Name: Una nuovo portatile In Vitro lesposizione Cassette per il campionamento di Aerosol (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-02-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 1 s
Description: Scopri il sistema PIVEC per esporre colture cellulari ad aerosol ambientali in tempo reale. Questo metodo permette di valutare lo stress ossidativo e la citotossicità su cellule polmonari coltivate all'interfaccia aria-liquido.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori vorrei ringraziare Boris Solomonov e la Virginia Commonwealth innovazione macchina negozio per aiutare con la prototipazione rapida del dispositivo. Gli autori inoltre ringraziare Cristian Romero-Fuentes del gruppo Lewinski, Dr. Vitaliy Avrutin, Dr. Dmitry Pestov e la Virginia Commonwealth nanomateriali Core caratterizzazione Facility per il loro aiuto con caratterizzazione delle particelle. Questo lavoro è stato sostenuto dai fondi di avvio forniti al Dr. Lewinski da College of Engineering presso la Virginia Commonwealth University.

Gli operatori devono indossare dispositivi di protezione individuale (camice, guanti, occhiali) quando eseguire passaggi 1, 2, 3, 5 e 6.
1. preparazione dei materiali
<ol><li>
Preparare i materiali per l'assemblaggio del sistema e l'esposizione assicurare la ripetibilità.
	<ol>
<li>Assicurati di uso nuovo o etanolo al 70% pulito ¼" diametro interno conduttivo della tubazione e ¼" diametro esterno connettori per l'assembly di sistema.</li>
		<li>Archivio test materiali inclusi filtri, componenti PIVEC, pinzette e polveri delle particelle in un ambiente ben controllato, per quanto riguarda la temperatura e l'umidità, per almeno 24 h prima dell'esperimento. Nota: La temperatura deve essere a temperatura ambiente, circa 20 ° C, con umidità relativa inferiore al 35%. Questo è molto importante per raggiungere ripetibilità tra esperimenti.</li>
		<li>Preparare i contatori di particelle utilizzando isopropanolo per pulire parti e consentire il riscaldamento del sistema secondo le raccomandazioni del produttore, tra cui la scansione mobilità particella sizer (SMPS) e la sizer ottici di particelle (OPS) per la misurazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. generazione di Aerosol secco
Nota: Gli operatori dovrebbero eseguire la generazione di aerosol in una cappa aspirante.
<ol><li>
Assemblare un sistema per generare aerosol secco Nota: La sospensione di particelle di gas o liquido deve essere appropriata per la cultura delle cellule e applicazione modellata. Il metodo seguente può essere eseguito utilizzando un aerosol a base liquida. Il design del sistema aerosol secco è da Tiwari et al. 37 un disegno schematico del sistema asciutto dispersione è illustrato nella Figura 1.<ol>
<li>Collegare la valvola a sfera a ciascuna estremità del tubo di dimensioni filettati 4" 1/8, questo servirà come la tramoggia della particella. Collegare 2" 1/8 dimensioni tubo una valvola.</li>
		<li>Pesare le nanoparticelle di rame, in questo studio la concentrazione di massa per ogni dimensione delle particelle è stata mantenuta costante durante la determinazione dell'efficienza di deposizione. Utilizzare circa 7,5 mg di 40 nm rame nanoparticelle, 7 mg di 100 nm rame nanoparticelle e 13 mg di 800 nm rame nanoparticelle per l'esposizione. Posizionare le nanoparticelle di rame nella tramoggia della particella attraverso l'estremità aperta. Nota: La quantità di nanoparticelle rame pesate servirà come base la massa amministrata concentrazione.</li>
		<li>Posizionare un 3" pezzo di tubo di diametro esterno (OD) del ½" intorno al tubo da 2" e posto un HEPA filtro all'interno di questo tubo breve tale che la direzione del flusso attraverso la valvola a sfera.</li>
		<li>Collegare il generatore di vuoto ad altre valvola a sfera con filettatura. Collegare generatore di vuoto ad aria serbatoio inserendo una tubazione OD 5/16" nella connessione push-to-lock. Utilizzare tubazione OD di ¼" per collegare l'uscita del generatore di vuoto con il set-up sperimentale mettendo il tubo sopra l'uscita del generatore di vuoto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Uso del sistema di secchi di aerosol per generare aerosol secco
	<ol>
<li>Aprire il serbatoio dell'aria ruotando la valvola principale e consentire il flusso d'aria del sistema. Aprire la valvola del regolatore di flusso sul serbatoio dell'aria e impostato in modo che il flusso attraverso il sistema è equivalente alle impostazioni desiderate sulla pompa del vuoto.</li>
		<li>Aprire la valvola a sfera più vicina al filtro HEPA quindi la valvola a sfera più vicina al generatore di vuoto. Questi tenere aperto per circa 3 s per consentire le particelle essere tirato nel flusso d'aria.</li>
		<li>Chiudere la valvola a sfera più vicina al generatore di vuoto quindi chiudere la valvola a sfera più vicina al filtro HEPA. Consentire l'aria dal serbatoio a scorrere per tutta la durata dell'esperimento come necessario.</li>
		<li>Chiudere le valvole principali e regolatore sul serbatoio di aria per fermare il flusso. Valvole a sfera pulite e generatore di vuoto con etanolo al 70%. Tubi metallici di autoclave per la sterilizzazione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. deposizione efficienza misura utilizzando PIVEC
Nota: Gli operatori devono eseguire le esposizioni dell'aerosol in una cappa aspirante.
