Name: Liposoma singole misurazioni per lo studio degli enzimi di membrana Proton-pompaggio usando microscopia fluorescente ed elettrochimica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 15 s
Description: Scopri il trasporto di protoni negli enzimi di membrana come il citocromo bo 3 usando liposomi singoli, elettrochimica e microscopia a fluorescenza. Questo metodo consente il controllo in tempo reale delle reazioni enzimatiche.

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Gli autori riconoscono la BBSRC (BB/P005454/1) per il sostegno finanziario. NH è stato finanziato dal programma VILLUM Foundation Young Investigator.

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<li>García-Sáez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+molecule+techniques+for+the+study+of+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Single molecule techniques for the study of membrane proteins.</a> Applied Microbiology and Biotechnology. 76 (2), 257-266 (2007).</li>
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<li>Rigaud, J. L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%3A+application+to+energy-transducing+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22BBA+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> BBA - Bioenergetics. 1231 (3), 223-246 (1995).</li>
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<li>Mazurenko, I., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMazurenko%2C+I+%22Timelapse+%28movie%29+of+single+vesicles+fluorescence+change+upon+potential+application%22">Timelapse (movie) of single vesicles fluorescence change upon potential application</a>. , (2018).</li>
<li>Li, M., Khan, S., Rong, H., Tuma, R., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+membrane+curvature+and+pH+on+proton+pumping+activity+of+single+cytochrome+bo3enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Bioenergetics%22%5BJournal%5D)">Effects of membrane curvature and pH on proton pumping activity of single cytochrome bo3enzymes.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics. 1858 (9), 763-770 (2017).</li>
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<li>Eriksson, E. K., Agmo Hernández, V., Edwards, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+ubiquinone-10+on+the+stability+of+biomimetic+membranes+of+relevance+for+the+inner+mitochondrial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+-+Biomembranes%22%5BJournal%5D)">Effect of ubiquinone-10 on the stability of biomimetic membranes of relevance for the inner mitochondrial membrane.</a> Biochimica et Biophysica Acta - Biomembranes. 1860 (5), 1205-1215 (2018).</li>
<li>Seneviratne, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reconstitution+method+for+integral+membrane+proteins+in+hybrid+lipid-polymer+vesicles+for+enhanced+functional+durability%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A reconstitution method for integral membrane proteins in hybrid lipid-polymer vesicles for enhanced functional durability.</a> Methods. , 1-8 (2018).</li>
<li>Veshaguri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+proton+pumping+by+a+eukaryote+P-type+ATPase%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct observation of proton pumping by a eukaryote P-type ATPase.</a> Science. 351 (6280), 1-6 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Il metodo descritto è adatto per studiare protone pompaggio di proteine di membrana respiratoria che possono essere ricostituite in liposomi e sono in grado di scambiare elettroni con lo stagno del chinone. Protone attività di pompaggio può essere monitorato a livello di singolo-enzima utilizzando coloranti sensibili al pH (raziometrici) incapsulati nel lume liposoma (Figura 1A).
Il metodo si basa sulla capacità di ubiquinone (o altri chinoni), incorporato nel bil...

