Autoradiografia come un metodo semplice e potente per la visualizzazione e caratterizzazione di bersagli farmacologici

L'autoradiografia è una tecnica potente e semplice per studiare la distribuzione di siti di legame proteico nei tessuti utilizzando radioligand specifici per il bersaglio. È anche un'alternativa adatta all'immunoistochimica. Questa tecnica visualizza l'espressione proteica con risoluzione spaziale tramite immagini digitali che è più veloce dell'esposizione tradizionale al film.

Può anche essere utilizzato per l'analisi farmacologica di obiettivi proteici. Il metodo prevede tessuti di topo montati su vetro, ma può essere esteso ad altre specie o anche a cellule coltivate su coverlips. A dimostrare la procedura sarà Nane Griem-Krey, dottoranda nel mio laboratorio.

Per iniziare, immergere il tessuto nel ghiaccio secco in polvere per scattare congelarlo. Trasferire il tessuto congelato direttamente in un criostato impostato su meno 20 gradi Celsius. Lasciare che il tessuto si acclimati a meno 20 gradi Celsius nel criostato per 20 minuti.

Quindi coprire il supporto del tessuto con un mezzo di incorporamento all'esterno del criostato e posizionare rapidamente il campione di tessuto congelato nell'orientamento desiderato mentre il mezzo di incorporamento è ancora liquido. Trasferire il porta tessuto al criostato ed esporre il mezzo di incorporamento a temperature inferiori a meno 10 gradi Celsius per l'indurimento. Posizionare il porta tessuto nel microtomo del criostato.

Regolare l'orientamento del tessuto per evitare sezioni inclinate. Tagliare il tessuto con la guida di un atlante stereotassico in sezioni dello spessore desiderato e aprire la sezione con un piccolo pennello, se necessario. Scongelare montare la sezione su uno scivolo al microscopio.

Quindi raccogliere in sequenza le sezioni dalla regione di interesse per la ripetizione tecnica desiderata. Lasciare asciugare ad aria le sezioni sui vetrini per un'ora prima di un'ulteriore manipolazione. In un laboratorio di radioattività certificato, utilizzare una matita per etichettare le diapositive con le condizioni sperimentali.

Posizionare gli scivoli orizzontalmente in vassoi di plastica. Applicare con cura un volume appropriato di tampone SA regolato al bersaglio in questione alle sezioni montate sulle diapositive. Assicurarsi che ogni sezione sia completamente coperta.

Per la determinazione di un legame non specifico, integrare il tampone SA con una concentrazione rilevante di composto non etichettato. Quindi coprire i vassoi con coperchi per evitare l'evaporazione. Pre-incubare a una temperatura rilevante per 30 minuti su uno shaker impostato su 20 giri/min.

Quindi, versare il liquido di pre-incubazione da ogni diapositiva e trasferire di nuovo le diapositive nel vassoio di plastica. Coprire immediatamente le sezioni completamente con la relativa concentrazione di radiolige nel tampone SA. Per la determinazione di legatura non specifica, integrare la soluzione di radiolige con una concentrazione rilevante di composto non etichettato.

Coprire i vassoi con coperchi e incubare nelle condizioni desiderate con costante agitazione delicata a 20 giri/min. Successivamente, versare la soluzione di incubazione e trasferire le diapositive in un rack di scorrimento del microscopio. Lavare immediatamente le diapositive.

Per il protocollo GHB, lavare due volte con tampone SA ghiacciato per 20 secondi e quindi risciacquare due volte scavando il rack scorrevole in vassoi pieni di acqua distillata ghiacciata. Posizionare i vetrini verticalmente in rack e asciugare all'aria per almeno un'ora. Quindi trasferire le diapositive su un fissatore contenente paraformaldeide per la fissazione notturna a temperatura ambiente.

Il giorno successivo, trasferire le diapositive in una scatola di essiccatore contenente gel di silice a temperatura ambiente. Lasciare le diapositive nella scatola dell'essiccatore per tre ore per eliminare l'umidità. In primo luogo, posizionare le sezioni in una cassetta di una piastra di imaging schermata a radiazioni con il tessuto rivolto verso l'alto.

