Name: Colletotrichum fioriniae Sviluppo in acqua ed estratti floreali basati su cloroformio mirtillo e Cranberry (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-04-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 32 s
Description: Scopri un metodo economico per studiare lo sviluppo di Colletotrichum fioriniae usando estratti floreali di mirtillo e cranberry. Questo protocollo permette di monitorare in tempo reale le dinamiche del patogeno.

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Ringraziamo il William S. Haines, Sr. dotato Cranberry Research Fund e il New Jersey mirtillo e Cranberry Research Council, Inc., per il supporto. Ringraziamo anche Jennifer Vaiciunas (orientamento e preparazioni floreali), Christine Constantelos (coltura fungosa e preparazioni floreali), David Jones (estrazioni e preparazioni floreali), Langley Oudemans (preparazioni floreali, le riprese e la fotografia), Jesse Lynch (preparazioni floreali), Roxanne Tumnalis (supporto generale) e numerosi studenti/estate stagisti.

<ol><li>Pszczółkowska, A., Okorski, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+report+of+anthracnose+disease+caused+by+Colletotrichum+fioriniae+on+blueberry+in+western+Poland%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">First report of anthracnose disease caused by Colletotrichum fioriniae on blueberry in western Poland.</a> Plant Disease. 100, 2167(2016).</li>
<li>Oudemans, P. V., Caruso, F. L., Stretch, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cranberry+fruit+rot+in+the+northeast%3A+a+complex+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Disease%22%5BJournal%5D)">Cranberry fruit rot in the northeast: a complex disease.</a> Plant Disease. 82, 1176-1184 (1998).</li>
<li>Damm, U., Cannon, P. F., Woudenberg, J. H. C., Crous, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Colletotrichum+acutatum+species+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Studies+in+Mycology%22%5BJournal%5D)">The Colletotrichum acutatum species complex.</a> Studies in Mycology. 73, 37-113 (2012).</li>
<li>Marcelino, J., Giordano, R., Gouli, S., Gouli, V., Parker, B. L., Skinner, M., TeBeest, D., Cesnik, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colletotrichum+acutatum+var.+fioriniae+%28teleomorph%3A+Glomerella+acutata+var.+flioriniae+var.+nov.%29+infection+of+a+scale+insect%5BTitle%5D)+AND+%22Mycologia%22%5BJournal%5D)">Colletotrichum acutatum var. fioriniae (teleomorph: Glomerella acutata var. flioriniae var. nov.) infection of a scale insect.</a> Mycologia. 100, 353-374 (2008).</li>
<li>Pennycook, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colletotrichum+fioriniae+comb.+%26+stat.+nov.%2C+resolving+a+nomenclatural+muddle%5BTitle%5D)+AND+%22Mycotaxon%22%5BJournal%5D)">Colletotrichum fioriniae comb. & stat. nov., resolving a nomenclatural muddle.</a> Mycotaxon. 132, 149-154 (2017).</li>
<li>Shivas, R. G., Tan, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+taxonomic+re-assessment+of+Colletotrichum+acutatum%2C+introducing+C.+fioriniae+comb.+et+stat.+nov+and+C.+simmondsii+sp+nov%5BTitle%5D)+AND+%22Fungal+Diversity%22%5BJournal%5D)">A taxonomic re-assessment of Colletotrichum acutatum, introducing C. fioriniae comb. et stat. nov and C. simmondsii sp nov.</a> Fungal Diversity. 39, 111-122 (2009).</li>
<li>Wharton, P. S., Diéguez-Uribeondo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+Colletotrichum+acutatum%5BTitle%5D)+AND+%22Anales+del+Jard%C3%ADn+Bot%C3%A1nico+de+Madrid%22%5BJournal%5D)">The biology of Colletotrichum acutatum.</a> Anales del Jardín Botánico de Madrid. 61, 3-22 (2004).</li>
<li>Prusky, D., Alkan, N., Mengiste, T., Fluhr, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quiescent+and+necrotrophic+lifestyle+choice+during+postharvest+disease+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Quiescent and necrotrophic lifestyle choice during postharvest disease development.</a> Annual Review of Phytopathology. 51, 155-176 (2013).</li>
<li>Milholland, R. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMilholland%2C+RD+%22Compendium+of+Blueberry+and+Cranberry+Diseases%22">Compendium of Blueberry and Cranberry Diseases</a>. , American Phytopathological Society. St. Paul, MN. (1995).</li>
<li>DeMarsay, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Anthracnose+fruit+rot+of+highbush+blueberry%3A+biology+and+epidemiology%22">Anthracnose fruit rot of highbush blueberry: biology and epidemiology</a>. , Rutgers University. New Brunswick, NJ. Dissertation (2005).</li>
<li>Madden, L. V., Yang, X. S., Wilson, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+rain+intensity+on+splash+dispersal+of+Colletotrichum+acutatum%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Effects of rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum.</a> Phytopathology. 86, 864-874 (1996).</li>
<li>Yang, X., Madden, L. V., Wilson, L. L., Ellis, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+surface-topography+and+rain+intensity+on+splash+dispersal+of+Colletotrichum+acutatum%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Effects of surface-topography and rain intensity on splash dispersal of Colletotrichum acutatum.</a> Phytopathology. 80, 1115-1120 (1990).</li>
<li>Wharton, P. S., Dickman, J. S., Schilder, A. M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Timing+of+spore+release+by+Colletotrichum+acutatum+in+Michigan+blueberry+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Timing of spore release by Colletotrichum acutatum in Michigan blueberry fields.</a> Phytopathology. 92, 86(2002).</li>
<li>MacKenzie, S. J., Peres, N. A., Timmer, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Colonization+of+citrus+leaves+and+secondary+conidiation+response+to+citrus+flower+extracts+by+non-postbloom+fruit+drop+strains+of+Colletotrichum+acutatum%5BTitle%5D)+AND+%22Tropical+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Colonization of citrus leaves and secondary conidiation response to citrus flower extracts by non-postbloom fruit drop strains of Colletotrichum acutatum.</a> Tropical Plant Pathology. 35, 333-342 (2010).</li>
<li>Leandro, L. F. S., Gleason, M. L., Nutter, F. W., Wegulo, S. N., Dixon, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strawberry+plant+extracts+stimulate+secondary+conidiation+by+Colletotrichum+acutatum+on+symptomless+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Strawberry plant extracts stimulate secondary conidiation by Colletotrichum acutatum on symptomless leaves.</a> Phytopathology. 93, 1285-1291 (2003).</li>
<li>Waller, T. J., Vaiciunas, J., Constantelos, C., Oudemans, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+the+blueberry+floral+extracts+influence+secondary+conidiation+and+appressorial+formation+of+Colletotrichum+fioriniae%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">Evidence the blueberry floral extracts influence secondary conidiation and appressorial formation of Colletotrichum fioriniae.</a> Phytopathology. 108, 561-567 (2017).</li>
