Name: Analisi di efflusso di High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled colesterolo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-07T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Scopri un metodo cellulare per misurare l'efflusso di colesterolo in modelli di macrofagi utilizzando NBD-colesterolo fluorescente. Questa tecnica high-throughput su piastra 96 pozzetti offre una valutazione sicura del rischio cardiovascolare.

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Questo lavoro è stato parzialmente sostenuto da borse di studio la ricerca FIS (PS12/00866) dall'Instituto de Salud Carlos III, Madrid, Spagna; El di para di Fondo Europeo sviluppo regionale (FEDER); Red de Investigación en SIDA (RIS), ISCIII-RETIC (RD16/0025/0002) e CERCA programma / Generalitat de Catalunya. Gli autori ringraziano la Retrovirology e virale Immunopathology laboratorio di progetto l'Institut Investigacions agosto Pi I Sunyer (IDIBAPS). Ringraziamo Escribà T., c. Rovira e C. Hurtado per la loro assistenza e S. Cufí dalla conoscenza e dall'ufficio di trasferimento tecnologico per la sua guida nel proteggere l'invenzione.

Per questo studio, approvazione del comitato etico (Comitato Ètic d'Investigació Clínica, Hospital Clinic, Barcellona; numero di omologazione di HCB/2014/0756) e consenso informato scritto da tutti i soggetti sono stati ottenuti.
1. preparazione NBD-colesterolo
<ol><li>Sciogliere il NBD-colesterolo (MW 494.63; Vedi Tabella materiali) in etanolo puro per ottenere il brodo (2 mM). Per un flaconcino da 10 mg, sciogliere il contenuto di intero flaconcino in un volume di 10,1 mL di etanolo per ottenere uno stock di 2 mM.</li>
	<li>Diluire il NBD-colesterolo da stock in RPMI 1640 completati con 10% fetale bovino del siero e 5% penicillina/streptomicina (R10 medium) per raggiungere una concentrazione finale di 5 μM (ad es., ottenere 10 mL di NBD-colesterolo alla concentrazione finale di 5 μM) di diluire 25 μL di brodo NBD-colesterolo (2 mM) nel mezzo di R10. Questo volume è sufficiente per una piastra a 96 pozzetti.</li>
</ol>2. cellula di coltura e semina (2 ° giorno)
<ol><li>Cellule THP-1 e di cultura in mezzo R10 a 37 ° C, 5% CO2. Regolare a 0,3 x 106 cellule/mL ogni 3 giorni.</li>
	<li>Seme le cellule in una piastra a 96 pozzetti bianca con un fondo piatto e chiaro a 0,2 x 106 cellule/pozzetto in mezzo R10 (100 μL per pozzetto).</li>
	<li>Trattare le cellule con 100 nM phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA; da uno stock di 10 μM) per 48-72 h, incubazione a 37 ° C, 5% CO2 per differenziare THP-1 cellule in dmTHP-1. Nota: Si consiglia di utilizzare 5 μL di stock PMA (10 μM) in 500 μL di R10 medium. Prima di questo, preparare un 10 μM PMA brodo sciogliendo un flaconcino di liofilizzato 1 g in 10 mL di solfossido dimetilico (DMSO), aliquota e magazzino a-20 ° C.</li>
	<li>In alternativa (suggerimento) combinano passi 2.2 e 2.3 per migliore omogeneizzazione. Preparare 10 mL di cellule THP-1 in una provetta da 15 mL, aggiungere 200 µ l di brodo PMA (10 μM), mescolare delicatamente e immediatamente seme 100 μL per pozzetto sulla piastra. Incubare le cellule come descritto al punto 2.3.</li>
</ol>3. apolipoproteina B impoverito preparazione del siero (anime) (giorno 2 o 3)
<ol><li>Per preparare una soluzione di glicole polietilenico (PEG), diluire glicina in PBS 10% (con sterile H2O) a una concentrazione di 200 mM a pH 7,4. Aggiungere 40 mL di glicina di 200 mM a 10 g di PEG 8000 per ottenere PEG 20% (p/v). Miscelare la soluzione vigorosamente per omogeneizzare.</li>
	<li>Applicare 4 parti del 20% PEG per 10 parti di siero/plasma su ogni campione di siero/plasma in una provetta da 1,5 mL e lasciare la miscela sul ghiaccio per 25 min17 (ad esempio, per aggiungere 100 μL del plasma o siero, 40 μL di 20% PEG soluzione).</li>
