzazione della membrana plasmatica e dei recettori intracellulari dell'acetilcolina nicotinica tramite imaging quantitativo nelle cellule di mammiferi

Fotolisi di composti in gabbia permette la produzione di un rapido aumento e localizzato della concentrazione di vari composti fisiologicamente attivi. Qui mostriamo come ottenere patch-clamp registrazioni combinate con fotolisi di cAMP in gabbia o in gabbia Ca per lo studio della trasduzione olfattiva in dissociato topo neuroni sensoriali olfattivi.

Fotolisi lampo di composti Caged nel Cilia di neuroni sensoriali olfattivi

In questo protocollo, che aggiorniamo i recenti progressi nel campo dell'imaging...

Calcio Risposte imaging in neuroni GFP-tagged fette di cervello di topo ipotalamici

Qui descriviamo il processo di immunocolorazione dell'intera montatura delle antenne di Drosophila, che ci permette di comprendere meglio i meccanismi molecolari coinvolti nella diversificazione dei neuroni recettori olfattivi (ORN).

Tutta Monte immunomarcatura di recettore olfattivo neuroni nel<em&gt; Drosophila</em&gt; Antenna

Descriviamo una tecnica per etichettare i neuroni ei loro processi tramite iniezioni anterograda o traccianti retrogradi in nuclei cerebrali con una preparazione in vitro. Abbiamo modificato un metodo esistente di i n vitro tracciante elettroporazione sfruttando fluorescente mutanti di topo attrezzatura ottica e di base al fine di aumentare la precisione di etichettatura.

Neuronal Tracing negli espianti cerebrali a guida laser

Scopri la funzione dei recettori nicotinici dell'acetilcolina in fettine di cervello di topo usando la fotolisi laser di nicotina fotoattivabile. Questo metodo combina microscopia confocale e patch clamp per studiare la neurobiologia colinergica.

Funzione del recettore nicotinico dellacetilcolina in fettine di cervello del Mouse tramite Laser fotolisi di nicotina fuse di sondaggio (Video) | JoVE Journal

Funzione del recettore nicotinico dell'acetilcolina in fettine di cervello del Mouse tramite Laser fotolisi di nicotina fuse di sondaggio

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