<li>Gager, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22The+influence+of+cranberry+floral+wax+on+appressorium+formation+in+Colletotrichum+fioriniae%22">The influence of cranberry floral wax on appressorium formation in Colletotrichum fioriniae</a>. , Rutgers University. New Brunswick, NJ. Masters thesis (2015).</li>
<li>Podila, G. K., Rogers, L. M., Kolattukudy, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+signals+from+avocado+surface+wax+trigger+germination+and+appressorium+formation+in+Colletotrichum+gloeosporioides%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Chemical signals from avocado surface wax trigger germination and appressorium formation in Colletotrichum gloeosporioides.</a> Plant Physiology. 103, 267-272 (1993).</li>
<li>Polashock, J. J., Caruso, F. L., Oudemans, P. V., McManus, P. S., Crouch, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+North+American+cranberry+fruit+rot+fungal+community%3A+a+systematic+overview+using+morphological+and+phylogenetic+affinities%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">The North American cranberry fruit rot fungal community: a systematic overview using morphological and phylogenetic affinities.</a> Plant Pathology. 58, 1116-1127 (2009).</li>
<li>Miller, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((V-8+juice+agar+as+a+general+purpose+medium+for+fungi+and+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Phytopathology%22%5BJournal%5D)">V-8 juice agar as a general purpose medium for fungi and bacteria.</a> Phytopathology. 45, 461-462 (1955).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Le analisi biologiche rilevare la risposta di c. fioriniae agli estratti floreali (FEs) sono state sviluppate per i frutti di mirtillo e cranberry rot pathosystems ma possono essere facilmente adattate ad altre colture orticole. Il protocollo di cui sopraelencato è stato prezioso nell'acquisizione di molti insiemi di dati importanti tra cui, ma non limitato a: FE effetti su più isolati di numerosi agenti patogeni, corso di tempo informazioni relative alle fasi di crescita fungina in presenza di vari FEs, confronto di tecniche di estrazione, ispezione di singole sostanze chimiche fioriniae c. crescita e differenziamento, valutazione dell'organo di fiori singoli estratti, effetti della temperatura sulla c. fioriniae , mentre in presenza di FE, effetti di estrazioni di cera dipendente fenologia ed effetti floreali dell'acqua piovana. Attraverso l'utilizzo di queste tecniche, dati generati hanno anche fornito una comprensione più chiara della vita di c. fioriniae fasi e delucida parzialmente perché il periodo di fioritura è così importante per il controllo di frutta molti agenti patogeni di decomposizione.
Inizialmente, tutti i fiori sono stati elaborati in modo identico per l' attiva-FE, ma il processo di estrazione è spostata verso l'utilizzo di fiori interi. Dissezione floreale era molto tempo e ha avuto poco effetto sulla bioattività del FEs risultante. Tuttavia, singoli organi floreali possono e sono stati valutati utilizzando questo protocollo, ma grande cura deve essere preso non completamente macerare i tessuti floreali (Supplemental Movie 1, con precauzioni dettagliate al punto 2.3), come questo può provocare rilasciato funghi tossici/statico composti in FE che potrebbe falsare la valutazione microscopica. Meno invasive estrazioni come pass -FE (Supplemental Movie 2) e rw-FE sono ora più favorevole grazie alla loro facilità di acquisizione. Inoltre, queste tecniche di estrazione richiedono solo di filtrazione sotto vuoto per acquisire biologicamente attivi floreale segnali chimici.
I fiori utilizzati in tutte le estrazioni in genere erano refrigerati per 0-3 giorni prima della preparazione di estratto. Una sfida di questo protocollo è la gestione del tempo del fatturato di FE (raccolta di campi attraverso deposito di estratti). Ciò è stata esacerbata da numerosi campioni da più fonti e date. Fiori congelati non sono stati valutati in qualsiasi misura reale, come fiori scongelati appaiono deteriorata e scolorita. Tuttavia, una volta che la FEs a base d'acqua sono stati preparati, ripetuti di congelamento e scongelamento non ha mostrato alcun effetto sulla bioattività del FE, così a lungo come il FE sono ricongelati rapidamente dopo la preparazione di analisi biologica (valida 3 anni FE).
Cloroformio-basato estrazione consente l'indagine delle risposte di agente patogeno per il cere superficie tridimensionale floreale e frutta in un piano bidimensionale tramite evaporazione ch-FE su vetrini coprioggetti. Tuttavia, è improbabile che le strutture cristalline effettive delle cere depositati da ch-FE sono identiche alla superficie da cui sono stati raccolti. Tecniche-significate, supplementare devono essere implementate se fungina risposta a cera specifiche strutture in vivo è l'obiettivo principale di indagine. Basato su cloroformio estratti bisogno più deposito manutenzione rispetto le estrazioni a base d'acqua. Oltre a mantenere il ch-FE estratti nel buio, la coltura delle cellule PTFE rivestito tube tappi e parafilm tenuta involucro c'è bisogno di essere controllato regolarmente per perdite per evaporazione e sostituiti se necessario.
Il concetto di monitoraggio deflusso di acqua piovana floreale è radicato nell'idea di far avanzare gli strumenti di monitoraggio di malattia site-specific. I dispositivi di raccolta dell'acqua piovana possono essere adattati a molte altre architetture di pianta, fintanto che cattura il dispositivo di raccolta dell'acqua piovana che ha eseguito fuori di fiori. Questo approccio fornisce informazioni su o meno stimolazione floreale è presente nel campo in qualsiasi momento e può essere monitorata per tutta la stagione. In alternativa, dispositivi di raccolta possono essere distribuiti su più postazioni di baldacchino per determinare quanto lontano spunti floreali sono stati lavati durante qualsiasi dato bagnante-evento. In futuro gli esperimenti, rw-FE detterà quando applicazioni fungicida devono iniziare e quando possono tranquillamente finire. Inoltre, monitorando le estrazioni di cera dipendente fenologia (protocollo sezione 9), l'importanza del periodo di fioritura alla biologia dell'agente patogeno è diventato ancora più evidente. Tale sezione è stata anche inclusa per dimostrare la flessibilità di queste analisi biologiche, fornendo i metodi che consentono il confronto side-by-side di cere di superficie di host che sono temporaneamente separati. I dati generati utilizzando le tecniche di estrazione floreale e analisi biologiche rappresentano indicatori tangibili di stimolazione dell'agente patogeno, specifiche classi chimiche importante patogeno biologia e strategie di controllo futuro.