Includere una microscala radioattiva in ogni cassetta per la successiva quantificazione del radiolig e del legame. Immediatamente prima dell'uso, caricare la piastra di imaging al fosforo sensibile al trizio nella macchina per l'imaging del fosforo ed esporla alla luce infrarossa visibile secondo le istruzioni del produttore per cancellarla. Quindi rimuovere la piastra di imaging dalla macchina per l'imaging del fosforo e posizionarla immediatamente sulle sezioni della cassetta.

Assicurarsi che la cassetta sia completamente chiusa. Esporre le sezioni alla piastra di imaging del fosforo per il tempo di esposizione ottimizzato a temperatura ambiente mentre sono schermate dalla luce. Dopo l'esposizione, aprire attentamente la cassetta al buio e trasferire immediatamente la lastra di imaging nella scatola scura di un imager al fosforo.

Scansionare la piastra alla massima risoluzione possibile per ottenere un'immagine digitale. Per iniziare, aprire un programma di analisi delle immagini appropriato. Determinare le densità ottiche relative per ogni standard di calibrazione selezionando la determinazione dell'area della voce di menu.

Selezionate lo strumento per la creazione della regione e utilizzatelo per selezionare un'area di uguale dimensione per ogni punto della microscala radioattiva. Assegnare un numero a ogni area selezionata facendo clic sul numero sotto l'etichetta della voce di menu. Fare clic su Esporta file e quindi su Report area 2D per esportare i valori OD per ogni punto dello standard di calibrazione.

Nel software di imaging proprietario, utilizzare uno strumento di creazione della regione per selezionare la regione di interesse in ogni sezione e misurare i suoi OD per iniziare a eseguire la quantificazione degli autoradiogrammi. Selezionare la stessa area in ogni sezione creando un modello per l'area di interesse e copiarlo e adattarlo a piccole variazioni nell'anatomia cerebrale in ogni autoradiogramma. Successivamente, fare clic su Report area 2D esportazione file per esportare i valori e le dimensioni dell'asta delle aree selezionate in un foglio di calcolo.

Determinare l'associazione del radioligand come indicato nel protocollo di testo. In questo studio, la distribuzione anatomica dei siti di legame GHB ad alta affinità viene visualizzato con l'HOCPCA radioattivo analogico GHB radioetichettato in un cervello di topo che è stato tagliato in sezioni coronali, sagittali e orizzontali. Alti livelli di legame sono visti nell'ippocampo e nella corteccia mentre livelli di legame più bassi sono visti nello striato e non viene rilevato alcun legame nel cervelletto.

Come mostrato qui, le strutture anatomiche possono essere visualizzate usando piani diversi e l'integrità anatomica può essere supportata dalla colorazione viola cresile. Autoradiogrammi rappresentativi di un topo, un topo e un maiale illustrano la conservazione evolutiva dei siti di legame GHB ad alta affinità nel cervello dei mammiferi. I siti di legame hocpca radioattivi sono rilevati in tutte e tre le specie consentendo il confronto dell'anatomia cerebrale lorda tra di loro.

I siti di legame GHB ad alta affinità sono sondati con radioligand ghb che mostrano affinità diverse per i siti di legame ma attività specifiche comparabili. Radioactive HOCPCA è dotato di un'elevata sensibilità e di un eccellente rapporto segnale/rumore. A causa della minore sensibilità dell'NCS-382 radioattivo, per ottenere livelli simili di legame devono essere utilizzate concentrazioni di radioligande più elevate.

Per raggiungere livelli di legame comparabili sono necessarie concentrazioni di radioligie ancora più elevate per il GHB radioattivo. Tuttavia, concentrazioni di radioligande più elevate aumentano anche il livello di legame non specifico con un rapporto segnale/rumore di conseguenza inferiore. È importante ottimizzare le condizioni di dosaggio come la concentrazione di radioligand, il lavaggio e il tempo di esposizione al fine di ottenere i migliori rapporti segnale/rumore ed è anche molto importante ricordare di cancellare la piastra prima.

La procedura può essere estesa a condizioni in vivo per avere un'idea del legame composto in un animale vivente che potrebbe essere utile per progetti di scoperta. Ricordarsi di lavorare in laboratorio con materiale radioattivo completo certificato e di indossare indumenti protettivi quando si maneggia radioattività o paraformaldeide.