<ol><li>Misurare la deposizione raccogliendo il rame nanoparticella aerosol generato nel passaggio 2.2 su un filtro pre-pesato. Utilizzare la dose depositata, misurata utilizzando la massa raccolta sul filtro e la dose somministrata, misurata con la quantità di particelle di rame pesate, per determinare l'efficienza di deposizione.<ol>
<li>Tenere 1,00 µm filtri di fibra di vetro di poro in condizioni di bassa umidità, descritto al punto 1.1.2, per almeno 24 h prima del pre-esposizione misure. Pesare un filtro inutilizzato tre volte e registrare i pesi dei filtri. Inserire il filtro inutilizzato in una coltura cellulare inserire.</li>
		<li>Selezionare cella appropriata cultura inserto adattatore (ben 6 o 24 bene) per PIVEC supportare l'inserto di cultura delle cellule con il filtro. Luogo la coltura cellulare inserire pezzo adattatore sulla parte superiore della base di PIVEC, l'impostazione in posizione tale che la base del pezzo adattatore è più larga della parte superiore.</li>
		<li>Uso delle pinzette per posizionare il filtro caricato coltura cellulare inserire all'interno del raccordo. Posizionare il pezzo superiore sopra pezzo adattatore, stabilendosi in posizione tale che la base della parte superiore è più larga della parte superiore. Avvolgere PIVEC con un singolo strato di nastro adesivo.</li>
		<li>Collegare pezzi cassetta 37 mm sulla parte superiore e inferiore della PIVEC spingendo in luogo. Inserire schede di ¼" spinato cassetta ingresso ed uscita.</li>
		<li>Avvolgere il riscaldatore resistivo intorno PIVEC tale che i fili sono alla base. Nastro per garantire la.</li>
		<li>Avvolgere PIVEC con ~ 8 giri di carta stagnola per isolamento. Fissarla con nastro adesivo.</li>
		<li>Collegare 2" lungo pezzo di 1/2" diametro esterno tubo flessibile alla scheda in cima PIVEC. Rimuovere tubo poroso da acqua sterile e posto all'interno della tubazione in cima PIVEC.</li>
		<li>PIVEC posto all'interno del morsetto sul cavalletto anello e sicuro. Completo set-up con la pompa del vuoto, contatori di particelle e set-up dell'aerosol. Nota: La dose depositata basati su numero può essere determinata solo se i contatori di particelle vengono inseriti prima del PIVEC e dopo il PIVEC su cicli separati.</li>
		<li>Esporre i filtri utilizzando passo 2.2 del protocollo e tempo e flusso tassi di esposizione desiderata, in questo studio che è stato utilizzato un tempo di esposizione di 10 min a 0,5 l/min. Rimuovere PIVEC dal set-up. Prendere l'inserto di cultura cellulare e inserire il filtro esposto nel portafiltro in condizioni di bassa umidità per almeno 24 h prima della misurazione.</li>
		<li>PIVEC pulito con etanolo al 70%. Sterilizzare con luce ultravioletta per almeno 30 min prima dell'esperimento successivo.</li>
		<li>Pesare il filtro esposto tre volte e registrare i pesi dei filtri. Inserire il filtro esposto in un portafiltro con etichetta per deposito.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. calcolo della Dose depositato ed efficienza di deposizione
Nota: La conoscenza della deposizione è importante per l'amministrazione dell'aerosol e interpretazione della risposta cellulare.
<ol><li>
Calcolare la deposizione da misure basate su massa
	<ol>
<li>Calcolare la massa depositata sui filtri come la differenza tra il peso medio pre-esposizione e peso medio post-esposizione. Questo valore è la dose depositata basato sulla massa per l'esperimento.</li>
		<li>Uso amministrato massa, madmin, e basato sulla massa depositata dose determinata in 4.1.1, mdep, per calcolare l'efficienza di deposizione basato sulla massa, ηm, per l'esperimento. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58916/58916eq1.jpg">
</li>
		<li>Valori medi da 4.1.1 e 4.1.2 per almeno 3 esperimenti determinare la deposizione e l'efficienza di deposizione per PIVEC per dimensione delle particelle.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Calcolare la deposizione da misure basate su numero
	<ol>
<li>Garantire che le misure con contatori di particelle sono state eseguite con contatori dopo la PIVEC e per determinare la concentrazione di particelle prima il PIVEC. Integrare la concentrazione delle particelle nel tempo per il contatore di particelle poi integrare sul diametro della particella per determinare il totale particelle misurate.</li>
		<li>Calcolare il numero di particelle depositate come la differenza tra le particelle amministrate e il post-PIVEC di particelle misurate. Questo valore è la dose depositata basato su numeri per l'esperimento.</li>
		<li>Particelle di uso amministrato, nadmin, basati su numero depositate dose, ndep, portata volumetrica, V e dal tempo, t, per calcolare l'efficienza di deposizione basata su numero, ηn, per l'esperimento. <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/58916/58916eq2.jpg">
</li>
		<li>Valori medi da 4.2.2 e 4.2.3 per almeno 3 esperimenti determinare la deposizione e l'efficienza di deposizione per PIVEC per dimensione delle particelle.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. aerosol l'esposizione delle cellule
Nota: Per la cella viene definito cultura all'interfaccia aria-liquido il lettore in bianco et al. 38 gli operatori dovrebbero eseguire cultura inserto di cella di carico (misure 5.1.2-5.1.4) all'interno di una cappa di biosicurezza. Gli operatori dovrebbero eseguire esposizioni di aerosol in una cappa.