Colletotrichum fioriniae provoca una putrefazione della frutta del mirtillo gigante americano (Vaccinium corymbosum L.) e il grande mirtillo americano (V. macrocarpon Aiton)1,2. Questo agente patogeno è stata recentemente delineato dal c. acutatum specie complesse3,4,5,6 ed è un agente causale dell'antracnosi del mirtillo e membro della putrefazione della frutta del mirtillo rosso complesso, oltre a causare numerose altre pianta malattie in tutto il mondo7. C. fioriniae ha una latente, stile di vita hemibiotrophic8, con le infezioni che si verificano durante lo sviluppo di bloom e sintomo non diventando evidente fino a quando i frutti sono nelle fasi finali della maturazione9. Nel mirtillo rosso e mirtillo, putrefazione della frutta è solo adeguatamente controllata con applicazioni di fungicida effettuate durante il periodo di fioritura. Il patogeno sverna in mirtillo dormienti gemma floreale scale10 e sporulates durante la fioritura. Conidi vengono spostati in tutto il baldacchino via pioggia-splash dispersione11,12 e accumulo di inoculo è stato fortemente correlato per il periodo di fioritura13. Risposta di Colletotrichum specie a fiori di host non è univoco per Vaccinium, come fiori sono importanti componenti della frutta di agrumi post fioritura drop (PFD)14 così come antracnosi fragola15, in entrambi i casi la causa l'agente patogeno per sporulare. Tutti questi casi evidenziano l'esigenza di metodi efficaci valutare la dinamica temporale dei segnali chimici floreale nelle fioriniae c. e altri agenti patogeni che infettano durante la fioritura. Le intuizioni fornite con i metodi descritti qui stanno diventando sempre più più preziose.
Questo protocollo particolari metodi di approvvigionamento Estratto floreale (FE) e guide per la valutazione delle risposte di c. fioriniae a FE via vetro vetrino coprioggetti analisi biologiche15,16. Le tecniche di estrazione floreale sono suddivisi in due tipi principali; estrazioni a base d'acqua (attivo-FE, passiva (pass -FE) e campo base acqua piovana (rw-FE)) e basato su cloroformio (ch-FE)17 estrazioni. Le estrazioni di acqua-base consentono per l'ispezione di acqua mobilitato floreale segnali chimici. Queste indicazioni di mobilitati sono probabilmente importanti componenti della Corte infezione, poiché FE aumenta notevolmente la velocità di infezione16, oltre a fornire l'umidità necessaria per l'infezione si verifica. Inoltre, essi rappresentano una condizione più naturale come stimolo floreale può essere lavato in tutto il baldacchino durante gli eventi di bagnatura come precedentemente osservato in mirtillo e altri sistemi di coltura14,16. Cloroformio-base floreale estrazioni (ch-FE) anche forniscono preziose informazioni relative alla risposta di agente patogeno a superficie host cere17,18, delucidando le prime fasi di crescita di conidi una volta depositati su suscettibili organi di host (ad esempio fiori, ovaie e frutta in via di sviluppo). Risposta di agente patogeno a cambiamenti stagionali in cere superficie host possa essere monitorato anche utilizzando questo protocollo. Di conseguenza, le analisi biologiche sono su misura per lavorare con FE a base d'acqua o basati su cloroformio FE per mitigare le differenze intrinseche tra questi due materiali.
I dati generati da analisi biologiche ha rivelato che le estrazioni di acqua-basato stimolano livelli elevati di conidiation secondaria che basati su cloroformio estrazioni dove c'era una risposta definitiva appressorial, implicando quindi molteplici composti presenti alla FE. È interessante notare che, entrambe queste risposte di crescita sono state osservate quando utilizzando acqua piovana che aveva scappano di mirtillo rosso e mirtillo fiori, che indica più composti stimolatore può essere lavato dalla superficie dei fiori. Così, monitoraggio per stimolazione floreale fornirà approfondimenti la probabilità di successo di agente patogeno in un sistema agricolo.
L'obiettivo finale di questo protocollo è quello di fornire una metodologia per generare informazioni di base biologica su funghi fitopatogeni in risposta a stimoli chimici floreale, così come le metodologie d'inizio che possono utilizzare queste informazioni floreale per aiutare nella processi di gestione e il processo decisionale di site-specific di malattia.

