Name: Autoradiografia come un metodo semplice e potente per la visualizzazione e caratterizzazione di bersagli farmacologici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-03-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Scopri l'autoradiografia per visualizzare siti di legame proteici nei tessuti cerebrali di topo. Questa tecnica offe alta risoluzione spaziale e risultati più rapidi rispetto ai metodi tradizionali per l'analisi farmacologica.

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Il lavoro è stato supportato dalla Fondazione Lundbeck (Grant R133-A12270) e la Fondazione di Novo Nordisk (Grant NNF0C0028664). Gli autori ringraziano il Dr. Aleš Marek per la fornitura di radioligand [3H].

Tutti gli animali gestione è stata eseguita in conformità con le linee guida da The ispettorato danese di sperimentazione animale.
Nota: Il protocollo descritto qui copre (cioè, tessuto di cervello di topo), preparazione di tessuti in vitro autoradiografico dosaggio in modo sufficientemente dettagliato per l'impostazione del metodo in un nuovo laboratorio, l'esposizione al fosforo piastre di imaging come pure successiva analisi densitometrica di autoradiogrammi (Figura 2) con lo scopo di localizzare e quantificare radioligand binding in strutture anatomiche distinte. Per il confronto istologico, un protocollo per la macchiatura di cresyl violet è incluso. Inoltre, la determinazione del legame non specifico con un ligando concorrente è inclusa all'interno del protocollo. Per una descrizione dettagliata su come determinare Kd, Bmax o Kio, vedere precedente pubblicazione4.
1. preparazione di Cryosectioning
<ol><li>Eutanasia il mouse di dislocazione cervicale e scomporre immediatamente fuori il cervello con delle forbici, pinze. Procedere direttamente al passaggio successivo per evitare danni ai tessuti.</li>
	<li>Snap-congelare il tessuto da immersione in ghiaccio secco in polvere, gassosi CO2 o isopentano. Trasferire direttamente il tessuto congelato per un criostato con temperatura impostata a-20 ° C. In alternativa, è possibile memorizzare il tessuto a-80 ° C fino al trattamento. Nota: Evitare lo scongelamento/congelamento ripetuto per ridurre il danno tissutale.</li>
	<li>Lasciare che il tessuto acclimatare a-20 ° C a criostato per 20 min prima del successivo trattamento per evitare la rottura del tessuto.</li>
	<li>Coprire il Portarotolo con mezzo di inclusione di fuori del criostato e posizionare rapidamente il campione di tessuto congelato l'orientamento desiderato, mentre il mezzo di inclusione è ancora liquido. Per esempio, mettere il cervello di topo verticalmente sul cervelletto al fine di ottenere sezioni coronali rostrale. Trasferire il portarotolo del criostato ed esporre il mezzo di inclusione a temperature inferiori a-10 ° C per l'indurimento. Nota: Esemplare Fragile tessuto deve essere spalmati in mezzo all'interno degli stampi di tessuto prima del montaggio di inclusione.</li>
	<li>Posizionare il supporto di tessuto nel microtomo del criostato. Regolare l'orientamento del tessuto per evitare tratti inclinati.</li>
	<li>Tagliare il tessuto con la Guida di un Atlante stereotassiche18 nelle sezioni di spessore desiderato (12 µm consigliato per [3H] etichettati ligandi). Attentamente raddrizzare e aprire la sezione con un pennello di piccole dimensioni, se necessario e disgelo-Monte la sezione su un vetrino da microscopio. Raccogliere in sequenza le sezioni dalla regione di interesse per replica tecnica desiderato (ad esempio, 4 sezioni per ogni diapositiva).</li>
	<li>Consentire le sezioni sui vetrini asciugare all'aria per 1 h prima di ulteriore gestione. Nota: Aggiunta di materiale essiccante per scatole di diapositiva riduce al minimo l'umidità accumulo su sezioni di tessuto. Procotol può essere messo in pausa qui memorizzando sezioni a lungo termine nelle caselle di diapositiva a-80 ° C.</li>
</ol>2. in vitro autoradiografia
Attenzione: radioattività. Lavorare in un laboratorio certificato secondo le normative locali. Indossare indumenti protettivi. Smaltire secondo decadimento radioattivo o in outsourcing ad una società certificata.
<ol><li>Scongelare le sezioni per almeno 30 min a temperatura ambiente (TA). Marcare i vetrini con condizioni sperimentali. Utilizzare una matita perché le diapositive verranno essere inondate di etanolo durante la successiva colorazione.</li>
	<li>Porre i vetrini in posizione orizzontale in vassoi di plastica. Nota: Posizionamento di diapositive su una piattaforma elevata all'interno di vassoi in plastica facilita la loro manipolazione.</li>
	<li>Pre-incubate le sezioni montate su slitte nel tampone adeguato al target in questione (per il protocollo di GHB, tampone 50 mM a pH 6.0 KHPO4 è usato) applicando accuratamente un volume adeguato sulla diapositiva (700 µ l per 3-4 sezioni coronali roditore). Nota: Assicurarsi che ogni sezione è coperto completamente di liquido.<ol>