Informazioni sui meccanismi degli enzimi e cinetica sono ottenuti solitamente al livello ensemble o macroscala con popolazione di enzima in migliaia a milioni di molecole, dove misure rappresentano una media statistica. È noto, tuttavia, che le macromolecole complesse quali enzimi possono dimostrare eterogeneità nel loro comportamento e osservati a livello di insieme di meccanismi molecolari non sono necessariamente validi per ogni molecola. Tali deviazioni sulla scala singola molecola sono stati ampiamente confermati da studi di singoli enzimi con una varietà di metodi emergenti durante l'ultimo ventennio1. In particolare, rilevazione della fluorescenza di attività enzimatica individuale è stato utilizzato per indagare eterogeneità di enzimi attività2,3 o scoprire l'effetto della cosiddetta memoria (periodi di attività di enzimi elevati è riuscito da periodi di bassa attività e viceversa)4,5.
Molti studi di singolo enzima richiedono che gli enzimi sono immobilizzati sulla superficie o nello spazio fisso in un altro modo per rimanere sufficientemente lunga nel campo visivo per osservazione continua. Incapsulamento di enzima nei liposomi è stato indicato per attivare immobilizzazione degli enzimi, evitando qualsiasi impatto negativo dovuto la superficie-enzima o proteina-proteina, interazioni6,7. Inoltre, liposomi offrono una possibilità unica per lo studio di proteine di membrana singola nel loro naturale dei lipidi bilayer ambiente8,9,10.
Una classe di proteine di membrana, trasportatori, esercita uno spostamento direzionale di sostanze attraverso la membrana cellulare, un comportamento che può essere studiato solo quando proteine sono ricostituite in lipidi bilayer (ad es., liposomi)11, 12,13. Ad esempio, traslocazione protonica, esibito da parecchi enzimi delle catene di trasporto dell'elettrone procariote ed eucariote, svolge un ruolo importante nella respirazione cellulare, creando una Forza Protonomotrice utilizzata per la sintesi di ATP. In questo caso, il protone attività di pompaggio è accoppiato per il trasferimento di elettroni, anche se il meccanismo dettagliato di questo processo spesso resta sfuggente.
Recentemente, abbiamo dimostrato la possibilità di rilevazione fluorescente coppia con elettrochimica per studiare protone pompaggio attività di singoli enzimi dell'ossidasi terminale ubiquinol di Escherichia coli (citocromo bo3) ricostituiti nei liposomi14. Questo è stato ottenuto mediante incapsulamento di un colorante fluorescente membrana impermeabile pH sensibili nel lumen di liposomi preparato da E. coli lipidi polari (Figura 1A). La quantità di proteina è stata ottimizzata in modo che maggior parte dei liposomi o contenuto nessuna o solo una molecola di enzima ricostituito (secondo la distribuzione di Poisson). I due substrati del citocromo bo3 sono stati forniti da aggiungere alla miscela di lipidi che formavano i liposomi e ossigeno (ambientale) in soluzione ubichinone. I liposomi sono quindi scarsamente adsorbiti su elettrodo d'oro ultra-liscio semi-trasparente, coperto con un monostrato auto-assemblato di 6-mercaptohexanol. Infine, l'elettrodo è montato sulla parte inferiore di una cella di Spettroelettrochimica semplice (Figura 1B). Elettrochimico controllo dello stato redox chinone piscina permette uno per attivare in modo flessibile o per fermare la reazione enzimatica in qualsiasi momento, mentre la tintura di pH sensibili viene utilizzata per monitorare le variazioni del pH all'interno del lume dei liposomi come conseguenza di spostamento di protoni dalla enzimi. Utilizzando che l'intensità di fluorescenza di un colorante fluorescente in secondo luogo, associati a lipidi, la dimensione e il volume dei liposomi individuali può essere determinato e così la quantificazione del protone di enzima attività di pompaggio. Utilizzando questa tecnica, abbiamo trovato in particolare che il citocromo bo3 molecole sono in grado di entrare in uno stato di perdita spontanea che si dissolve rapidamente la forza motrice protonica. L'obiettivo di questo articolo è quello di introdurre la tecnica delle misurazioni singole liposoma in dettaglio.