<ol><li>
Cellule di cultura all'interfaccia aria-liquido
	<ol>
<li>Sollevare le cellule A549 da matraccio di cultura con l'aggiunta di tripsina-EDTA, 3ml per un pallone da T75 o 1 mL per una boccetta di T25 e incubare per 5 min a 37 ° C. Aggiungere 7 mL di supporto completo per una boccetta di T75 o 4 mL di terreno completo per un T25 boccetta a boccetta e parete di boccetta di risciacquo con sospensione cellulare massimizzare il numero di cellulare recuperati. Trasferimento la sospensione cellulare in una provetta conica sterile 15 mL poi Centrifugare le cellule a 800 x g per 3 min.</li>
		<li>Rimuovere il surnatante contenente tripsina-EDTA e risospendere il pellet cellulare in 10 mL di multimediale completo. Rimuovere 10 µ l di sospensione cellulare e aggiungere l'emocitometro. Contare le celle utilizzando un emocitometro per determinare la concentrazione e il numero totale di cellule.</li>
		<li>Posto 0,5 mL di terreno completo per ciascun pozzetto all'interno di un piatto ben 24. Posizionare inserti di cultura cellulare inutilizzato a wells. Coltura cellulare di seme si inserisce sul lato apicale con una densità di cella vicino a 1 x 105 cellule/cm2 per i tipi di cellule che crescono ad un tasso vicino raddoppio al giorno. Seed A549 celle all'interno di un 24 ben inserire, inserire celle di seme ad una densità di 1 x 105 cellule/cm2 aggiungendo 35.000 cellule alla coltura delle cellule. Nota: Le cellule con un tasso di crescita più lento possono essere seminate ad una densità aumentata delle cellule.</li>
		<li>Aggiungi media completi al lato apicale della cellula cultura inserto per raggiungere il volume finale (per 24 volume finale ben piatto è 0,25 mL).</li>
		<li>Cultura per 7 giorni in condizioni sommerse, sostituzione media ogni 1-2 giorni. Dopo 7 giorni, rimuovere i supporti apicali e la cultura per almeno 1 giorno in condizioni di ALI, sostituendo solo i media basolaterale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Assemblare PIVEC
	<ol>
<li>Consentire alle cellule di equilibrare all'interfaccia aria-liquido per almeno 24 h prima dell'esposizione.</li>
		<li>Selezionare cella appropriata cultura inserto adattatore per PIVEC supportare l'inserto di cultura delle cellule con il filtro. Coltura cellulare posto inserire pezzo adattatore in cima PIVEC base, impostazione in posizione tale che la base del pezzo adattatore è più larga della parte superiore. Aggiungere 4 mL di terreno di coltura delle cellule della base della PIVEC.</li>
		<li>Uso delle pinzette per posizionare la coltura delle cellule ad inserire adattatore pezzo posizionato al punto 5.2.3. Posizionare il pezzo superiore sopra pezzo adattatore, stabilendosi in posizione tale che la base della parte superiore è più larga della parte superiore. Avvolgere attentamente, PIVEC con un singolo strato di nastro adesivo.</li>
		<li>Collegare pezzi cassetta 37 mm sulla parte superiore e inferiore della PIVEC, spingendo in luogo. Inserire schede di ¼" spinato cassetta ingresso ed uscita.</li>
		<li>Avvolgere il riscaldatore resistivo intorno PIVEC tale che i fili sono alla base. Nastro per garantire la.</li>
		<li>Avvolgere PIVEC con ~ 8 giri di carta stagnola per isolamento. Fissarla con nastro adesivo.</li>
		<li>Collegare all'adattatore sulla cima PIVEC breve pezzo di tubo flessibile di diametro esterno 1/2". Rimuovere tubo poroso da acqua sterile e posto all'interno della tubazione in cima PIVEC.</li>
		<li>PIVEC posto all'interno del morsetto sul cavalletto anello e sicuro. Completare il set-up con la pompa a vuoto e set-up dell'aerosol.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Esporre le cellule alle ALI utilizzando il PIVEC
	<ol>
<li>Utilizzare l'efficienza di deposizione determinata nel passaggio 2 per calcolare la massa di particelle per essere aerosolized. Pesare massa adeguata e aggiungere al sistema aerosol istituito a seguito del passaggio 2 all'interno della cappa.</li>
		<li>Esporre le cellule seguendo passo 2.2, in questo studio di endpoint biologici le cellule sono state esposte a circa 3,5 mg di rame nanoparticelle con una portata di 0,5 l/min e una durata di esposizione di 10 min. studi di controllo effettuati utilizzata aria umidificata per determinare l'influenza dell'aria da solo. Rimuovere PIVEC dal set-up. Prendere l'inserto di cultura cellulare, inserire nella piastra ben sterile e tornare l'incubatrice di CO2 (37 ° C, 5% CO2, 90% RH).</li>