<li>Coprire i vassoi in plastica con un coperchio per evitare l'evaporazione e pre-Incubare a temperatura rilevanti (per protocollo GHB pre-incubata per 30 min a RT) sotto costante brezza (20 giri) agitazione su un agitatore per piastre.</li>
		<li>Per la determinazione del legame non specifico, supplemento di tampone con concentrazione rilevante di adenoida composto (per protocollo di GHB, 1mm GHB). Nota: Pre-incubazione può non essere necessario.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Versare liquido di pre-incubazione da ogni diapositiva e trasferire le diapositive indietro il vassoio di plastica.</li>
	<li>Per evitare la disidratazione, immediatamente Incubare le sezioni con concentrazione rilevante di radioligand nel tampone sotto condizioni desiderate (per il protocollo GHB, 1 nM [3H] HOCPCA per 1h a RT) coprendo le sezioni completamente con il radioligando soluzione (700 µ l per 3-4 sezioni coronali roditore).<ol>
<li>Incubare sotto sotto agitazione costante brezza (20 giri) di vassoi in plastica con coperchio chiuso. Nota: La concentrazione radioligand può essere convalidata da contando un'aliquota in un contatore a scintillazione liquida.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere la soluzione di incubazione versando il liquido e trasferire i vetrini in un rack di vetrino del microscopio. Procedere immediatamente alla fase successiva per evitare la disidratazione di sezione.</li>
	<li>Lavare i vetrini. Per il protocollo GHB, lavare con tampone ghiacciata due volte per 20 s e poi risciacquare due volte immergendo il portavetrini nei vassoi riempiti con acqua ghiacciata distillata per rimuovere sali. Posizionare i vetrini verticalmente in rack per essiccamento all'aria per almeno 1 h a RT o asciugare i vetrini per 5 min con un soffiatore impostato su temperatura fredda. Nota: Il lavaggio deve essere ottimizzato, ad esempio, vasto lavaggio può essere utile per diminuire il legame non specifico.</li>
	<li>Trasferire i vetrini di un fixator contenenti polvere di paraformaldeide (PFA) per la fissazione durante la notte con vapori PFA a RT al fine di proteggere l'integrità del complesso ligando-target. Attenzione: PFA è tossico. Sene fixator nel cappuccio del vapore ed evitare il contatto con pelle e occhi con PFA.</li>
	<li>Il giorno seguente, trasferire i vetrini in una scatola di un essiccatore contenente gel di silice per 3 h a RT per eliminare l'umidità.</li>
</ol>3. esposizione al fosforo Imaging piastre e scansione
<ol><li>Inserire le sezioni in una schermatura radiazioni imaging Piastra mangianastri con il tessuto rivolto verso l'alto. Per la successiva quantificazione del grippaggio radioligand, includono un Microscala [3H] in ogni cassetta. Organizzare le sezioni in modo casuale ed esporre le sezioni per confronto diretto nella stessa cassetta.</li>
	<li>Cancellare il fosforo di trizio-sensibile imaging piastra immediatamente prima dell'uso, al fine di rimuovere segnali accumulati dal deposito e per eliminare i segnali di sfondo. Pertanto, la piastra di carico in macchina imaging fosforo ed esporlo visibile/infrarosso luce secondo le istruzioni del produttore.</li>
	<li>Rimuovere la piastra dalla macchina imaging fosforo e posizionatelo immediatamente sopra le sezioni nella cassetta. Assicurarsi che la cassetta è chiusa completamente. Esporre le sezioni per la piastra di imaging di fosforo per 3 giorni a temperatura ambiente al riparo da luce.</li>
	<li>Perché luce Cancella segnale dalla piastra di imaging, attentamente aprire la cassetta al buio e immediatamente trasferire la piastra imaging nella casella scura di un imager di fosforo o posizionare il dispositivo di imaging di fosforo in una stanza buia. Nota: Assicurarsi di annotare la disposizione spaziale delle diapositive durante l'esposizione al fine di identificare singoli esemplare sull'immagine digitale dopo l'analisi. Pertanto, imaging piastre al fosforo visualizzano anche un angolo tagliato in un angolo di distinto al fine di individuare il corretto orientamento della piastra sull'immagine digitale.</li>
	<li>Scansione la piastra alla massima risoluzione possibile ottenere un'immagine digitale.</li>
</ol>4. facoltativo: Cresile viola colorazione di sezioni di tessuto
<ol><li>Preparare 1% cresyl violet soluzione miscelando 5 g di cresile viola in 500 mL di acqua deionizzata (dH2O) fino a completa dissoluzione (circa 2 h). Filtrare attraverso un filtro di carta utilizzando un imbuto in una nuova bottiglia di 500 mL. Regolare il pH a 3.5-3.8.</li>
	<li>La colorazione del vetrino e arretrata sotto cappa. Preparare i vassoi con le seguenti soluzioni in vassoi in polipropilene bianchi (ad eccezione di xilene): a. 50% ethanol/50% dH2O b. 70% ethanol/30% dH2O c. 100% etanolo d. 100% etanolo e. 100% dH2O f. viola di cresyl 1% g. 0.07% di acido acetico (aggiungere 175 µ l di acido acetico in 250 mL di dH2O). h. 100% xilene in verde vassoi resistenti ai solventi i. 100% xilene in verde vassoi resistenti ai solventi</li>