<table><tbody><tr><td>0,22 &micro; m dimensione dei pori, filtro sterilizzante in acetato</td><td>VWR</td><td>101102-280</td><td>Chiarificazione dell'estratto floreale di mirtillo (FE)&nbsp;</td></tr><tr><td>200-1000 &micro; l pipetta con puntali</td><td></td> <td>-</td> <td>Attrezzatura, qualsiasi marca all'interno dell'intervallo sarà adeguata</td></tr><tr><td>40-200 &; l pipetta con punte</td><td>-</td><td>-</td><td>Attrezzatura, qualsiasi marca all'interno dell'intervallo sarà adeguata</td></tr><tr><td>5-40 &; l pipetta con punte</td> <td>-</td><td></td> <td>Attrezzatura, qualsiasi marca all'interno della gamma sarà adeguata</td></tr><tr><td>Pistola a spruzzo d'aria tazza spray per vernice usa e getta con adattatore di collegamento&nbsp;</td><td>Trasporto portuale</td><td>97098</td><td>Raccolta dell'acqua piovana ai mirtilli (rw-)FE</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>Amsco</td><td>3011</td><td>Attrezzatura, preparazione dei media</td></tr><tr><td>Stuoia a rete a barre (foglio di rete in plastica)</td><td>Winco</td><td>BL-240</td><td>Raccolta passiva (pass)-FE</td></tr><tr><td>Timer da banco</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-662-47</td><td>Attrezzatura, preparazione FE</td></tr><tr><td>Tubo flessibile nero a pressione/vuoto</td><td>VWR</td><td>62994-795</td><td>Componente del filtro sottovuoto</td></tr><tr><td>Imbuto Buchner</td><td>Coors USA</td><td>60240</td><td>Componente del filtro sottovuoto, accetta dischi di carta da filtro da 55 mm</td></tr><tr><td>Bruciatore Bunsen&nbsp; &nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzatura Carbonato di calcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>C64-500</td><td>Componente multimediale</td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Sorvall&nbsp;</td><td>Attrezzatura RC 5B Plus</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga (15 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-527-90</td><td>Attrezzatura</td></tr><tr><td>Provette da centrifuga (50 ml)</td><td>VWR</td><td>10025-694</td><td>Attrezzatura, collezione rw-FE</td></tr><tr><td>Garza (grado 50)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AS240</td><td>Attrezzatura, preparazione</td></tr><tr><td>FE Cloroformio</td><td>VWR</td><td>JT9175-3</td><td>Chimico, triclorometano: grado di saggio, &ge; Farina di mais Agar pura al 99%, per biologia molecolare, senza perossidoFisher</td></tr> <tr><td></td><td>Scientific</td><td>B11132</td><td>&nbsp; Terreni premiscelati, isolamento conservazione su inclinazioni</td></tr><tr><td>Macchia blu cotone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>61335</td><td>Macchia blu cotone Lattofenolo</td></tr><tr><td>Difco Agar</td><td>VWR</td><td>90004-032</td><td>Componente del supporto</td></tr><tr><td>Trapano-pressa</td><td></td><td></td> <td>Delta-Equipment, raccolta rw-FE</td></tr><tr><td>EASYpure LF Acqua ultrapura</td><td>Barnstead</td><td>D738</td><td>Attrezzatura, fonte di acqua deionizzata</td></tr><tr><td>Etanolo (95%)</td><td>-</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Pallone filtrante chimico (500 ml)</td><td>Pyrex</td><td>No. 5340</td><td>Componente del filtro sottovuoto</td></tr><tr><td>Cappa aspirante</td><td>Hamilton-Equipment</td><td></td><td>, uso del cloroformio</td></tr><tr><td>Imbuto (7 X 7 cm)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>60820-110</td><td>Cranberry rw-FE collezione, preparazione FE</td></tr><tr><td>Vetrino generico</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-038-101</td><td>Conduttanza per biotest</td></tr><tr><td>Flacone spray generico per pompa in plastica</td><td>VWR</td><td>16126-454</td><td>collezione pass-FE, capacità di almeno 250 ml</td></tr><tr><td>Provette per colture cellulari in vetro</td><td>-</td><td>-Conservazione</td> <td>di vetrini coprioggetti in vetro ch-FE</td></tr><tr><td>(22 x 22 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-542B</td><td>Conduttanza per biotest</td></tr><tr><td>Celle di Van Tieghem in vetro (provette di vetro tagliate a mano)</td><td>- </td><td>-</td><td>Cloroformio (ch)-Saggio FE, (8 mm OD 6 mm ID)</td></tr><tr><td>Pipetta di vetro (1-100 & micro; l)</td><td>Hamilton Co. Inc.</td><td>#710</td><td>biotest ch-FE</td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>Lattofenolo cotone-blu macchia</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Bright-Line</td><td>5971R10</td><td>Attrezzatura</td></tr><tr><td>Acido lattico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W261106</td><td>Lattofenolo cotone-blu macchia</td></tr><tr><td>Cappa a flusso laminare</td><td>Labconco</td><td>3730400</td><td>Attrezzatura, ambiente di lavoro sterile</td></tr><tr><td>Sonda metallica (generico)&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Attrezzatura&nbsp;</td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga (2 ml)</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td>Stoccaggio e preparazione di miscele per trattamenti acquosi</td></tr><tr><td>Microscopio, Leica DMLB</td><td>Leica</td><td>020-519.010</td><td>Attrezzatura</td></tr><tr><td>Malta (ceramica)</td><td>Coors USA</td><td>60313</td><td>Componente del filtro sottovuoto</td></tr><tr><td>Guanti in nitrile&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>19-130-1597D</td><td>Collezione di fiori</td></tr><tr><td>Dischi di carta (tovaglioli di carta tagliati)</td><td>Office Basics</td><td>KCC01510</td><td>controllo dell'umidità nel biodosaggio</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>Film di paraffina plastica&nbsp;</td></tr><tr><td>Pestello (ceramica)</td><td>Coors USA</td><td>60314</td><td>Componente del filtro sottovuoto</td></tr><tr><td>Cristalli di fenolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A92-100</td><td>Lattofenolo cotone-blu</td></tr><tr><td>macchia Sacchetti di plastica (~100 mm X 152 mm)</td><td>Uline</td><td>S1294</td><td>Attrezzature, refrigerazione dei fiori</td></tr><tr><td>Piatti di coltura cellulare in plastica (diametro 9 cm)&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td> <td>(piastra di Petri), conduttanza di biodosaggio</td></tr><tr><td>Tappi rivestiti in politetrafluoroetilene (PTFE)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>60927-228</td><td>Stoccaggio dei becher ch-FE</td></tr><tr><td>Pyrex (100 ml)</td><td>Pyrex</td><td>n. 1000</td><td>Preparazione del ch-FE</td></tr><tr><td>Teglia per il pane Pyrex</td><td>-</td><td>-</td><td>pass-FE collection</td></tr><tr><td>Cilindro graduato Pyrex</td><td>-</td><td>-</td><td>Attrezzatura, preparazione FE</td></tr><tr><td>Contenitore di plastica sigillato (30 mm X 13 mm X 7 mm)&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Conduttanza di biotest</td></tr><tr><td>Forbici da dissezione a punta acuminata</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td>Attrezzatura, per tagliare dischi di garza e carta</td></tr><tr><td>Filtro a rete in acciaio inossidabile</td><td>VWR</td><td>470149-756</td><td>Preparazione della punta da trapano a gradino ch-FE</td></tr><tr><td>(step-bit)</td><td>Dewalt-Equipment</td><td></td><td>, raccolta rw-FE</td></tr><tr><td>Loop sterile (combi-loop)</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-602&nbsp;</td><td>Preparazione della coltura</td></tr><tr><td>Cavo telefonico (fili interni)</td> <td>-</td><td></td> Cestello per provette <td>da collezione Blueberry rw-FE</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>VWR</td><td>470137-792</td><td>Sostituzione prontamente disponibile per il cestello in rete di plastica [fragola]&nbsp;</td></tr><tr><td>V8 Juice</td><td>Campbell's Soup</td> <td>Company-Componente</td> <td>del terreno fungino</td></tr><tr><td>Cestini in rete di plastica vintage [fragola] Raccolta</td><td>Donation-Pass-FE</td><td></td><td>, può sostituire il cestello della provetta (470137-792)</td></tr><tr><td>Vortex Genie (Vortex)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-812</td><td>Preparazione della sospensione di spore</td></tr><tr><td>Whatman No. 1 Cerchi qualitativi da 55 mm</td><td>Whatman</td><td>1001-055</td><td>Componente del filtro sottovuoto</td></tr><tr><td>Fascette in plastica bianca (100 mm)</td><td>Uline</td><td>S-566W</td><td>Cranberry collezione rw-FE</td></tr></tbody></table>