		<li>Aspirare la media da PIVEC. Se eseguendo ulteriori esperimenti, fondo di risciacquo di PIVEC con fosfato tampone soluzione quindi ripetere il punto 5.1 e 5.2.</li>
		<li>PIVEC pulito con etanolo al 70% al termine. Sterilizzare con luce ultravioletta per almeno 30 min prima dell'esperimento successivo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Procedure di saggio biologico Nota: Analisi eseguite in questo studio erano generazione di stress ossidativo attraverso l'analisi di DCFH-DA e citotossicità attraverso il rilascio di lattato deidrogenasi (LDH).<ol>
<li>Sciogliere 24,4 mg di DCFH-DA in 50 mL di metanolo per fare 1 mM DCFH-DA soluzione. Questa soluzione può essere conservata a-20 ° C fino a 4 mesi. Diluire 1 mM DCFH-DA soluzione mescolando 0,1 mL di 1 mM DCFH-DA soluzione con 9,9 mL HBSS per rendere 10 mL di 10 µM DCFH-DA.</li>
		<li>Rimuovere la cella di terreni di coltura e lavaggio inserto di cultura di cella con circa 1 mL di PBS. Aggiungere 0,5 mL di soluzione di DCFH-DA 10 µM in ciascun pozzetto, sostituendo inserti quando finito. Coprire la piastra con un foglio di alluminio per evitare fotoattivazione del colorante e tornare all'incubatore 37° C per 1 h.</li>
		<li>Rimuovere le cellule dall'incubatrice ed aspirare la soluzione di lavoro di DCFH-dai pozzi. Aggiungere 0,5 mL HBSS pozzetti e sostituire inserti di cultura cellulare.</li>
		<li>Caricare la piastra ben in fluorescenza lettore e misura piastra basale utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 485/530 nm. Rimuovere la piastra da inserto reader e carico piastra in PIVEC per l'esposizione.</li>
		<li>Esporre le cellule per la durata di esposizione desiderata. Rimuovere l'inserto da PIVEC e tornare alla piastra ben. Rimuovere 50 µ l di liquido basolateral da ben piatto e posto nella piastra ben bianco 96. Misurare la fluorescenza del DCF utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 485/530 nm ogni 30 min post-esposizione per 2 h.</li>
		<li>Lasciate che basolateral fluido stabilizzare a temperatura ambiente per 20-30 min. aggiungere 50 µ l di soluzione dosaggio LDH, misto seguente protocollo di produttore, basolaterale fluido dalla piastra bene e lasciare reagire per 10 min. aggiungere 25 µ l di soluzione bloccante a bene. Leggere la fluorescenza di Resorufina prodotto utilizzando lunghezze d'onda di eccitazione/emissione di 560/590 nm.</li>
		<li>Rimuovere il liquido ulteriori basolaterale e ripetere il passaggio 5.4.6 alle 4h e post-esposizione di 24 ore.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6 metodi statistici
<ol><li>Analisi dei dati di analisi biologica<ol>
<li>Rapporto produzione di ROS come l'aumento di intensità di fluorescenza delle cellule trattate rispetto a misurazioni di base. Relazione attività LDH come l'aumento di intensità di fluorescenza delle cellule trattate rispetto a cellule non trattate.</li>
		<li>Eseguire il singolo fattore ANOVA per determinare le differenze statistiche fra i set di dati. Se del caso, eseguire student t-test ad un valore di significatività di 0,05. Report dati come media ± deviazione standard di almeno tre misurazioni dell'esposizione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

L'affiliazione degli autori è come indicato nel frontespizio. Gli autori sono supportati finanziariamente da Virginia Commonwealth University, dove il lavoro è stato completato a Richmond, in Virginia. Gli autori hanno la responsabilità esclusiva per la scrittura e il contenuto di questa carta. Gli autori dichiarano che non esistono nessun interessi concorrenti.

Cartucce filtro forniscono un metodo semplice, poco costoso di raccolta aerosol nella zona di respirazione; Tuttavia, campioni di aerosol estratti dai filtri non rappresentano l'intero aerosol (cioè gas, sostanze volatili e polveri) e di conseguenza limitare la valutazione degli effetti biologici correlati. Usando il disegno iniziale della cassetta filtro 37 mm, il PIVEC è progettato per mantenere la portabilità e imitare la deposizione in vivo delle particelle da inalazione. Il PIVEC è significativamente inferi...