<table><tbody><tr><td>6-Mercapto-1-esanolo (6MH)</td><td>Sigma</td><td>451088</td><td>97%</td></tr><tr><td>8-idrossipirene-1,3,6-acido trisolfonico (HPTS)</td><td>BioChemika</td><td>56360</td><td></td></tr><tr><td>Supporto in alluminio (cella elettrochimica)</td><td>Su</td><td></td> misura <td>30x30x7 mm; diametro interno: 26 mm; diametro foro: 15 mm</td></tr><tr><td>Elettrodo</td><td></td><td></td> ausiliario <td>filo di platino</td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>VWR Sostanze chimiche</td><td>83627</td><td></td></tr><tr><td>E.coli lipidi polari</td><td>Avanti</td><td>100600C</td><td>25 mg/mL in cloroformio</td></tr><tr><td>Epossidico</td><td>EPO-TEK</td><td>301-2FL</td><td>epossidico a bassa fluorescenza</td></tr><tr><td>Fiji (ImageJ 1.52d)</td><td></td><td></td><td>Plugin richiesti: StackReg e TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)</td></tr><tr><td>Filter cube ("ATTO633")</td><td>Chroma Technology Corporation</td><td></td><td>Es: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm</td></tr><tr><td>Cubo filtrante ("HPTS1")Chroma</td> <td>Technology Corporation</td><td></td><td>Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td></tr><tr><td>Cubo filtrante ("HPTS2")Chroma</td> <td>Technology Corporation</td><td></td><td>Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm</td></tr><tr><td>Cubo filtro ("Texas Red")Chroma</td> <td>Technology Corporation</td><td></td><td>Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm</td></tr><tr><td>Lipidi marcati con colorante fluorescente (FDLL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T1395MP</td><td>TexasRed-DHPC è stato utilizzato in questo lavoro (&lambda; exc 595 nm; &lambda; em 615 nm)</td></tr><tr><td>Lipidi marcati con colorante fluorescente (FDLL) (alternativa)</td><td>ATTO-TEC</td><td>AD 633-161</td><td>ATTO633-DOPE può essere utilizzato come alternativa (&lambda; ecc. 630 nm; &lambda; em 651 nm)</td></tr><tr><td>Colonna di filtrazione su gel</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9893-33</td><td>HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, per la purificazione aggiuntiva</td></tr><tr><td>delle proteine Vetrini coprioggetti</td><td>VWR International</td><td>631-0172</td><td>No 1.5</td></tr><tr><td>Siringa in vetro</td><td>Hamilton</td><td>1725 RNR</td><td>250 &; L</td></tr><tr><td>Fiale di vetro</td><td>Scientific Glass Laboratories Ltd</td><td>T101/V1</td><td>Capacità 1,75 mL</td></tr><tr><td>Oro</td><td>GoodFellow</td><td></td><td>99,99%</td></tr><tr><td>Gramacidin</td><td>Sigma</td><td>G5002</td><td></td></tr><tr><td>Elettrodo di riferimento al solfato di mercurio</td><td>Radiometro (Hash)</td><td>E21M012</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>Microscopio Eppendorf</td><td>Minispin NL040</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Nikon</td><td>Eclipse Ti</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Fotocamera</td><td>Andor</td><td>Zyla 5.5 sCMOS</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio Lampada</td><td>Nikon</td><td>Intensilight C-HGFI</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements AR 5.0.2</td><td>Nikon</td><td></td><td>Microscopio software</td></tr><tr><td>di acquisizione n-Octyl &beta;-D-glucopiranoside</td><td>Melford Laboratories</td><td>B2007</td><td></td></tr><tr><td>Nova 1.10</td><td>Metrohm</td><td></td><td>Software di controllo potenziostato</td></tr><tr><td>Obiettivo</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo &lambda; olio</td><td></td>60x/1.4</tr><tr><td>OriginPro 2017</td><td>OriginLab</td><td></td><td>Software di tracciatura</td></tr><tr><td>O-ring (cella elettrochimica)</td><td>Orinoko</td><td></td><td>Diametro interno: 16 mm; sezione trasversale: 1,5 mm</td></tr><tr><td>Tubi di plastica</td><td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Microsfere di polistirene</td><td>Bio-RAD</td><td>152-3920</td><td>Biobeads, 20-50 mesh</td></tr><tr><td>Potenziostato</td><td>Metrohm Autolab</td><td>PGSTAT 128N</td><td></td></tr><tr><td>Potenziostat</td><td>CH Instruments</td><td>CHI604C</td><td></td></tr><tr><td>Software di scripting</td><td>Matlab</td><td>R2017a</td><td>Toolbox richiesti: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox'Wafer</td></tr> <tr><td>di silicio</td><td>IDB Technologies LTD</td><td>Si-C2 (N< 100>P)</td><td>&Oslash; 25 mm, 525 um di spessore</td></tr><tr><td>Cella in teflon (cella elettrochimica)</td><td>Su misura</td><td></td><td>Diametro esterno: 26 mm; diametro interno: 13,5 mm</td></tr><tr><td>Superfici in oro ultrapiatto spellato sulle aste Tecnologie</td><td>per ornitorinco</td><td>AU.1000.SWTSG</td><td>Superfici alternative in oro ultrapiatto pronte all'uso (spessore inferiore a 100 nm su richiesta)</td></tr><tr><td>Puntali per micropipette sottili</td><td>Sarstedt</td><td>70.1190.100</td><td>o simili punte per gelloader 200 &micro; L</td></tr><tr><td>Ubichinone-10</td><td>Sigma</td><td>C-9538</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>L-80XP</td><td>con rotore Ti 45</td></tr><tr><td>Bagno ad ultrasuoni</td><td>Fisher</td><td>Scientific FB15063</td><td></td></tr></tbody></table>

liposoma singole misurazioni per lo studio degli enzimi di membrana proton-pompaggio usando microscopia fluorescente ed elettrochimica