	<li>Trasferire i vetrini per la cappa e metterli in un portavetrini.</li>
	<li>Sciogliere i lipidi attraverso la serie graduata crescente di etanolo in dH2O in etanolo al 100% (vassoio a-d) immergendo i vetrini per 1 min.</li>
	<li>Reidratare gli esemplari di dH2O attraverso decrescente concentrazioni di etanolo (vassoio a-d in ordine inverso, seguita dalla vaschetta e) immergendo i vetrini per 1 min.</li>
	<li>Immergere gli esemplari in soluzione di cresile viola per 10 min.</li>
	<li>Sciacquare gli esemplari in 0.07% di acido acetico sollevando le diapositive su e giù dolcemente per 4-8 s. lavare i vetrini mediante immersione in dH2O per 1 min.</li>
	<li>Disidratare gli esemplari per immersione delle diapositive per 30 s in crescente concentrazioni di etanolo (vassoio a-d).</li>
	<li>Trasferire gli esemplari attraverso due vassoi di xilene 100% (vassoio h e i) per placare l'etanolo.</li>
	<li>Reidratare gli esemplari di dH2O attraverso decrescente concentrazioni di etanolo (vassoio a-d in ordine inverso, seguita dalla vaschetta e) immergendo i vetrini per 1 min.</li>
	<li>Rimuovere le diapositive da saline con le pinzette. Aggiungere poche gocce di solvente organico montaggio supporti per ogni diapositiva e un vetrino coprioggetto 24 x 60 mm sulla parte superiore per proteggere gli esemplari. Rimuovere le bolle d'aria tra il campione e il vetrino coprioggetti premendo delicatamente sul vetrino coprioggetti. Nota: Tenere le rimanenti diapositive in xilene durante il montaggio per evitare l'essiccazione.</li>
	<li>A secco le diapositive durante la notte in una cappa a TA.</li>
	<li>Ottenere una foto del campione con un microscopio e 1,25 X obiettivo.</li>
</ol>5. densitometrica analisi di immagine digitale
<ol><li>Misurare la relativa densità ottica (barre) di ogni standard da Microscala [3H] con un software di analisi di immagine di calibrazione.<ol>
<li>Selezionare un'area di dimensioni uguali per ogni punto di Microscala [3H] utilizzando un tool per la creazione della regione dalla voce di menu determinazione regione. Assegnare un numero ad ogni area selezionata cliccando sul numero sotto la voce di menu Label.</li>
		<li>Esportare valori OD per ogni punto standard di calibrazione facendo clic File | E sporta | relazione regione 2D. Trasferire i valori ROD in un foglio di calcolo e normalizzare dalla dimensione dell'area selezionata. Eseguire la regressione lineare per ottenere una curva standard per ulteriore analisi densitometrica. Nota: Assicurarsi che le aree selezionate siano etichettate al fine di identificare i corrispondenti valori ROD e campioni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire la quantificazione di autoradiogrammi utilizzando i propri software di imaging selezionando la regione di interesse (ROI) utilizzando uno strumento di creazione della regione in ogni sezione e misura relativo ODs. Selezionare la regione stessa in ogni sezione creando un modello per la regione di interesse, che viene copiato e regolata manualmente variazioni minori nell'anatomia del cervello per ogni autoradiogram. Identificare l'anatomia del ROI di confronto di autoradiogrammi con un cervello Atlante18. Quando vengono confrontati i trattamenti multipli, eseguire l'analisi in cieco e randomizzato al fine di evitare la selezione parziale di ROIs.</li>
	<li>Esportare valori ROD e delle dimensioni delle aree selezionate in un foglio di calcolo facendo clic File | E sporta | relazione regione 2D.</li>
	<li>Dividere l'asta di misura del ROI selezionato dalla relativa zona per ottenere la densità per l'area specifica.</li>
	<li>Misurare l'asta dello sfondo della piastra ed esportare i valori corrispondenti di ROD e dimensioni dell'area in un foglio di calcolo. Sottrarre il segnale di fondo medio da ogni valore ROD di ogni ROI.</li>
	<li>Media le aste dei replicati tecnici, vale a dire, sezione replica usando il tessuto dall'animale stesso.</li>
	<li>Utilizzare la curva standard per convertire canne in unità di radioligand binding, vale a dire., equivalenti di nCi/mg del tessuto (TE). Nota: Il termine TE viene utilizzato perché gli standard sono generati con materiali che simula il tessuto.</li>
	<li>Rapidi di associazione di conversione di nCi/mg di nmol/mg TE secondo l'attività specifica del radioligand (equazione 1). <img alt="Formula di calcolo del legame del ligando, equazione che descrive nmol/mg TE, rilevante per lo studio biochimico." src="/files/ftp_upload/58879/58879eq1v2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Equation">(1)</li>
	<li>Per ottenere valori di legame specifico, sottrarre il legame non specifico dall'associazione totale.</li>
	<li>Media il legame di ogni replica biologico utilizzando la media del tecnico replica di ogni animale (ottenuto nel passo 5.6).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