Campionamento personale utilizzando tecniche in vitro potrebbe fornire informazioni complete per quanto riguarda gli effetti biologici degli aerosol sul posto di lavoro. 1 esposizioni agli agenti inquinanti nell'aria comprendono esposizioni alla sostanza chimica stessa, per i campioni di aria raccolti, sommerso in condizioni dove il gas viene introdotto alla sospensione di cellule, le esposizioni intermittenti usando un dispositivo come un rocker, o diretto esposizioni all'interfaccia aria-liquido (ALI). 2 molte di queste tecniche vengono eseguite con le cellule che crescono in sospensione o il prelievo di campioni prima dell'esposizione, ognuno dei quali può influenzare lo studio tossicologico a causa di potenziali cambiamenti l'aerosol. 3 per evitare questi cambiamenti, il laboratorio può essere portato al campo utilizzando diversi in vitro sistemi di esposizione di cultura ALI che sono utilizzati nella letteratura,4,5,6,7, 8,9,10,11,12,13 tuttavia, pochi sono disponibili in commercio. 8 , 9 , 12 questi sistemi sono spesso ingombranti, soprattutto quando compresi gli strumenti per regolare la temperatura e l'umidità dell'ambiente cellulare e la portata dell'aerosol del campione. Utilizzando il PIVEC, esposizioni di aerosol possono essere eseguite di fuori di un ambiente di laboratorio tradizionale o all'interno della zona di respirazione mentre che imita condizioni di inalazione.
La determinazione di aerosol deposizione in vitro è importante per l'indagine degli effetti sulla salute a causa di inalazione. La zona di respirazione, l'area all'interno di 30 cm dalla bocca e dal naso,14 è fondamentale per comprendere l'esposizione alle nanoparticelle e collegamento agli effetti biologici nei polmoni. 2 spesso, la deposizione sulle cellule è definita come un efficienza di deposizione, le particelle depositate sul e preso dalle cellule divise per le particelle somministrate al sistema6,15 o su una base di massa degli importi stessi. 4 , 16 i metodi correnti per aerosol nella zona di respirazione di misurazione sono filtro basato, catturando particelle su un periodo di campionamento specificato e utilizzando i filtri di condurre ulteriori test. 17 monitoraggio personale richiede un piccolo sistema che viene fornito con il compromesso di meno campioni.
Ci sono molti approcci per determinare gli effetti sulla salute da esposizione ad un aerosol. Il modello di ALI consente per l'aerosol deve essere somministrato direttamente alle cellule attraverso l'aria come in uno scenario di esposizione reale, ma è più conveniente e meno tempo intensivo che in vivo studi mentre che imita le barriere di aria-liquido ad esempio gli occhi, pelle e polmoni. Le cellule del polmone cresciute presso le ALI hanno la capacità di generare un strato di sbarramento polarizzato,18,19 che produce tratti fisiologici che assomigliano in vivo epitelio polmonare, compresa la produzione di muco e di agente tensioattivo in specifici linee cellulari bronchiali o alveolare, ciglia battendo,19 giunzioni strette, polarizzazione delle cellule e20 19,. 18 cambiamenti come questi possono influenzare la risposta cellulare misurata negli studi di tossicità. 21 inoltre, ALI in vitro modello risultati sono spesso più sensibile di cellule esposti via sospensione modelli22 e sono in grado di tossicità da inalazione acuta in vivo modello. 23 , 24 di conseguenza, un sistema di esposizione di ALI che è in grado di eseguire misure all'interno della zona di respirazione è un passaggio naturale.
Esponendo le cellule ad aerosol direttamente alla sorgente di emissione, indagine degli effetti di tutti i gas, composti semi-volatili e particelle coinvolte nella miscela si verifica. Quando la miscela viene raccolto su un filtro, i gas e composti volatili non vengono acquisiti e la miscela intera non può essere studiata. Inoltre, la ricostituzione delle particelle in una polvere o una sospensione liquida può portare all'aggregazione o interazioni particella-fluido, come dissoluzione, in sospensione liquida. 25 , 26 quando le particelle dell'aerosol sono aggiunto al liquido, c'è un maggiore potenziale per agglomerazione,25,27 formazione di una corona di proteina,28 o interazione con i composti nel liquido, che può influenzare la deposizione e influenzare la risposta biologica. 29 , 30
Esposizione presso le ALI si basa su tre principali aerosol profili, nube sedimentazione, parallelo flusso e flusso perpendicolare. Cloud di sedimentazione, utilizzato da aria-liquido Interfaccia cella esposizione (ALICE),4 è un sistema batch dove depositare i particelle attraverso gravitazionale e diffusionale stabilirsi come l'aerosol viene trattato come una singola unità. Flusso parallelo, utilizzato dagli Aerosol elettrostatica in vitro Exposure System (gronda)5 e multicultura esposizione camera (MEC) II,6 consente di deposizione mediante l'aggiunta del moto browniano attraverso il profilo di flusso. Flusso perpendicolare, utilizzato da un microsprayer,7 camera del nebulizzatore Nano per tossicità In Vitro (NACIVT),11 e commerciale ALI sistemi8,9,10,12, aggiunge il compressione di particelle all'interno della regione di deposizione. Molti di questi sistemi di esposizione sono grandi e ingombranti, che richiedono sistemi in eccesso per aerosol pre-condizionamento, pompe per il flusso, o persino il riscaldamento alloggiamenti per l'incubazione delle cellule. Questa grande dimensione diminuisce la portabilità del sistema. Invece di campionamento direttamente alla sorgente di emissione, questi sistemi hanno spesso portati agli aerosol lab o modello generato per analisi di campioni. La complessità dell'aerosol emesso può essere perso nella traduzione dal campo al laboratorio. Il PIVEC è più piccolo rispetto ai sistemi attuali, con una superficie esterna di circa 460 cm2 e pesa solo 60 grammi, con controllo termico e umidità incorporato nel sistema consentendo un dispositivo altamente portatile. La dimensione ridotta e il peso consentono al sistema di essere indossati o adottate per la fonte di esposizione, permettendo il campionamento diretto.