colletotrichum fioriniae sviluppo in acqua ed estratti floreali basati su cloroformio mirtillo e cranberry

Colletotrichum fioriniae Development in Water and Chloroform-based Blueberry and Cranberry Floral Extracts

Per monitorare accuratamente la fenologia del periodo della fioritura e la dinamica temporale dei segnali chimici floreale nelle frutta funghi patogeni di decomposizione, metodi di estrazione floreale e coprioggetto analisi biologiche sono state sviluppate utilizzando Colletotrichum fioriniae. Nel mirtillo rosso e mirtillo, questo agente patogeno è controllato in modo ottimale applicando fungicidi durante il periodo di fioritura a causa del gioco di ruolo fiori nelle fasi iniziali dell'infezione. Il protocollo dettagliato qui descrive come floreali estratti (FE) sono state ottenute utilizzando acqua, cloroformio e metodi basati su acqua piovana di campo per un uso successivo nel corrispondente analisi biologiche di vetrino coprioggetti di vetro. Ogni FE è servito a fornire un set di informazioni diverso: risposta di c. fioriniae a chimica floreale mobilitato stecche in acqua (a base di acqua), risposta di agente patogeno al fiore e cere superficie di frutta (a base di cloroformio) e monitoraggio basato sul campo di raccolta acqua piovana floreale, trasferirsi in vitro osservazioni in un ambiente agricolo. Il FE è ampiamente descritto come acqua-cloroformio-basi o, con un'appropriata analisi biologica descritto per compensare le differenze intrinseche tra questi due materiali. L'acqua piovana che ha avuto colare di fiori è stato raccolto in dispositivi unici per ciascuna coltura, alludendo alla flessibilità e alla applicazione di questo approccio per altri sistemi di coltivazione. Le analisi biologiche sono rapido, economico, semplice e forniscono la capacità di generare informazioni spatiotemporal e site-specific sulla presenza di stimolatori floreali composti da varie fonti. Queste informazioni saranno in definitiva informare meglio strategie di gestione della malattia, come FE diminuire il tempo necessario per l'infezione si verifica, fornendo così spaccato cambiando rischi per infezione da agente patogeno nel corso della stagione di crescita.

I risultati presentati qui sono alcuni esempi dei molti saggi che possono essere eseguiti utilizzando questa metodologia. Figura 1 è una guida illustrata all'analisi biologica FE base d'acqua ed è completata dalla Figura 2 che segue all'analisi biologica basati su cloroformio FE. Figura 3 fornisce una guida visiva per quello che può essere previsto sulla valutazione microscopica di c. fioriniae a 24 h, in entrambe le analisi biologiche (controlli rispetto SDW) basati su acqua e cloroformio. Figura 4 dettagli uno studio di corso di tempo di 24 h con c. fioriniae in presenza del mirtillo rosso varietà 'Stevens' ch-FE e dà un riferimento visivo per un risultato di importazione di questa ricerca: FE è diminuito il tempo necessario per formare strutture di infezione rispetto al SDW. Figura 5 fornisce un esempio di dati raccolti da una vetrino coprioggetti analisi biologica utilizzando il deflusso di acqua piovana floreale del mirtillo rosso (CB "Fiore" rw-FE). Figura 6 rappresenta un altro importante risultato: floreale ovaia ch-FE era molto più stimolante di frutta ch-FE, che indica l'importanza di fioritura del ciclo di vita di c. fioriniae. Le foto supplementari e filmati forniscono importanti elementi visivi dei fiori utilizzati nelle floreale dell'acqua piovana raccolta dispositivi/distribuzione, oltre ai film che visualizzano l'attivo e passivo - estrazione (le estrazioni processi basati su acqua).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig1.jpg"> Figura 1 : Panoramica generale della acqua-base floreale estrarre analisi biologica (FE). Questa analisi è stata utilizzata per gli estratti floreali acquatiche con fiori del mirtillo e del mirtillo rosso: active -floreale estratti (attivo-FE), estratti di passivo -floreale (passare-FE) ed il deflusso dell'acqua piovana floreale (rw-FE). Il - FE porzione costituisce in genere il fattore sperimentale/variabile. Al contrario il - FE porzione può rimanere costante e post-inoculazione punti/ore di tempo possa essere valutato. Preferenza è stato fatto verso 4 analisi di campo a 200 ingrandimenti. Abbreviazioni: Acqua deionizzata Sterile, SDW; Superficie per campo di vista, A. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig2.jpg"> Figura 2 : Panoramica generale di cloroformio-based floreale estrarre analisi biologica (ch-FE). Questa analisi è stata utilizzata per mirtillo e cranberry (fiori, frutta e ovaie). Un solo tipo di miscela acquosa trattamento è stato usato per questo test, sospensione di spore parte 1 di 2 parti SDW (per mantenere la concentrazione conidial coerenti a causa dell'evaporazione ch-FE). Questo test può essere utilizzato per confrontare più ch-FE (cere da varie superfici delle piante), o più tempo punti/ore post-inoculazione utilizzando un singolo ch-FE. Abbreviazioni: Acqua deionizzata Sterile, SDW; Van Tieghem [vetro] cellule, VanT. cella. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig3.jpg"> Figura 3 : Confronto visivo del Colletotrichum fioriniae in presenza di acqua-base FE e ch-FE. In questo mirtillo saggio 'Bluecrop' (attivo-FE, base d'acqua) (fungina isolato: BB #10) e mirtillo rosso 'Stevens' basati su cloroformio (ch-FE) (fungina isolato: CB-PMAP182) estratti floreali sono stati confrontati ai comandi SDW. Un drammatico aumento secondario conidiation (anelli) e formazione di appressorium (punte di freccia) sono stati osservati durante il confronto di conidi in presenza di SDW (controllo) (A) per attivo-FE (B) al post-inoculazione 24h. Tuttavia, conidiation secondario non era così evidente quando si confrontano il controllo SDW analisi biologica di cloroformio (C) a ch-FE (D); piuttosto, la crescita di c. fioriniae spostata verso la formazione di appressorial. Mostrato è una risposta comune a ciascun tipo di estrazione acquosa e cloroformio-base, indipendentemente dalla specie ospite/floreale descritta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig4.jpg"> Figura 4 : Tempo-corso di studio (24 h) con Colletotrichum fioriniae in presenza di ch-FE. In questo test, un controllo SDW (A-D) e mirtillo rosso 'Stevens' ch-FE (E-F) sono stati ispezionati visivamente a 0, 6, 12 e 24 ore post-inoculazione (un esempio di punti di tempo variabile anziché