	<li>Centrifugare il precipitato di PEG-apolipoproteina B a 13.000 x g per 15 min a 4 ° C.</li>
	<li>Eliminare il precipitato. Trasferire il surnatante in una nuova provetta. Nota: È consigliabile preparare le anime il giorno 3 (fresco). Se non è possibile, preparare le anime il giorno 2 e mantenerlo durante la notte a 4 ° C.</li>
</ol>4. NBD-colesterolo cellulare carico (giorno 2)
<ol><li>Scartare il terreno di coltura del dmTHP-1 e lavare le cellule due volte con 1x tampone fosfato salino (PBS).</li>
	<li>Caricare le celle con 5 μM NBD-colesterolo (100 μL per pozzetto) nel mezzo di R10 e incubare per una notte a 37 ° C, 5% CO2.</li>
</ol>5. incubazione con accettori di colesterolo (giorno 3)
<ol><li>Eliminare il terreno e lavare le cellule due volte con PBS.</li>
	<li>Incubare le cellule con 2 – 5% anime o la concentrazione desiderata di accettore di lipide purificato (HDL, ApoA, ApoE, ecc.) diluiti in incolore medium RPMI 1640 (100 μL per pozzetto) per 4-6 h a 37 ° C. Nota: Includere un controllo negativo (C-) costituito da incolore RPMI 1640 medium senza accettori e un controllo positivo (C +) (ad es., anime da un pool di donatori sani) o HDLs purificata. Nota che il controllo positivo si applica specialmente quando i campioni dei pazienti (condizioni di malattia) sono analizzati (complementare figura 1).</li>
	<li>Preparare un brodo di 200 mL della soluzione di lisi cellulare 1 (tampone Tris 50 mM, 150 mM NaCl, H2O). Mescolare il rapporto di soluzione 1 a 1:1 (v: v) di lisi delle cellule con etanolo puro per ottenere la soluzione di lisi 2.</li>
</ol>6. acquisizione segnale fluorescente (giorno 3)
<ol><li>
Rilevamento dei supporti NBD-colesterolo
	<ol>
<li>Rimuovere il mezzo di cella delle placche e raccoglierlo in una piastra a 96 pozzetti bianca nuova con un fondo piatto opaco.</li>
		<li>Per un rilevamento del segnale di fluorescenza ottimale nei campioni media, aggiungere 100 μL di etanolo puro al 100 μL di ciascun campione medio per ottenere un rapporto di 1:1 della piastra 96 pozzetti bianco.</li>
		<li>Tenere la piastra con i media trattati per ulteriore misura l'intensità della fluorescenza (FI) alla lunghezza d'onda di nanometro (eccitazione/emissione) 463⁄536 il luminometro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Rilevamento di NBD-colesterolo intracellulare
	<ol>
<li>Lavare le cellule due volte con PBS.</li>
		<li>Per ottenere il colesterolo intracellulare, lisare le cellule di incubarle con 100 μL di soluzione di lisi 2 per pozzetto e scuotere la piastra a temperatura ambiente (TA) per 25 min.</li>
		<li>Per catturare un rilevamento del segnale di fluorescenza ottimale nei campioni lysate delle cellule, l'intensità della fluorescenza dei lisati cellulari nello stesso bianco piastra a 96 pozzetti con fondo trasparente piatto (nello stesso piatto in cui le cellule sono state seminate nel passaggio 2.2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>6.3 misura l'intensità di fluorescenza (FI) sul luminometro regolando il parametro di sensibilità a 50 nel software (Vedi Tabella materiali).</li>
</ol>7. Risultati analisi
<ol><li>Esprime la quantità di efflusso di colesterolo di un campione come percentuale calcolata con la formula: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58891/58891eq1.jpg">
</li>
	<li>Ottenere la misura finale di efflusso di colesterolo (CE) sottraendo il CE del controllo negativo (campione caricato con NBD-colesterolo ma incubate con medium RPMI 1640 incolore, senza accettori di colesterolo) dalla CE di un dato esempi: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/58891/58891eq2.jpg">
</li>
</ol>