Le grandi dimensioni degli attuali sistemi di esposizione diminuisce anche la capacità di eseguire il campionamento per studiare gradienti spaziale delle concentrazioni. Questa risoluzione è chiave effetti tossicologici di molte potenzialità ambientali e rischi professionali come scarico veicolare particolato materia o sul posto di lavoro attività per determinare dove si verifica la nebulizzazione. Immediatamente post-emissione, là si trasforma in una variazione spaziale nella concentrazione di particelle. Questo cresce con il tempo come le particelle disperdono in tutta l'atmosfera e questi effetti possono modificare sulla base delle condizioni ambientali, quali temperatura, pressione, vento e sole. Le particelle possono cominciare a età e ossidare pure una volta emesso31,32 e tassi di dispersione sono influenzati dalla topografia; concentrazioni più elevate si trovano nel Canyon e tunnel, dove gli effetti di dispersione sono rallentati, e concentrazioni più basse possono essere trovate dove c'è una grande area per dispersione. 33 questi cambiamenti nei tassi di dispersione possono avere effetti significativi sulla salute umana e possono essere visto quando confronta il numero di asmatici adulti che vivono in urbano contro in ambienti rurali. 34 mentre molti sistemi di esposizione forniscono campioni multipli in una sola volta, sistemi multipli sono necessari con un'abbondanza di grandi apparecchiature per eseguire la risoluzione spaziale.
Portando il laboratorio al campo, al momento dell'analisi può essere ridotta utilizzando l'intera cellula come un sensore. Seguendo gli endpoint e i meccanismi biologici noti può aiutare nella determinazione della composizione di aerosol e dimensione. A causa dei metodi di liquidazione lento, tra cui la clearance mucociliare, fagocitosi e traslocazione, queste particelle sono spesso interagendo con le cellule per circa giorni a settimane3 generazione di stress ossidativo, infiammazione e anche la morte delle cellule. Questi endpoint biologici possono essere i punti di partenza per le vie di risultato avverso per malattia cardiovascolare o malattia polmonare ostruttiva cronica. Inoltre, Wiemenn et al. eseguite una serie di saggi in vitro da confrontare con i valori della letteratura per la tossicità a breve termine in vivo per via inalatoria. 35 Risposta in vivo è stato previsto con due dei quattro risultati positivi dai test di citotossicità tramite rilascio di lattato deidrogenasi, stress ossidativo dalla formazione di perossido di idrogeno e riduzione di glutatione e rilascio e infiammazione potenziale da gene dell'alfa di fattore di necrosi tumorale. Fuori dieci ossidi metallici di dimensioni nanometriche testati, sei testato come attivo (ossido di titanio, ossido di zinco e ossido di cerio diversi quattro) con esposizioni in vitro con conferma in vivo. 
Al fine di studiare gli effetti degli aerosol in un ambiente professionale, il nostro laboratorio ha sviluppato il PIVEC per le esposizioni nel campo. Inoltre, il PIVEC può essere indossato per campionamento personale monitorare e studiare l'esposizione di inalazione come il 37 mm filtro cassetta36 o più sistemi possono essere utilizzati per ottenere una risoluzione spaziale all'interno di una determinata area. In questo protocollo, la caratterizzazione e l'uso del PIVEC è discusso. Dopo l'esposizione, gli effetti biologici sono osservati mediante saggi di citotossicità.