confrontare più FE). Formazione Appressorium (punte di freccia) ha cominciato a 6 h a ch-FE e costantemente aumentato nel corso di intervalli di tempo successivi. Questo risultati sfugge ad un fattore importante della biologia dell'agente patogeno durante il periodo di fioritura: fiori riducono il tempo necessario per formare strutture di infezione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig5.jpg"> Figura 5 : Visualizzazione grafica dei dati raccolti utilizzando rw-FE in un'analisi biologica. Acqua piovana scappano di mirtillo rosso fiori (CB "Fiore" rw-FE) e acqua piovana Vergine che non aveva toccato qualsiasi tessuti di pianta del mirtillo rosso ("Terra" rw-FE) da un singolo evento di bagnatura plus un standard attivo, basato su acqua floreale Estratto di mirtillo rosso (CB attivo -FE) (controllo positivo) e SDW (controllo negativo) sono stati sottoposti ad un'analisi biologica di idropittura vetrino coprioggetti e valutati per la crescita di c. fioriniae . CB "Fiore" rw-FE ha avuto lo stesso livello di formazione secondaria di conidiation e appressorium come la standard CB attivo-FE al post-inoculazione di 24 h, che indica che i dispositivi di raccolta erano efficaci nel catturare floreali stimolanti rilasciati durante un bagnante-evento. Conidi totale è composto di primario (depositato), conidi e neonate conidi secondari. Le lettere indicano differenze significative a p &lt; 0,05 secondo almeno differenza significativa di Fischer prova (LSD); maiuscole, totale conidi; minuscolo, appressoria. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58880/58880fig6.jpg"> Figura 6 : Analisi biologica di mirtillo fenologia basato ch-FE, ispezione visiva. Gestione della malattia per frutta funghi di decomposizione spesso coinvolge applicazioni fungicida in fase di fioritura. Qui, mirtillo estratti basati su cloroformio (ch-FE) da più fasi di crescita di cranberry ('Stevens') sono stati valutati visivamente per l'effetto delle cere superficiali su c. fioriniae al post-inoculazione 24h. Ovaie raccolti nel mese di giugno (A), frutto immaturo raccolti in luglio e agosto (B, C), la frutta raccolta raccolti nel mese di ottobre (D), e un controllo SDW (E) sono stati ispezionati per la formazione di appressorial (punte di freccia). Ovaia ch-FE aveva la grandezza massima di formazione appressorial, indicando che questa pianta fenologia (bloom) è estremamente importante per il ciclo di vita di c. fioriniae. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 1" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig1.jpg"> Supplementare figura 1: infiorescenza mirtillo. Fiori del mirtillo sono stati raccolti per le estrazioni durante la piena fioritura (aprile-maggio in New Jersey, Stati Uniti d'America) (mostrate 'Bluecrop'). Si noti la sovrapposizione delle corolle/ovaie da fiori adiacente e l'architettura complessiva dell'infiorescenza rispetto ai supplementari figura 2 (mirtillo in posizione verticale). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 2" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig2.jpg"> Supplementare nella figura 2: mirtillo rosso montante. Fiori del mirtillo rosso sono stati raccolti per le estrazioni durante la piena fioritura (giugno-luglio nel New Jersey, Stati Uniti d'America) (mostrate 'Stevens'). Nota le fasi del fiore varia su una singola infiorescenza di mirtillo rosso (verticale) e l'uncinato, goccia d'acqua mantenendo la forma della corolla. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 3" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig3.jpg"> Supplementare nella figura 3: distribuzione di acqua piovana mirtillo (fiore). Completato il dispositivo di raccolta di acqua piovana floreale mirtillo, posizionato direttamente sotto un cluster delle infiorescenze. Nota il filo rivestito di plastica utilizzato per orientare verticalmente il dispositivo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 4" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig4.jpg"> Supplementare figura 4: distribuzione di acqua piovana mirtillo (stelo). Dispositivo di raccolta acqua piovana floreale completato mirtillo collocato a metà strada verso il basso lo stelo tra un'infiorescenza e la corona del bush. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 5" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig5.jpg"> Supplementare nella figura 5: distribuzione di acqua piovana mirtillo (corona). Completato il dispositivo di raccolta di acqua piovana floreale di mirtillo, posizionato alla base del bush (corona). Nota fili ricoperti in plastica possono essere rimosso se non necessario. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 6" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig6.jpg"> Supplementare figura 6: distribuzione di acqua piovana mirtillo (terra). Completato il dispositivo di raccolta di acqua piovana Vergine, piazzato accanto a cespugli di mirtilli. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 7" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig7.jpg"> Supplementare nella figura 7: distribuzione di acqua piovana del mirtillo rosso (primo piano). Completato dispositivo di raccolta di acqua piovana floreale del mirtillo rosso, con due montanti nascosti sotto i legami di cavo incrociato ordinatamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Supplemental Figure 8" src="/files/ftp_upload/58880/58880supfig8.jpg"> Supplementare figura 8: distribuzione di acqua piovana Cranberry. Multiplo completato dispositivi di mirtillo rosso floreale dell'acqua piovana distribuiti in una palude. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/58880supfig8large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Supplemental Movie 1" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie1.jpg"> Supplementare Movie 1: attivi a base di acqua, estratti floreali (attivo -FE). Supporto video supplementare come segue: 2.3-2.5.1. Fiori di 'Bluecrop' del mirtillo sono stati usati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/active-FEextraction.mp4" target="_blank">Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>
<img alt="Supplemental Movie 2" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie2.jpg"> Supplementare Movie 2: passiva, estratti floreali acquatiche (passare-FE). Supporto dei video supplementari seguenti passaggi 3.3-3.4. Fiori di 'Bluecrop' del mirtillo sono stati usati. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/pass-FEextraction.mp4" target="_blank">Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>
<img alt="Supplemental Movie 3" src="/files/ftp_upload/58880/58880supmovie3.jpg"> Supplementare Movie 3: distribuzione di dispositivi di raccolta di acqua piovana floreale del mirtillo rosso. Supporto video supplementare seguendo passo 6.4. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58880/rw-FEdeployment.mp4" target="_blank">Per favore clicca qui per vedere questo video. (Tasto destro per scaricare.)</a>

Qui, sono descritte le analisi biologiche progettate per monitorare lo sviluppo di un agente patogeno fungoso, Colletotrichum fioriniae, alla presenza di estratti di mirtillo o mirtillo rosso floreali su vetrini coprioggetti. Acqua-, cloroformio- e acqua piovana campo - base floreale estrazione tecniche sono dettagliate e spaccato di come queste informazioni possono essere applicate.