<ol><li>The top 10 causes of death. , Available from:
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<li>Hansson, G. K., Hermansson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+immune+system+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">The immune system in atherosclerosis.</a> Nature Immunology. 12 (3), 204-212 (2011).</li>
<li>Libby, P., Ridker, P. M., Hansson, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+and+challenges+in+translating+the+biology+of+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Progress and challenges in translating the biology of atherosclerosis.</a> Nature. 473 (7347), 317-325 (2011).</li>
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<li>Greaves, D. R., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunity%2C+atherosclerosis+and+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunity, atherosclerosis and cardiovascular disease.</a> Trends Immunol. 22, (2001).</li>
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</ol>

Gli autori desiderano dichiarare che essi sono gli inventori della domanda di brevetto (EPO; 18382337.6-1118; 17 maggio 2018) dal titolo "Metodo per la determinazione di efflusso di colesterolo" basato su questo metodo.

Fluorescenti-etichettati colesterolo è una strategia promettente per analizzare e studiare le proprietà e il metabolismo del colesterolo naturale in vitro. I suoi principali vantaggi sono che può essere preso dalle cellule, permette per intracellulare e gli studi di distribuzione di membrana e può essere applicato a dosaggi efflusso di colesterolo come in questo protocollo (Figura 7). Alcuni steroli fluorescenti-etichettati consentono colesterolo monitoraggio in vitro BODIPY-colesterolo, col...