<table><tbody><tr><td>Misuratore di particelle a scansione di mobilità (SMPS)</td><td>TSI, Inc.</td><td>3910</td><td>NanoSMPS</td></tr><tr><td>Misuratore ottico di particelle (OPS)</td><td>TSI, Inc.</td>Tubo in acciaio inox <td>3330</td><td></td></tr><tr><td>, lungo 4"</td><td>McMaster-Carr</td><td>4830K116</td><td>Parete standard 304/304L, filettato su entrambe le estremità, tubo da 1/8 Valvola</td></tr> a <tr><td>sfera in ottone con maniglia a leva</td><td>McMaster-Carr</td><td>4112T12</td><td>Compatto ad alta pressione, tubo in acciaio femmina da 1/8 NPT</td></tr><tr><td>, lungo 2"</td><td>McMaster-Carr</td><td>7753K121</td><td>Parete standard, filettato su un'estremità, tubo da 1/8</td></tr><tr><td>HEPA filtro</td><td>GE Healthcare</td><td>09-744-12</td><td>HEPA-Cap Capsula di filtrazione dell'aria monouso</td></tr><tr><td>Generatore di vuoto</td><td>PISCO USA</td><td>VCH10-018C</td><td></td></tr><tr><td>PIVEC</td><td>VCU</td><td></td><td>Per la progettazione si prega di contattare gli autori</td></tr><tr><td>Riscaldatore resistivo Connettori</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>spinati da 1/4"</td><td>Zefon International, Inc.</td><td></td><td></td>459743</tr><tr><td>Tubi porosi</td><td>Scientific Commodities, Inc.</td><td>BB2062-1814A</td><td>Idrofilo 10 um pori Batteria</td></tr><tr><td>power bank</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inserto per coltura cellulare</td><td>Fisherbrand</td><td>353095</td><td>Inserto per piastre a 24 pozzetti</td></tr><tr><td>Fisherbrand Pinze filtranti</td><td>Fisherbrand</td><td>09-753-50</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta di trasferimento</td><td>ThermoScientific</td><td>13-711-27</td><td></td></tr><tr><td>Filtri in fibra di vetro</td><td>SKC</td><td>225-7</td><td>Tipo senza legante Filtro AE 37 MM 1,00 um pore</td></tr><tr><td>Ultra Micro Balance</td><td>A& D</td><td>BM-22</td><td>Alloggiato nella camera ambientale</td></tr><tr><td>Cassetta filtro da 37 mm</td><td>SKC</td><td>225-3250</td><td>Cassetta filtro vuota, 37 mm, stirene trasparente</td></tr><tr><td>Pompa per vuoto a portata variabile</td><td>SKC</td><td>220-5000TC</td><td>AirChek TOUCH, da 5 a 5000 mL/min</td></tr><tr><td>Particelle di rame</td><td>U.S. Research Materials, Inc.</td><td>US1090</td><td>40 nm</td></tr><tr><td>Particelle di rame</td><td>U.S. Research Materials, Inc.</td><td>US1088</td><td>100 nm</td></tr><tr><td>Particelle di rame</td><td>U.S. Research Materials, Inc.</td><td>US1117M</td><td>800 nm</td></tr></tbody></table>

una nuovo portatile in vitro l'esposizione cassette per il campionamento di aerosol

A New Portable In Vitro Exposure Cassette for Aerosol Sampling

Questo protocollo introduce un nuovo in vitro l'esposizione sistema, capace di essere indossati, compresa la caratterizzazione e la performance. Sistemi di esposizione in vitro interfaccia aria-liquido (ALI) sono spesso grandi e ingombranti, rendendo il trasporto al campo e funzionamento alla sorgente di emissione o all'interno della zona di respirazione difficile. Attraverso la miniaturizzazione di questi sistemi, il laboratorio può essere portato al campo, accelerando il tempo di elaborazione e che forniscono un metodo più appropriato di esposizione che non altera l'aerosol prima di contattare le cellule. Il portatile In vitro l'esposizione Cassette (PIVEC) si adatta una cassetta filtro 37mm per consentire per la tossicità in vitro test di fuori di un ambiente di laboratorio tradizionale. Il PIVEC è stato caratterizzato utilizzando tre dimensioni delle nanoparticelle rame per determinare l'efficienza di deposizione basata su gravimetrico e numero analisi della concentrazione delle particelle. Citotossicità iniziali esperimenti sono stati eseguiti con cellule del polmone esposte per determinare la capacità del sistema di depositare particelle mantenendo attuabilità delle cellule. Il PIVEC fornisce un'efficienza di deposizione simile o maggiore quando si confrontano dispositivi di flusso perpendicolare disponibile in vitro l'esposizione. Nonostante il basso rendimento del campione, le piccole dimensioni dà alcuni vantaggi per la corrente in vitro ALI sistemi di esposizione. Questi includono la capacità di essere indossati per il monitoraggio personale, mobilità dal laboratorio per la fonte di emissione e la possibilità di set-up più sistemi per risoluzione spaziale mantenendo un utente più basso costano. Il PIVEC è un sistema in grado di raccogliere aerosol nel campo e all'interno della zona di respirazione su un modello di aria-interfacciato, in vitro .

Tossicologia occupazionale in vitro coinvolge mantenere vitalità cellulare durante l'esecuzione di esposizione di aerosol. Il sistema di PIVEC è mostrato in Figura 2, tra cui la temperatura e controllo dell'umidità e la PIVEC consumato. La temperatura è stata mantenuta utilizzando un riscaldatore resistivo alimentati a batteria e l'aerosol umidificato utilizzando aumentato umidificazione naturale attraverso un tubo poroso, a contatto col prodotto. In...