La qualità di un'analisi autoradiografica viene determinata dalla sensibilità del radioligand. Un fattore di contributo importante è il radioisotopo selezionato, che è dato dalla disponibilità di ligandi noti o dalla fattibilità di specifiche tecniche di etichettatura per produrre ligandi con appropriata attività specifica (cioè, la quantità di radioattività per mole unità un radioligando)23e con limitate quantità di degradazione chimica. Un gran numero di radioligands di ligandi noti è e...

Autoradiografia è un metodo che fornisce immagini di decadimento radioattivo. La tecnica è usata ordinariamente per studiare la distribuzione tissutale di una proteina di interesse in vitro basato su una specifica interazione farmacologica tra un composto radiomarcato e l'obiettivo. Questo fornisce informazioni dirette circa la selettività del ligando per la destinazione. Autoradiografia in vitro può essere utilizzato anche per la determinazione quantitativa di parametri di associazione farmacologica di radioligands, come la costante di dissociazione (Kd) e densità di siti di legame (Bmax), nonché per la determinazione la costante di inibizione (Ki) delle concorrenti ligandi1,2. Rispetto al tradizionale omogeneato radioligand binding, autoradiografia ha il vantaggio di essere in grado di visualizzare anatomia spaziale e con l'indicazione succinte della espressione regionale modelli3. Il metodo di autoradiografia è quindi un'alternativa pertinente per immunocitochimica, soprattutto in assenza di un anticorpo convalidato. Autoradiografia viene implementata facilmente in un laboratorio del radioisotopo standard dato la disponibilità di un radioligand adatto con la necessaria specificità farmacologica, ad un criostato microtomo per la preparazione di sezioni di tessuto e un imaging adatto dispositivo che è in grado di analizzare la distribuzione della radioattività nelle sezioni rispettive del tessuto. In particolare, un importante criterio di selezione per il radioligando è una quantità limitata di associazione ai siti non-bersaglio. Questo può essere ad altre proteine, membrane o materiali quali plastica o filtri ed è collettivamente come legame non specifico. Solitamente, il legame non specifico è non saturabile ma può essere saturabile se si tratta di una specifica proteina fuori bersaglio. Il modo migliore di convalida vero legame specifico è da confrontare con tessuti manca il bersaglio, per esempio, geneticamente ingegnerizzati (knock-out) del tessuto4.
Qui, la metodologia è illustrata con la caratterizzazione autoradiografica del sito di legame ad alta affinità per l'acido γ-idrossibutirrico (GHB) nel cervello dei mammiferi. Comprendere l'interazione farmacologica tra GHB e il suo sito di legame è di pertinenza come GHB è una droga sia clinicamente utile nel trattamento della narcolessia e alcolismo5, ma anche un costituente naturale del cervello dei mammiferi e un'area di divertimento droga6. Siti di legame ad alta affinità GHB in primo luogo sono stati descritti utilizzando [3H] associazione di GHB a ratto cervello omogeneato7. Nel corso degli anni, ulteriori studi di autoradiografia con [3H] GHB e l'analogo [3H] NCS-382 ha mostrato un'alta densità di siti nelle regioni del forebrain del ratto8,9,10, mouse9 di legame ,11e scimmia/umano cervello12del maiale. Tuttavia, l'identità molecolare ed esatta rilevanza funzionale di questi siti di legame sono rimasti sfuggente.
Con l'intenzione di caratterizzare ulteriormente i siti di legame e per facilitare gli studi sul ruolo fisiologico di GHB, sono state sviluppate più radioligands incorporando isotopi diversi dotati di diverse affinità ([3H] GHB, [3 H] NCS-382, [3H] HOCPCA e [125I] BnOPh-GHB)13,14,15,16(rivisto in17) (Figura 1). La combinazione di selettivo ad alta affinità radioligands e una densità molto elevata del tessuto dell'associazione siti hanno permesso per la produzione di immagini di alta qualità utilizzando il fosforo imaging tecnica9,11. Insieme con un contorno dei punti pratici nella creazione di un esperimento autoradiografico e un'illustrazione per esemplificare i dettagli, la sezione di discussione metterà in risalto i) la scelta di radionuclide, ii) la scelta delle condizioni di dosaggio e iii) l'uso del fosforo Imaging piastre contro pellicola di raggi x. L'obiettivo generale di questa carta è quello di fornire dettagli tecnici, metodologici e scientifici sulla tecnica autoradiografia per informare sulla distribuzione tissutale e analisi farmacologica di bersagli proteici.