Secondo l'organizzazione mondiale della sanità, le correnti principali cause di morte nel mondo sono la cardiopatia ischemica e ictus (contabilità per un totale di 15,2 milioni di morti)1. Entrambe sono malattie cardiovascolari (CVD) che possono essere precedute da aterosclerosi e la rottura delle placche di ateroma nei vasi sanguigni2,3.
L'aterosclerosi è una malattia infiammatoria parete vaso in cui i macrofagi, linfociti T, mastociti e cellule dendritiche infiltrano l'endotelio e si accumulano dal sangue, alla fine formano placche aterosclerotiche. Le placche aterosclerotiche presentano un lipide cristalli core e colesterolo, evidenziati da misure di ecografia B-mode ad alta risoluzione della carotide intima media spessore4,5. Nei macrofagi, efflusso di colesterolo verso particelle lipidiche accettore è effettuato con mezzi dei recettori ATP-binding cassette (ABC) ABCA1, membro sottofamiglia G trifosfato di adenosina 1 (ABCG1) e il recettore scavenger SR-BI. Lo squilibrio del colesterolo afflusso e deflusso nei macrofagi è considerato un processo chiave nella aterosclerosi iniziazione6. Efflusso di colesterolo è considerata un passo fondamentale nell'eliminazione del colesterolo dal tessuto periferico al plasma e nel fegato in un processo chiamato trasporto inverso del colesterolo (RCT). Colesterolo viene trasferito dai macrofagi principalmente ad apolipoproteina A1 (ApoA1) presenti sulla superficie delle particelle della lipoproteina ad alta densità (HDL). HDL trasportano quindi il colesterolo al fegato per escrezione e reimpiego7,8,9.
Tradizionalmente, colesterolo radiomarcato trizio (3H) è stato utilizzato in efflusso di colesterolo10. Il segnale di emissione dei radioisotopi è altamente sensibile10; Tuttavia, il colesterolo radiomarcato presenta evidenti svantaggi quali protocolli lunghi, rischio di esposizione a radiazioni ionizzanti e la necessità speciali radioattività strutture e attrezzature garantire l'uso sicuro dell'emissione radioattiva. Al contrario, fluorescenza è stato integrato con successo nelle tecniche diagnostiche grazie alla sua semplicità nella rilevazione del segnale fluorescente, l'ampia varietà di fluorofori disponibili e relativi di sicurezza11. Diversi steroli fluorescenti-etichettati sono stati usati per studiare il metabolismo del colesterolo compreso dehydroergosterol (con fluorescenza intrinseca), colesterolo di dansile, 4,4-difluoro-3a, 4adiaza-s-indacene (BODIPY) - colesterolo e 22-(N-(7- Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-Bisnor-5-cholen-3β-OL (NBD-colesterolo). In particolare, NBD-colesterolo presenta un assorbimento efficiente in cellule umane12. Due differenti NBD etichettati-colesterolo sono attualmente disponibili: 22-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-23,24-bisnor-5-cholen-3b-ol (22-NBD) e 25-(N-[(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)-methyl]amino)-27-norcholesterol (25-NBD; Figura 1). Colesterolo etichettato con parte 22-NBD soddisfino al meglio gli studi di efflusso di colesterolo, mentre 25-NBD-colesterolo pricipalmente è utilizzato nella membrana cellulare dinamica ricerca13,14.
Le linee cellulari in genere utilizzate nelle analisi di efflusso di colesterolo in vitro sono cellule monocito-come ad esempio cellule THP-1 leucemia-derivate essere umano, murino 264,7 cellule15o J774.1. Tutte queste cellule possono essere differenziate in macrofagi in vitro facendo uso di phorbol 12-myristate 13-acetato (PMA), ma THP-1-macrofagi derivati (dmTHP-1) migliori riflettono e imitano i macrofagi umani16.
Nello studio presente, abbiamo ottimizzare e standardizzare un metodo di alto-rendimento fluorescente per determinare la capacità di efflusso di colesterolo di campioni di siero su dmTHP-1, utilizzando 22-NBD-colesterolo come alternativa a [3H]-colesterolo. Inoltre, mettiamo a confronto la tecnica fluorescente ottimizzata con l'analogico standard radioattivo.

<table><tbody><tr><td>Piastra di raccolta a 96 pozzetti</td><td>Corning Inc Costar</td><td>3912</td><td>bianca Piastra a 96 pozzetti con fondo trasparente opaco</td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Corning Inc</td><td>Costar 3610</td><td>bianca Piastra a 96 pozzetti con fondo piatto e trasparente</td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio dell'efflusso del colesterolo (basato su cellule)</td><td>Abcam</td><td>ab196985</td><td>Commercial Kit di analisi cellulare ad alto rendimento ad alto rendimento volto a determinare il efflusso di colesterolo</td></tr><tr><td>incolore RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7509</td><td>RPMI 1640 senza pehnol-red</td></tr><tr><td>Gen5 Software di analisi dei dati</td><td>BioTek</td><td></td><td>Versione 2.0</td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8790-100G</td><td>Glicina, uso non animale</td></tr><tr><td>Luminometro</td><td>Biotek</td><td>SYNERGY HT</td><td>Multi-Detection Microplate</td></tr><tr><td>Reader Lisi Soluzione 1</td><td></td><td></td><td>50 mM di tampone Tris, 150 mM di NaCl e H2O</td></tr><tr><td>Soluzione di lisi</td> 2 <td>in-house</td><td></td><td>Soluzione di etanolo puro e lisi cellulare 1:1 (v:v)</td></tr><tr><td>NBD-colesterolo</td><td>Thermo-Fisher</td><td>N1148</td><td>22-(N-(7-Nitrobenz-2-Oxa-1,3-Diazol-4-il)Ammino)-23,24-Bisnor-5-Cholen-3&beta;-Ol</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td>Fosfato-tamponato&nbsp; soluzione salina</td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>202452-250G</td><td>polietilenglicole</td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>79346</td><td>Phorbol 12-merystate B-acetato.</td></tr><tr><td>R10</td><td>RPMI</td><td>1640 integrato con il 10% di siero fetale bovino e il 5% di penicillina/streptomicina.</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td>RPMI 1640 con 2 mM di L-glutammina contenente 1,5 g/L di bicarbonato di sodio e 4,5 g/L</td></tr><tr><td>di glucosio di cellule THP-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ATCC, #TIB-202</td><td>linea simile a monociti derivata dalla leucemia di un bambino di un anno</td></tr><tr><td>di età Tween 80</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1754</td><td></td></tr></tbody></table>