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Protone-pompaggio enzimi dell'elettrone trasferimento reazioni di ossidoriduzione Coppia catene alla traslocazione di protoni attraverso la membrana, creando una Forza Protonomotrice utilizzata per la produzione di ATP. La natura anfifilica delle proteine di membrana richiede particolare attenzione al loro trattamento, e la ricostituzione nell'ambiente naturale del lipido è indispensabile quando si studia i processi di trasporto di membrana come protone traslocazione. Qui, abbiamo dettaglio un metodo che è stato utilizzato per l'indagine sul meccanismo di pompaggio di protoni di enzimi redox della membrana, prendendo citocromo bo3 da Escherichia coli come un esempio. Una combinazione di microscopia di fluorescenza ed elettrochimica viene utilizzata per controllare lo stato redox dei cambiamenti di pH piscina e monitor del chinone in lumen. A causa della risoluzione spaziale di microscopia fluorescente, centinaia di liposomi possa essere misurati simultaneamente mentre il contenuto degli enzimi può essere scalato verso il basso per un singolo enzima o trasportatore a liposoma. L'analisi di rispettivo singolo enzima può rivelare modelli nella dinamica funzionale degli enzimi che potrebbe altrimenti essere nascosti dal comportamento dell'intera popolazione. Includiamo una descrizione di uno script per l'analisi di immagine automatizzato.

La qualità del coprioggetto oro-modificato (l'elettrodo) con una SAM di 6MH è controllata prima di ogni esperimento con la spettroscopia di impedenza elettrochimica. La Figura 2A Mostra rappresentative trame di Cole-Cole misurati mediante spettroscopia di impedenza elettrochimica prima e dopo i liposomi sono adsorbiti. Se la qualità di SAM è sufficiente, spettroscopia di impedenza dovrebbe dimostrare un comportamento capacitivo quasi puro risultante in una tr...

Qui, presentiamo un protocollo per studiare il meccanismo molecolare della traslocazione di protoni attraverso le membrane del lipido di liposomi singoli, utilizzando citocromo bo3 come esempio. Combinando elettrochimica e microscopia a fluorescenza, le variazioni del pH in lumen del singole vescicole, contenenti singole o multiple enzima, possono essere rilevati e analizzati singolarmente.

Liposoma singole misurazioni per lo studio degli enzimi di membrana Proton-pompaggio usando microscopia fluorescente ed elettrochimica

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Questo metodo consente lo studio dell'attività di trasporto protonico di enzimi della membrana respiratoria come il citocromo BO3 in un ambiente bistrato lipidico naturale. I principali vantaggi di questa singola tecnica enzimatica è la possibilità di iniziare e interrompere le reazioni enzimatiche in qualsiasi momento utilizzando l'elettrochimica. Utilizzando una siringa di vetro trasferire 200 microlitri di stock cloroformio di estratto polare lipidico da Escherichia coli in fiale di vetro per fare cinque milligrammi di aliquote.Aggiungere 50 microlitri di un milligrammo per millilitro ubichinone 10 ai lipidi per fare il rapporto finale da uno a 100 ubichinone 10 ai lipidi. Alla miscela aggiungere 20 microlitri di un milligrammo per millilitro lunghezza d'onda lunga colorante fluorescente etichettato lipidico abbreviato FDLL. Omogeneizzare la soluzione cloroformio con un breve vortice ed evaporare la maggior parte del cloroformio sotto un delicato flusso di azoto o argon.Rimuovere completamente le tracce di cloroformio per ulteriore evaporazione sotto vuoto per almeno un'ora. Aggiungere 312,5 microlitri di 40 millimolare MOPS pH 7.4 tampone a un'aliquota di lipidi ubiquinone 10 F

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Qui vi presentiamo un metodo elettrofisiologico basata su solide membrane supportati con attenzione le sue applicazioni per la caratterizzazione dei trasportatori di membrana elettrogeniche.

Introduzione alla membrana supportata Solid Sulla Elettrofisiologia

I proteoliposomi vengono utilizzati per studiare canali purificati e trasportatori ricostituiti in un ambiente biochimico ben definito. Viene illustrata una procedura sperimentale per misurare l'efflusso mediato da queste proteine. Vengono descritti i passaggi per preparare i proteoliposomi, eseguire le registrazioni e analizzare i dati per determinare quantitativamente le proprietà funzionali della proteina ricostituita.

A Proteoliposome-Based Efflux Assay per determinare le proprietà singola molecola di Cl<sup&gt; -</sup&gt; Canali e trasportatori

Il protocollo presentato descrive l'analisi del trasporto mediato da proteine di membrana a livello di singolo trasportatore utilizzando doppi strati lipidici privi di solventi che attraversano i pori. Ciò si ottiene grazie alla creazione di chip array di nanopori prodotti in serie, combinati con l'acquisizione e l'analisi dei dati altamente parallele, consentendo la futura creazione di screening degli effettori delle proteine di membrana.