<table><tbody><tr><td>Etanolo assoluto</td><td>Merck Millipore</td><td>107017</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>BAS-TR2040 Piastra di imaging</td><td>GE Healthcare Life Science</td><td>28956481</td><td>20x40 cm - Sensibile al trizio</td></tr><tr><td>Cresil violetto acetato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5042-10G</td><td></td></tr><tr><td>DPX (terreno di montaggio non acquoso per microscopia)</td><td>Merck Millipore</td><td>100579</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Compound, 12 x 125 mL</td><td>Sakura</td><td>4583</td><td>Tissue-Tek</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005-1KG-R</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus vetrini</td><td>VWR</td><td>631-9483</td><td>vetrini per microscopio</td></tr><tr><td>Tissue-Tek Set di colorazione manuale dei vetrini</td><td>Sakura Finetek Danimarca ApS</td><td>4451</td><td></td></tr><tr><td>Trizio Standard su vetro</td><td>Chimica radiomarcata americana, Inc.</td><td>ART 0123</td><td></td></tr><tr><td>Sostituto dello xilene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5597</td><td></td></tr></tbody></table>

autoradiografia come un metodo semplice e potente per la visualizzazione e caratterizzazione di bersagli farmacologici

Autoradiography as a Simple and Powerful Method for Visualization and Characterization of Pharmacological Targets

In vitro l'autoradiografia ha lo scopo di visualizzare la distribuzione anatomica di una proteina di interesse nel tessuto da animali da esperimento come pure gli esseri umani. Il metodo si basa sul legame specifico di un radioligand al suo target biologico. Pertanto, le sezioni di tessuto congelato sono incubate con radioligandi soluzione e l'associazione alla destinazione è successivamente localizzata tramite la rilevazione del decadimento radioattivo, ad esempio, utilizzando la pellicola fotosensibile o fosforo piastre di imaging. Autoradiogrammi digitale risultante visualizzare notevole risoluzione spaziale, che consente la quantificazione e la localizzazione di radioligand binding in strutture anatomiche distinte. Inoltre, quantificazione consente la caratterizzazione farmacologica di affinità ligando mediante costanti di dissociazione (Kd), costanti di inibizione (Kio) così come la densità di siti di legame (Bmax) in determinati tessuti. Così, il metodo fornisce informazioni sulla localizzazione di destinazione sia selettività ligando. Qui, la tecnica è esemplificata con autoradiografico caratterizzazione dell'acido ad alta affinità γ-idrossibutirrico (GHB) siti nel tessuto di cervello dei mammiferi, con speciale enfasi su considerazioni metodologiche per quanto riguarda l'analisi obbligatoria di legame parametri, la scelta del radioligand e il metodo di rilevamento.

Utilizzando il protocollo descritto, la distribuzione anatomica di siti di legame ad alta affinità GHB è stata visualizzata con l'analogo GHB radiomarcato [3H] HOCPCA nel cervello di topo, che è stato tagliato in sezioni coronale, sagittali e orizzontale (Figura 3 ). Alti livelli di associazione sono stati osservati nell'ippocampo e nella corteccia, inferiore nel corpo striato e l'associazione non è state rilevate nel cervelletto, corrispondenti ai...

Il metodo di autoradiografia è ordinariamente utilizzato per studiare l'associazione di radioligands per sezioni di tessuto per la determinazione qualitativa o quantitativa farmacologia.