analisi di efflusso di high-throughput nitrobenzoxadiazole-labeled colesterolo

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Aterosclerosi conduce alla malattia cardiovascolare (CVD). Non è ancora chiaro se la concentrazione di colesterolo-HDL (cHDL) ha un ruolo causale nello sviluppo di aterosclerosi. Tuttavia, un fattore importante nelle prime fasi della formazione di placche di ateroma è capacità di efflusso di colesterolo di HDL (la capacità delle particelle di HDL di accettare di colesterolo dai macrofagi) al fine di evitare la formazione delle cellule della gomma piuma. Si tratta di un passaggio chiave nella evitando l'accumulo di colesterolo nell'endotelio e una parte del trasporto inverso del colesterolo (RCT) per eliminare il colesterolo attraverso il fegato. Capacità di efflusso di colesterolo di siero o plasma in modelli cellulari del macrofago è uno strumento promettente che può essere utilizzato come biomarcatore per aterosclerosi. Tradizionalmente, [3H]-colesterolo è stato utilizzato nelle analisi di efflusso di colesterolo. In questo studio, puntiamo a sviluppare una strategia più sicura e veloce utilizzando fluorescente etichettati-colesterolo (colesterolo-NBD) in un'analisi cellulare per rintracciare il processo di assorbimento e di efflusso di colesterolo in macrofagi derivati THP-1. Infine, ottimizzare e standardizzare la metodica di efflusso di colesterolo-NBD e sviluppare un'analisi di alto-rendimento utilizzando piastre da 96 pozzetti.

Il dosaggio di efflusso di colesterolo mira a determinare in vitro la capacità di efflusso di colesterolo di un dato del siero, il plasma o il supernatante contenente particelle di HDL. Il metodo consiste di caricamento etichettati-colesterolo in una cultura di una linea cellulare del macrofago standard e inducendo il contatto con il campione di prova diluito in media FBS-liberi con le cellule. Infine, i livelli fluorescenti dal NBD sono misurati nei media e lysate delle cellule. Per ottimizzare le misure, il effluxed di...

Misurazione della capacità di efflusso di colesterolo in vitro di siero o plasma in modelli cellulari del macrofago è uno strumento promettente come biomarcatore per aterosclerosi. Nello studio presente, abbiamo ottimizzare e standardizzare un metodo di efflusso di colesterolo-NBD fluorescente e sviluppare un'analisi di alto-rendimento utilizzando piastre da 96 pozzetti.