Colletotrichum fioriniae Sviluppo in acqua ed estratti floreali basati su cloroformio mirtillo e Cranberry

To accurately monitor the phenology of the bloom period and the temporal dynamics of floral chemical cues on fungal fruit rotting pathogens, floral ...

Questo protocollo fornisce un sistema economico e adattabile per valutare la dinamica temporale degli spunti fluorochimici sulle fiornie di Colletotrichum e su altri agenti patogeni vegetali che infettano il termine fioritura. I nuovi dispositivi di raccolta dell'acqua piovana per pavimenti consentono all'utente di monitorare stimolanti naturali e condizioni che influenzano lo sviluppo di agenti patogeni in modo quasi reale specifico del sito. Iniziare questa procedura con una cultura di Colletotrichum fiorniae da un host naturalmente infetto come descritto nel protocollo di testo.Quando le colonie iniziano a sporularsi, striature di conidia su un altro agar V 8 Juice contenente piatto di coltura cellulare per produrre una coltura sporulante ad alta densità. Dopo sette giorni di crescita, utilizzare un ciclo sterile standard per raccogliere una piccola quantità di conidia dalla coltura ad alta densità toccando leggermente l'anello alla massa conidiale. Mescolare questo in un tubo di centrifuga da 15 millilitri contenente 10 millilitri di acqua deionizzata sterile.Vortice questo campione per 10 secondi. Utilizzando una pipetta standard, immergersi su e giù numerose volte per mescolare ulteriormente il campione. Quindi posizionare una goccia del campione a vortice sull'emocitometro e stimare le concentrazioni di spore.Regolare la concentrazione a 0,1 milioni di conidia per millilitro di acqua distillata sterile con un volume finale di cinque millilitri. Questa è indicata come sospensione delle spore e viene effettuata solo immediatamente prima dell'uso in entrambi i test bio. Per eseguire l'estrazione floreale a base di cloroformio, pulire due volte tutti i componenti con il 95% di etanolo.Quindi pulire i componenti due volte con cloroformio per prevenire la contaminazione per ogni estrazione. Non pulire i tappi rivestiti in PTFE con cloroformio in quanto li danneggerà. Dopo la pulizia, mettere da parte i componenti per asciugare a testa in giù.Unire una parte di fiori lavorati a nove parti cloroformio in un becher aggiungendo fiori e quindi cloroformio. Ruotare delicatamente per 30 secondi e filtrare attraverso uno schermo in acciaio inossidabile nel secondo becher. Versare l'estratto a base di cloroformio dal secondo bicchiere nel tubo di coltura del vetro e apporre il cappuccio PTFE.Avvolgere il cappuccio con parafilm per evitare l'evaporazione. Conservare l'estratto floreale a base di cloroformio risultante nell'oscurità per ridurre la degradazione della luce a quattro gradi Celsius fino all'uso sperimentale. Ripetere le estrazioni con più campioni per fornire repliche.Per creare un dispositivo di raccolta per ogni posizione selezionata, utilizzate un bit di passo collegato a una pressa di perforazione per praticare un foro nella parte inferiore di una tazza di spruzzo. Quindi tagliare una linea retta dalla parte superiore del foro alla bocca della tazza spray. Ora pratica quattro fori equidistanti abbastanza grandi da infilare il filo rivestito di plastica alla bocca della tazza di spruzzatura.Fissare un'estremità dei fili rivestiti di plastica lasciando un'estremità libera. Praticare un foro abbastanza grande da infilare lo spray per vernice o l'adattatore per tazze in un coperchio del cappuccio della centrifuga da 50 millilitri. Sigillare i fili dell'adattatore con parafilm per evitare perdite.Attaccare questo sia al tappo di centrifuga che alla porzione filettata della tazza dello spruzzatore. Quindi attaccare il tubo di centrifuga accoppiato da 50 millimetri. Creare quattro dispositivi di raccolta per posizione di campionamento.Distribuisci i dispositivi in luoghi selezionati flettendo le tazze spruzzatori per adattarlo agli steli. Orientare il lato tagliato della tazza dello spruzzatore verso l'alto utilizzando i fili rivestiti di plastica attaccati ad altri steli. Ciò garantisce che l'acqua che passa sopra i fiori sia catturata.Per raccogliere l'acqua piovana dai fiori di mirtillo rosso, prima puntura di calore otto fori equidistanti intorno alla bocca dell'imbuto usando una sonda metallica. Inserire le fascette di torsione in quattro dei fori. Attaccare le altre estremità alla posizione opposta di quel foro formando un modello di incrocio pulito.Avvolgere l'imbuto a vapore con parafilm e mettere da parte. Praticare un foro abbastanza grande da inserire lo stelo incanalato in un tappo di centrifuga da 50 millilitri con un bit a gradini. Inserire l'imbuto preparato nel cappuccio della centrifuga.Dopo le precipitazioni o l'irrigazione aerea, rimuovere e sostituire la porzione del tubo inferiore del tubo di centrifuga. I tubi di raccolta dell'acqua piovana devono essere cambiati rapidamente dopo aver bagnato gli eventi in quanto sono soggetti a degradazione da contaminanti naturali mobilitati nel deflusso come batteri e altri funghi. Posizionare due strati di dischi di carta all'interno di piatti di coltura e immergere con due millilitri di acqua distillata sterile.Quindi, mescolare volumi uguali di acqua distillata sterile ed estratto floreale a base d'acqua in due tubi di microcentrifugo millilitro. Quindi aggiungere un volume uguale della sospensione spore ai due tubi di microcentrifugo a millilitro preparati. La preparazione risultante