Autoradiografia come un metodo semplice e potente per la visualizzazione e caratterizzazione di bersagli farmacologici

In vitro autoradiography aims to visualize the anatomical distribution of a protein of interest in tissue from experimental animals as well as humans. The ...

L'autoradiografia è una tecnica potente e semplice per studiare la distribuzione di siti di legame proteico nei tessuti utilizzando radioligand specifici per il bersaglio. È anche un'alternativa adatta all'immunoistochimica. Questa tecnica visualizza l'espressione proteica con risoluzione spaziale tramite immagini digitali che è più veloce dell'esposizione tradizionale al film.Può anche essere utilizzato per l'analisi farmacologica di obiettivi proteici. Il metodo prevede tessuti di topo montati su vetro, ma può essere esteso ad altre specie o anche a cellule coltivate su coverlips. A dimostrare la procedura sarà Nane Griem-Krey, dottoranda nel mio laboratorio.Per iniziare, immergere il tessuto nel ghiaccio secco in polvere per scattare congelarlo. Trasferire il tessuto congelato direttamente in un criostato impostato su meno 20 gradi Celsius. Lasciare che il tessuto si acclimati a meno 20 gradi Celsius nel criostato per 20 minuti.Quindi coprire il supporto del tessuto con un mezzo di incorporamento all'esterno del criostato e posizionare rapidamente il campione di tessuto congelato nell'orientamento desiderato mentre il mezzo di incorporamento è ancora liquido. Trasferire il porta tessuto al criostato ed esporre il mezzo di incorporamento a temperature inferiori a meno 10 gradi Celsius per l'indurimento. Posizionare il porta tessuto nel microtomo del criostato.Regolare l'orientamento del tessuto per evitare sezioni inclinate. Tagliare il tessuto con la guida di un atlante stereotassico in sezioni dello spessore desiderato e aprire la sezione con un piccolo pennello, se necessario. Scongelare montare la sezione su uno scivolo al microscopio.Quindi raccogliere in sequenza le sezioni dalla regione di interesse per la ripetizione tecnica desiderata. Lasciare asciugare ad aria le sezioni sui vetrini per un'ora prima di un'ulteriore manipolazione. In un laboratorio di radioattività certificato, utilizzare una matita per etichettare le diapositive con le condizioni sperimentali.Posizionare gli scivoli orizzontalmente in vassoi di plastica. Applicare con cura un volume appropriato di tampone SA regolato al bersaglio in questione alle sezioni montate sulle diapositive. Assicurarsi che ogni sezione sia completamente coperta.Per la determinazione di un legame non specifico, integrare il tampone SA con una concentrazione rilevante di composto non etichettato. Quindi coprire i vassoi con coperchi per evitare l'evaporazione. Pre-incubare a una temperatura rilevante per 30 minuti su uno shaker impostato su 20 giri/min.Quindi, versare il liquido di pre-incubazione da ogni diapositiva e trasferire di nuovo le diapositive nel vassoio di plastica. Coprire immediatamente le sezioni completamente con la relativa concentrazione di radiolige nel tampone SA. Per la determinazione di legatura non specifica, integrare la soluzione di radiolige con una concentrazione rilevante di composto non etichettato.Coprire i vassoi con coperchi e incubare nelle condizioni desiderate con costante agitazione delicata a 20 giri/min. Successivamente, versare la soluzione di incubazione e trasferire le diapositive in un rack di scorrimento del microscopio. Lavare immediatamente le diapositive.Per il protocollo GHB, lavare due volte con tampone SA ghiacciato per 20 secondi e quindi risciacquare due volte scavando il rack scorrevole in vassoi pieni di acqua distillata ghiacciata. Posizionare i vetrini verticalmente in rack e asciugare all'aria per almeno un'ora. Quindi trasferire le diapositive su un fissatore contenente paraformaldeide per la fissazione notturna a temperatura ambiente.Il giorno successivo, trasferire le diapositive in una scatola di essiccatore contenente gel di silice a temperatura ambiente. Lasciare le diapositive nella scatola dell'essiccatore per tre ore per eliminare l'umidità. In primo luogo, posizionare le sezioni in una cassetta di una piastra di imaging schermata a radiazioni con il tessuto rivolto verso l'alto.Includere una microscala radioattiva in ogni cassetta per la successiva