Analisi di efflusso di High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled colesterolo

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

Questo protocollo è il nostro metodo a base cellulare per la terminazione del colesterolo del reflusso di colesterolo nel plasma ceramico. Soprattutto nelle proiezioni. Questo può essere applicato per diagnosticare il rischio cardiovascolare e per identificare o valutare il mantenimento del colesterolo più basso.Questa tecnica evita il rischio e gli oneri in quanto la sicurezza con la manipolazione di materiali irradiati fornendo risultati con livelli di qualità comparabili, a quelli del reflusso di colesterolo è stato segnalato per associarsi a Così, il reflusso plasmatico o colesterolo ceramico di accettato può essere confrontato, al nostro controllo di riferimento e può fornire il rischio di soffrire di Questo metodo sarà applicato anche alle linee cellulari , come altre linee cellulari umane o anche fasi macro primarie. Macro fasi o e cellule staminali a pulsante spray indotte dall'uomo. Per iniziare questa procedura, sciogliere il colesterolo NPD in etanolo puro per ottenere una soluzione stock con una concentrazione finale di due micromolari.Diluire 25 microlitri dello stock di colesterolo NBD nel mezzo AR 10 per raggiungere una concentrazione finale di cinque micromolari. Coltura thp-1 cellule nel nostro mezzo 10 a 37 gradi celsius con 5% di anidride carbonica. Ogni tre giorni regolare la densità cellulare a 300000 cellule per millilitro.Quindi ottenere una piastra da 96 po 'con un fondo piatto e chiaro. Per una migliore omogeneizzazione, preparare 10 millilitri di cellule thp-1 in un tubo da 15 millilitri e aggiungere 200 microlitri di materiale PMA. Mescolare delicatamente e seminare 100 microlitri della miscela nei pozzi piastra a 200.000 cellule per pozzo.E incubare a 37 gradi celsius con 5% di anidride carbonica per 48-72 ore per differenziare le cellule thp-1 in cellule DM thp-1. Prima diluire la glicina nel 10%PBS con acqua sterile, ad una concentrazione di 200 micromolari a pH 7,4. Aggiungere 40 millilitri di glicina diluita a 10 grammi di piolo 8000 per preparare una soluzione di peg del 20% e mescolare vigorosamente per omogeneizzare.Successivamente applicare quattro parti del 20% per 10 parti del campione su ciascun siero o campione di plasma in un tubo da 1,5 ml. Lasciare la miscela sul ghiaccio per 25 minuti. Centrifugare il piolo apolipoproteina B precipitato a 13000 volte G, e a quattro gradi celsius per 15 minuti.Scartare il precipitato e trasferire il supernatante su un nuovo tubo. Recuperate la piastra contenente le celle thp-1 differenziate. Rimuovere e scartare il supporto di coltura, quindi lavare le celle due volte con 1X PBS.Aggiungere 100 microlitri di colesterolo MVD micromolare in ar-10 medio ad ogni pozzo. Incubare durante la notte a 37 gradi celsius con 5% di anidride carbonica. Il giorno dopo scartare, scartare il mezzo.Lavare le cellule due volte con PBS, quindi aggiungere 100 microlitri ABDS, o accettore lipidico purificato diluito in rpmi 1630 medio alla concentrazione desiderata ad ogni pozzo. Includere un controllo negativo che non contenga accettori di colesterolo in un controllo positivo, come delineato nel protocollo di testo, e incubare a 37 gradi celsius per quattro o sei ore. Nel frattempo, preparare uno stock di 200 millilitri di soluzione di lysis cellulare uno come delineato nel