Trasporto di membrana processi analizzati da un altamente parallelo sistema Nanopore Chip a risoluzione della proteina singolo

Questo articolo descrive i metodi per l'etichettatura dello spin sito-diretto e la ricostituzione dei canali pentamerici ligando-dipendenti per studi di risonanza paramagnetica elettronica. Questo protocollo può essere adattato a qualsiasi proteina di membrana. Il metodo di ricostituzione qui descritto può essere utilizzato anche per misure di patch-clamp di correnti macroscopiche e a canale singolo in un sistema lipidico definito.

Sito-Labeling Spin e EPR spettroscopiche Studi di canali pentamerica ligando-dipendenti Ion

Questo protocollo descrive la fabbricazione di liposomi e come questi possono essere immobilizzati su una superficie e immagine individualmente in modo parallelo massiccio utilizzando la microscopia a fluorescenza. Ciò consente la quantificazione delle dimensioni e dell'inomogeneità compositiva tra singoli liposomi della popolazione.

Un saggio di liposoma singolo basato sulla microscopia quantitativa per rilevare l'inomogeneità compositiva tra i singoli liposomi

La fusione mitocondriale è un'importante reazione omeostatica alla base delle dinamiche mitocondriali. Descritto qui è un sistema di ricostituzione in vitro per studiare la fusione mitocondriale interno-membrana che può risolvere il tethering della membrana, docking, emifusione, e l'apertura pore. Viene discussa la versatilità di questo approccio nell'esplorazione dei sistemi a membrana cellulare.

Una piattaforma di membrana modello per la ricostituzione delle dinamiche della membrana mitocondriale

Qui, descriviamo protocolli che utilizzano sensori lipidici fluorescenti e liposomi per determinare se una proteina estrae e trasporta fosfatidilserina o fosfatidilinositolo 4-fosfato in vitro.

Misurazioni basate sulla fluorescenza dello scambio di fosfatidilserina / fosfatidilinositolo 4-fosfato tra le membrane

Questo protocollo presenta un metodo di imaging a fluorescenza che utilizza una classe di fluorofori lipidici sensibili al pH per monitorare il traffico della membrana lipidica durante l'esocitosi cellulare e il ciclo di endocitosi.

Misurazione del turnover lipidico di membrana con l'analogo lipidico fluorescente ND6 sensibile al pH

Descriviamo i protocolli per misurare il pH, gli eventi ossidativi e la digestione delle proteine in singoli macropinosomi in cellule vive. L'accento è posto sulla microscopia a doppio fluoroforo ratiometrico e sui vantaggi che offre rispetto alle tecniche basate sulla popolazione.

Misurazione del pH, delle sostanze chimiche redox e della capacità degradativa dei macropinosomi utilizzando la microscopia a doppio fluoroforo

Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata di come creare campioni per il tracciamento a singola proteina in bistrati lipidici supportati da solidi. Spiega anche un microscopio a fluorescenza semplice con sensibilità a singola molecola e un frame rate elevato. Infine, delineiamo la procedura per estrarre traiettorie a singola proteina.

Tracciamento di singole proteine nei bilayer lipidici tramite microscopia a fluorescenza

Viene presentato un protocollo sperimentale per assemblare, stimolare elettricamente e analizzare i bilayer di interfaccia gocce dopate con gramicidina A. Le relazioni struttura-funzione lipido-proteina sono quantificate misurando le variazioni nell'area della membrana, nel flusso ionico e nella conduttanza a canale singolo, e collegando queste risposte a cambiamenti simili alla plasticità nella conduzione ionica in un modello di membrana ispirato alle sinapsi elettriche.

Caratterizzazione della struttura e funzione della membrana lipido-proteina utilizzando i bistrati dell'interfaccia delle gocce

Scopri il trasporto di protoni negli enzimi di membrana come il citocromo bo 3 usando liposomi singoli, elettrochimica e microscopia a fluorescenza. Questo metodo consente il controllo in tempo reale delle reazioni enzimatiche.

Liposoma singole misurazioni per lo studio degli enzimi di membrana Proton-pompaggio usando microscopia fluorescente ed elettrochimica (Video) | JoVE Journal

Liposoma singole misurazioni per lo studio degli enzimi di membrana Proton-pompaggio usando microscopia fluorescente ed elettrochimica

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