quantificazione del radiolig e del legame. Immediatamente prima dell'uso, caricare la piastra di imaging al fosforo sensibile al trizio nella macchina per l'imaging del fosforo ed esporla alla luce infrarossa visibile secondo le istruzioni del produttore per cancellarla. Quindi rimuovere la piastra di imaging dalla macchina per l'imaging del fosforo e posizionarla immediatamente sulle sezioni della cassetta.Assicurarsi che la cassetta sia completamente chiusa. Esporre le sezioni alla piastra di imaging del fosforo per il tempo di esposizione ottimizzato a temperatura ambiente mentre sono schermate dalla luce. Dopo l'esposizione, aprire attentamente la cassetta al buio e trasferire immediatamente la lastra di imaging nella scatola scura di un imager al fosforo.Scansionare la piastra alla massima risoluzione possibile per ottenere un'immagine digitale. Per iniziare, aprire un programma di analisi delle immagini appropriato. Determinare le densità ottiche relative per ogni standard di calibrazione selezionando la determinazione dell'area della voce di menu.Selezionate lo strumento per la creazione della regione e utilizzatelo per selezionare un'area di uguale dimensione per ogni punto della microscala radioattiva. Assegnare un numero a ogni area selezionata facendo clic sul numero sotto l'etichetta della voce di menu. Fare clic su Esporta file e quindi su Report area 2D per esportare i valori OD per ogni punto dello standard di calibrazione.Nel software di imaging proprietario, utilizzare uno strumento di creazione della regione per selezionare la regione di interesse in ogni sezione e misurare i suoi OD per iniziare a eseguire la quantificazione degli autoradiogrammi. Selezionare la stessa area in ogni sezione creando un modello per l'area di interesse e copiarlo e adattarlo a piccole variazioni nell'anatomia cerebrale in ogni autoradiogramma. Successivamente, fare clic su Report area 2D esportazione file per esportare i valori e le dimensioni dell'asta delle aree selezionate in un foglio di calcolo.Determinare l'associazione del radioligand come indicato nel protocollo di testo. In questo studio, la distribuzione anatomica dei siti di legame GHB ad alta affinità viene visualizzato con l'HOCPCA radioattivo analogico GHB radioetichettato in un cervello di topo che è stato tagliato in sezioni coronali, sagittali e orizzontali. Alti livelli di legame sono visti nell'ippocampo e nella corteccia mentre livelli di legame più bassi sono visti nello striato e non viene rilevato alcun legame nel cervelletto.Come mostrato qui, le strutture anatomiche possono essere visualizzate usando piani diversi e l'integrità anatomica può essere supportata dalla colorazione viola cresile. Autoradiogrammi rappresentativi di un topo, un topo e un maiale illustrano la conservazione evolutiva dei siti di legame GHB ad alta affinità nel cervello dei mammiferi. I siti di legame hocpca radioattivi sono rilevati in tutte e tre le specie consentendo il confronto dell'anatomia cerebrale lorda tra di loro.I siti di legame GHB ad alta affinità sono sondati con radioligand ghb che mostrano affinità diverse per i siti di legame ma attività specifiche comparabili. Radioactive HOCPCA è dotato di un'elevata sensibilità e di un eccellente rapporto segnale/rumore. A causa della minore sensibilità dell'NCS-382 radioattivo, per ottenere livelli simili di legame devono essere utilizzate concentrazioni di radioligande più elevate.Per raggiungere livelli di legame comparabili sono necessarie concentrazioni di radioligie ancora più elevate per il GHB radioattivo. Tuttavia, concentrazioni di radioligande più elevate aumentano anche il livello di legame non specifico con un rapporto segnale/rumore di conseguenza inferiore. È importante ottimizzare le condizioni di dosaggio come la concentrazione di radioligand, il lavaggio e il tempo di esposizione al fine di ottenere i migliori rapporti segnale/rumore ed è anche molto importante ricordare di cancellare la piastra prima.La procedura può essere estesa a condizioni in vivo per avere un'idea del legame composto in un animale vivente che potrebbe essere utile per progetti di scoperta. Ricordarsi di lavorare in laboratorio con materiale radioattivo completo certificato e di indossare indumenti protettivi quando si maneggia radioattività o paraformaldeide.