testo.Mescolare questa soluzione con l'etanolo, ad un rapporto volumetrico uno a uno per ottenere anche la soluzione di lisi. Per il rilevamento del colesterolo media e BD, rimuovere il mezzo cellulare dalle piastre raccolte in una nuova piastra bianca da 96 po 'con un fondo piatto opaco. Aggiungere 100 microlitri di etanolo puro a 100 microlitri di ogni campione medio per ottenere un rapporto uno a uno nella nuova piastra.Usando un illuminometro, misurare l'intensità del fluorescente ad un'eccitazione di 463 nanometri e un'emissione di 536 nanometri. Per il rilevamento del colesterolo NBD intracellulare, lavare le cellule due volte con PBS. Aggiungere anche 100 microlitri di soluzione di lisi ad ogni pozzo e incubare a temperatura ambiente, tremando per 25 minuti.Successivamente, misurare l'intensità del fluorescente regolando il parametro di sensibilità a 50 nel software. Quindi determinare il tasso di efflusso del colesterolo nella misura finale dell'efflusso di colesterolo come delineato nel protocollo di testo. Diluire il colesterolo NBD in etanolo puro produce i più alti valori di intensità fluorescente mentre un alto contenuto in soluzione acquosa, abbassa l'intensità.Ciò suggerisce che l'emissione fluorescente di questa molecola è altamente dipendente dal mezzo, in cui è contenuta. Quando si utilizza una miscela di media ed etanolo ad un rapporto uno a uno, l'intensità del fluorescente sembra aumentare proporzionalmente, con una concentrazione dell'analogo del colesterolo, suggerendo che la sonda si sta comportando in modo appropriato in queste condizioni. Per determinare la quantità di tempo necessaria per incubare le cellule caricate con accettori di colesterolo, il supporto cellulare viene raccolto in diversi punti di tempo.L'efflusso del colesterolo si è evoluto linearmente da zero a sei ore, con il segnale massimo catturato sei ore dopo l'aggiunta di ABDS alle cellule. La soglia di saturazione e l'intervallo dinamico vengono testati misurando l'efflusso di colesterolo a diverse percentuali di supporti contenenti HDL. Nell'asset ad alta produttività, l'efflux si evolve linearmente da uno al 7%ABDS, raggiungendo il picco della capacità di efflusso del colesterolo al 7%A concentrazioni superiori al 7% l'intensità del fluroescente diminuisce in una relazione inversa con la percentuale ABDS.Le prestazioni del metodo basato sulla fluorescenza vengono quindi valutate confrontandolo con la tecnica standard con etichetta radio. Entrambe le tecniche sono altamente correlate quando si utilizzano diverse concentrazioni di ABDS. Il metodo descritto è sensibile ad un aumento delle concentrazioni di accettori all'interno dei valori di efflusso del colesterolo tra il cinque e il 15%È importante assicurarsi che il celluarizer non contenga aggregati.Il punto critico è quello di classificare un etanolo aggregato contenente ambiente, per misurare la fluorescenza in un peso omogeneo e ottimale. Seguendo questa procedura, è possibile misurare il colesterolo tecnico del nome e determinare l'effetto dei farmaci nella via dell'efflusso del colesterolo. Anche la scuola alla fine viene utilizzata come diagnostica per valutare il rischio cardiovascolare.Riteniamo che questo metodo sia molto più facile e sicuro del metodo dello standard radioattivo. Tuttavia è ancora dipendente dalla cella. Si prega di ricordare che l'etanolo è infiammabile e deve essere conservato e maneggiato di conseguenza.