è indicata come una miscela di trattamento acquoso.Per il controllo, omettere la porzione di estratto floreale e sostituire con acqua distillata sterile per mantenere coerenti le concentrazioni conidiali. Ora posiziona le copertine di vetro pre-pulite sopra gli asciugamani di carta imbevuti all'interno del piatto di coltura cellulare. Posizionare una goccia da 40 microliter di miscela di trattamento acquoso al centro di un coverslip.Ripetere questa situazione per i trattamenti desiderati, incluso il controllo. Quindi chiudere il piatto di coltura cellulare. Una volta che tutti i trattamenti e le repliche sono stati dispensati, posizionare tutti i piatti di coltura cellulare replicati in un contenitore di plastica sigillato e incubare a 25 gradi Celsius al buio.Nei punti di tempo predeterminati, aggiungere 10 microlitri di un fissatore alle goccioline che fermano la crescita e semiconservano il supporto. Una volta aggiunto un fissatore, invertire attentamente i copripavimenti posizionando ciascuno di essi lato goccia su uno scivolo al microscopio di vetro per facilitare l'esame microscopico. Quando tutte le coverlips sono sugli scivoli del microscopio di vetro, lasciarle depositare e parzialmente asciugare nel cappuccio di flusso per 20 minuti.Conta tutte le conidie presenti sul coverslip tra cui conidia primaria, conidia germinata e conidia secondaria appena formata, così come appressoria. Lavorare a 400 volte l'ingrandimento o 200 volte per un'area di 3.808 millimetri quadrati. In una cappa a flusso laminare, aggiungere due volumi uguali di acqua distillata sterile e un volume di sospensione di spore a un tubo microcentrifugo a due millilitri.Mettere da parte questa miscela di trattamento acquoso per i biosaggi di estratto floreale a base di cloroformio. In una cappa aspirante, posizionare una cella Van T su una coverlip di vetro all'interno del piatto di coltura delle cellule di plastica preparato. Erogare 33 microlitri di estratto floreale desiderato a base di cloroformio al centro della cella e lasciare asciugare.Non toccare le pareti della cella. Per il trattamento di controllo, aggiungere cloroformio vergine. Una volta che l'estratto floreale a base di cloroformio si è asciugato, erogare 99 microlitri della miscela di trattamento acquoso preparata con una pipetta standard al centro della cella Van T.Quindi chiudere tutti i piatti di coltura cellulare e incubare. Nei punti di tempo predeterminata, aggiungere 15 microlitri di un fissatore alla cella Van T e lasciarlo riposare per almeno cinque minuti per garantire un'adeguata colorazione fungina. Dopo tale periodo, rimuovere con cura la cella Van T.Eseguire le fasi di inversione delle copertine e acquisizione dei dati come in precedenza. Dopo una valutazione microscopica delle C.fiorniae a 24 ore dopo l'inoculazione, il confronto della conidia in presenza di acqua distillata sterile rispetto all'estratto floreale a base d'acqua rivela un drammatico aumento della conidiazione secondaria e della formazione di appressorio. Tuttavia, la conidiazione secondaria non era così evidente quando si confrontava il saggio di bioassay cloroformio controllo sterile dell'acqua distillata con estratti a base di cloroformio.Piuttosto, la crescita della C.fiorniae si è spostata verso la formazione appressoriale. In questo saggio, un controllo sterile dell'acqua distillata e estrazioni floreali a base di cloroformio di mirtillo sono state ispezionate visivamente a zero, sei, 12 e 24 ore dopo l'inoculazione. La formazione di appressorium iniziò a sei ore nell'estratto floreale a base di cloroformio e aumentò costantemente nei successivi punti di tempo.Questo risultato supporta la scoperta che i fiori riducono il tempo necessario per formare strutture di infezione. La gestione delle malattie per i funghi in decomposizione della frutta spesso comporta applicazioni fungicide a tempo di fioritura. Qui, estratti a base di cloroformio di mirtillo rosso da più fasi di crescita del mirtillo rosso sono stati valutati visivamente per le cere superficiali efficaci su C.fiorniae a 24 ore dopo l'inoculazione.Le ovaie raccolte a giugno, i frutti immaturi raccolti a luglio e in agosto la frutta raccolta in ottobre e un controllo sterile dell'acqua distillata sono stati ispezionati per la formazione appressoriale. Gli estratti a base di cloroformio ovaio avevano la maggiore grandezza di formazione appressoriale che indicava l'importanza della fioritura nel ciclo di vita delle C.fiorniae. L'agente patogeno è il componente più importante di questo protocollo.I funghi devono essere spostati regolarmente su nuovi supporti per mantenere la coerenza tra le prove. Qualsiasi lavoro con cloroformio deve essere eseguito in una cappa aspirante per motivi di sicurezza. Ciò include la preparazione di materiali e vetreria, le procedure di estrazione e la conduttanza del saggio biologico a base di cloroformio.Combinazioni di punti temporali, agenti patogeni, raccolte floreali di acqua piovana o estrazioni ospiti possono essere utilizzate per valutare varie interazioni ospite-patogeno. I dispositivi di raccolta dell'acqua piovana e i relativi biosatti consentiranno ad altri di lavorare con stimolanti ospiti mobilitati durante gli eventi della pioggia in numerosi sistemi di percorso.

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Colletotrichum fioriniae Sviluppo in acqua ed estratti floreali basati su cloroformio mirtillo e Cranberry

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