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Qui si descrive un flusso di lavoro per la rapida analizzare ed esplorare le collezioni di immagini di microscopia a fluorescenza utilizzando PhenoRipper, una piattaforma di analisi delle immagini sviluppato di recente.

Analisi rapida ed esplorazione di microscopia a fluorescenza Immagini

Questo protocollo descrive come utilizzare la microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale per visualizzare e tracciare singoli recettori sulla superficie delle cellule viventi e quindi analizzare la mobilità laterale del recettore, le dimensioni dei complessi recettoriali e per visualizzare le interazioni transitorie recettore-recettore. Questo protocollo può essere esteso ad altre proteine di membrana.

Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

Traffico Receptor modula la segnalazione e la cellula di risposta ai ligandi ed è, a sua volta, sensibile alle condizioni di cellulari, tra cui la segnalazione ligando-indotta. Qui, descriviamo una tecnica potente e flessibile per la valutazione quantitativa farmaco-indotta traffico recettoriale utilizzando immunomarcatura e analisi colocalizational.

Rilevamento delle modifiche droga indotte recettore post-internalizzazione Tratta di Analisi Colocalizational

Viene presentato un protocollo per lo screening di piccoli farmaci molecolari basato sulla sintesi in situ di nanocluster d'oro fluorescenti ultrapiccoli (Au NCs) utilizzando proteine caricate con farmaci come modello. Questo metodo è semplice per determinare l'affinità di legame dei farmaci a una proteina bersaglio mediante un segnale fluorescente visibile emesso dalle NC Au modellate con proteina.

Una rapida e quantitativa metodo fluorimetrico per lo screening di stupefacenti piccole molecole di proteine ​​Targeting

Qui presentiamo un protocollo per descrivere la localizzazione dei recettori dell'angiotensina II di tipo 1 nel cervello di ratto mediante autoradiografia quantitativa, densitometrica, in vitro del recettore utilizzando un analogo marcato con iodio-125 dell'angiotensina II.

Autoradiografia del recettore Protocollo per la visualizzazione localizzata di recettori dell&#39;angiotensina II

Qui, abbiamo descritto un metodo di imaging ad alto contenuto per quantificare il trasporto dei mutanti di rodopsina associata alla retinite pigmentosa. Un'analisi dei punteggi multiplo-lunghezza d'onda è stata utilizzata per quantificare proteina rhodopsin sulla superficie delle cellule o in tutta la cella.

Un saggio di trasporto Rhodopsin dall'analisi di Imaging ad alto contenuto

Qui, rappresentiamo un protocollo per la radioetichettatura completamente automatizzata di [11C]SNAP-7941 e l'analisi della cinetica in tempo reale di questo PET-tracer su P-gp che esprime e non esprime.

Aspetto tecnico della sintesi automatizzata e valutazione cinetica in tempo reale di [11C]SNAP-7941

Descriviamo protocolli per valutare il grado di trasduzione mediante peptidi che penetrano nelle cellule utilizzando sistemi di imaging ex vivo seguiti dall'incorporamento della paraffina, dalla sezionamento e dalla microscopia fluorescente confocale utilizzando come esempio il peptide di puntamento cardiaco. Nel nostro protocollo, un singolo animale può essere utilizzato per acquisire entrambi i tipi di valutazione dell'imaging degli stessi organi, dimezzando così il numero di animali...

In vivo Imaging di Efficienza trasduzione di Peptide Targeting Cardiac

Questo protocollo presenta una serie di esperimenti adottati per la valutazione di peptidi antitumorali fotocommutabili, che possono essere utilizzati nello screening preclinico di tali composti. Ciò include la valutazione della citotossicità in colture cellulari 2D e 3D, la valutazione dell'efficienza di fotoisomerizzazione ex vivo (tessuto modello) e l'efficacia in vivo .

Valutazione in vitro e in vivo di composti biologicamente attivi fotocontrollati - potenziali farmaci candidati per la fotofarmacologia del cancro

Presentiamo un protocollo per visualizzare direttamente le attività metaboliche nelle cellule regolate da aminoacidi utilizzando la microscopia a diffusione Raman stimolata (DO-SRS) con ossido di deuterio (acqua pesante D2O), che è integrata con la microscopia a fluorescenza di eccitazione a due fotoni (2PEF).

Imaging chimico bioortogonale del metabolismo cellulare regolato da amminoacidi aromatici

Questo protocollo presenta una procedura dettagliata per preparare quattro radiotraccianti al carbonio-11 mediante il "metodo loop" [11C]metilazione. Descriviamo la procedura per sintetizzare [11C]ER-176, con dati per tre radiotraccianti aggiuntivi: [11C]MRB, [11C]mHED e [11C]PiB. Il metodo ad anello fornisce una sintesi efficiente con maggiori rese radiochimiche contro la tradizionale metilazione dei recipienti di reazione [11C].

Miglioramento dell'efficienza e della resa di radiomarcatura dei radioligandi al carbonio-11 per la ricerca clinica utilizzando il metodo Loop

Scopri l'autoradiografia per visualizzare siti di legame proteici nei tessuti cerebrali di topo. Questa tecnica offe alta risoluzione spaziale e risultati più rapidi rispetto ai metodi tradizionali per l'analisi farmacologica.

Autoradiografia come un metodo semplice e potente per la visualizzazione e caratterizzazione di bersagli farmacologici

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