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Il saggio del colesterolo è progettato per quantificare il tasso di efflusso colesterolo da cellule coltivate e la capacità di plasma accettori di accettare il colesterolo rilasciato dalle cellule. Il saggio è costituito da cellule con l'etichettatura del colesterolo, del colesterolo equilibrio tra le piscine e il rilascio intracellulare del colesterolo ad un accettore extracellulare.

Efflusso test Colesterolo

I proteoliposomi vengono utilizzati per studiare canali purificati e trasportatori ricostituiti in un ambiente biochimico ben definito. Viene illustrata una procedura sperimentale per misurare l'efflusso mediato da queste proteine. Vengono descritti i passaggi per preparare i proteoliposomi, eseguire le registrazioni e analizzare i dati per determinare quantitativamente le proprietà funzionali della proteina ricostituita.

A Proteoliposome-Based Efflux Assay per determinare le proprietà singola molecola di Cl<sup&gt; -</sup&gt; Canali e trasportatori

Descriviamo qui un'analisi fluorometrica senza cellula biochimica per la determinazione di HDL-perossidazione lipidica. Questo test rapido e riproducibile può essere utilizzato per determinare la funzione di HDL in studi su larga scala e può contribuire alla nostra comprensione della funzione di HDL nella malattia umana.

Analisi enzimatica fluorometrica cell-free biochimico per la misura di High-throughput di perossidazione lipidica in lipoproteina ad alta densità

L'obiettivo di questo studio era di valutare in vitro riduzione dei lipidi droga effetti nel modulare la morfologia delle particelle di colesterolo. Confronto di farmaci ipolipemizzanti rivelato variazioni nel loro effetto nel modulare le caratteristiche morfologiche delle particelle di colesterolo.

Effetti differenziali di farmaci ipolipemizzanti nella modulazione della morfologia delle particelle di colesterolo

Questo protocollo fornisce un approccio efficiente per misurare l'assorbimento del colesterolo di LDL con tariffe afflusso in tempo reale utilizzando una cellula viva imaging system in vari tipi cellulari. Questa tecnica fornisce una piattaforma per schermare l'attività farmacologica dei composti che interessano l'afflusso di LDL durante il monitoraggio per la morfologia delle cellule e quindi potenziale citotossicità.

Analisi di assorbimento di colesterolo LDL utilizzando Live Cell Imaging analisi con cella di monitoraggio dello stato

Presentato qui è un saggio di fluorescenza sensibile per monitorare l'attività dell'apolipoproteina N-aciltransferasi utilizzando il peptide diacilglicerile e gli alchino-fosfolipidi come substrati con click-chemistry.

Saggio fluorometrico basato sulla chimica dei clic per l'apolipoproteina N-aciltransferasi dalla caratterizzazione enzimatica allo screening ad alta produttività

Questo protocollo descrive in dettaglio un test in vitro per misurare l'assorbimento lipidico cellulare nelle cellule endoteliali dopo stimolazione con analoghi fluorescenti BODIPY-C12 e BODIPY-C16 di acidi grassi saturi a catena lunga e molto lunga. Questo metodo è efficiente e adattabile ad altri tipi di cellule, offrendo un approccio utile per lo studio del metabolismo dei lipidi.

Quantificazione dell'assorbimento endoteliale degli acidi grassi mediante analoghi fluorescenti degli acidi grassi

In questo articolo, descriviamo i protocolli per misurare la quantità di fosfolipide fluorescente specificamente rimosso dalle particelle del donatore di lipidi mediante lipoproteine ad alta densità (HDL) presenti nell'intero plasma umano o nel siero. Abbiamo dimostrato che questa metrica della funzionalità HDL predice la malattia cardiovascolare incidente.

Saggio di efflusso fosfolipidico specifico per lipoproteine ad alta densità

Un elevato throughput, piattaforma automatizzata di sviluppo delle cellule linea di produzione per la produzione di proteine ​​terapeutiche è descritto. Implementazione di Cell BD FACS sorter Aria, CloneSelect Imager e TECAN Libertà sistema di movimentazione EVO liquido ha dimostrato capacità di elaborazione significativamente aumentata in linea con lo sviluppo delle cellule migliore qualità linea cellulare e alta riproducibilità.

A High-throughput piattaforma automatica per lo sviluppo di linee cellulari di produzione per Therapeutics Proteine

La tecnica di dissezione illustra enucleazione dell'occhio mouse per il fissaggio del tessuto per eseguire fenotipizzazione in alto throughput schermi.

Mouse enucleazione degli occhi per Remote ad alta velocità Fenotipizzazione

Scopri un metodo cellulare per misurare l'efflusso di colesterolo in modelli di macrofagi utilizzando NBD-colesterolo fluorescente. Questa tecnica high-throughput su piastra 96 pozzetti offre una valutazione sicura del rischio cardiovascolare.

Analisi di efflusso di High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled colesterolo

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