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire le esposizioni portatile cellulare aerosol e misurare la risposta cellulare. Il metodo utilizza cellule, coltivate all'interfaccia aria-liquido, che imita in vivo fisiologia. Risposta cellulare agli aerosol di rame delle nanoparticelle è stato osservato come lo stress ossidativo attraverso la generazione di specie reattive dell'ossigeno e citotossicità come rilascio del lattato deidrogenasi.

Una nuovo portatile In Vitro l'esposizione Cassette per il campionamento di Aerosol

This protocol introduces a new in vitro exposure system, capable of being worn, including its characterization and performance. Air-liquid interface (ALI) ...

Questo protocollo è significativo, in quanto il PIVEC consente l'esposizione diretta di una coltura cellulare agli aerosol del mondo reale. Il sistema può essere avvisato di campionare la stessa aria respirata da una persona, consentendo un nuovo tipo di monitoraggio della qualità dell'aria. Il vantaggio principale di questa tecnica è la facilità di catturare aerosol su cellule polmonari coltivate in luoghi inaccessibili ai sistemi da banco, come alla fonte di ammissione o all'interno della zona di respirazione.A dimostrare la procedura saranno la dottoressa Lynn Secondo, una neolaureata del mio laboratorio, e Nathaniel Wygal, uno studente universitario del mio laboratorio. Per questo esperimento, materiali di prova immagazzinati e ambiente controllato per 24 ore prima del test. Per assemblare il sistema di dispersione a secco, collegare la valvola a sfera a un'estremità del tubo filettato lungo 1/8 pollice.Questo serve come tramoggia di particelle. Attraverso l'estremità aperta della tramoggia delle particelle, mettere la quantità desiderata di nanoparticelle di rame. Quindi chiudere la tramoggia delle particelle con un'altra valvola a sfera.Collegare il tubo lungo due pollici e di dimensioni 1/8 alla valvola. Posizionare un tubo di diametro esterno lungo tre pollici e 1/2 pollice attorno al tubo da due pollici. Inserire un filtro HEPA all'interno del tubo corto, assicurandosi che la direzione del flusso sia attraverso la valvola a sfera.Utilizzando la filettatura, collegare il generatore di vuoto all'altra valvola a sfera. Quindi, collegare il generatore di vuoto al serbatoio dell'aria. Mettere tubi di diametro esterno da 1/4 di pollice sopra l'uscita del generatore di vuoto per collegarlo alla configurazione sperimentale.Ruotare la valvola principale e le valvole di regolazione sul serbatoio dell'aria per impostare il flusso desiderato. Aprire la valvola a sfera, più vicina al filtro HEPA, quindi aprire la valvola a sfera più vicina al generatore di vuoto. Tienili aperti durante la caratterizzazione o l'esposizione prima di chiuderli.Prima la valvola a sfera più vicina al generatore di vuoto e poi la valvola a sfera più vicina al filtro HEPA. Chiudere le valvole principali e regolatorie sul serbatoio dell'aria per interrompere il flusso. Per pulire, utilizzare il 70% di etanolo per lavare le valvole a sfera e il generatore di vuoto.Mettere tubi metallici in autoclave per la sterilizzazione. Dopo aver coltivato le cellule all'interfaccia del liquido dell'aria, lasciare che le cellule equilibrano per 24 ore. Per assemblare, prendere la base PIVEC con il pozzo rivolto verso l'alto e collegare l'adattatore di inserimento delle impostazioni cultura delle celle nella parte superiore.Aggiungere quattro millilitri di mezzi di coltura cellulare al pozzo della base del PIVEC utilizzando una micropipetta. Utilizzare le pinzette per posizionare l'inserto delle impostazioni cultura delle celle all'interno dell'adattatore. Con la parte stretta del pezzo superiore PIVEC rivolto verso l'alto, connettersi all'adattatore.Con attenzione, avvolgere PIVEC con un unico strato di nastro adesivo. Spingere per collegare pezzi di cassetta da 37 millimetri nella parte superiore e inferiore del PIVEC. Posizionare adattatori spinati da 1/4 di pollice nell'ingresso e nell'uscita della cassetta.Avvolgere il riscaldatore resistivo intorno a PIVEC con i fili alla base. Nastro da fissare. Avvolgere PIVEC con otto colpi di foglio di alluminio per l'isolamento e fissare con nastro adesivo.Collegare tubi di diametro esterno da 1/2 pollice all'adattatore nella parte superiore del PIVEC. Rimuovere i tubi porosi dall'acqua sterile e posizionarsi all'interno dei tubi sopra PIVEC. Sistema di trasferimento sul cofano dei fumi e bloccare il PIVEC sul supporto dell'anello e fissare.Collegare PIVEC al sistema aerosol collegando i tubi da 1/4 di diametro all'uscita del generatore di aerosol ai tubi porosi. Collegare l'uscita del PIVEC a tubi da 1/4 di diametro collegati a un filtro HEPA e a una pompa per vuoto tramite un connettore Y. Accendere le valvole e impostare la portata della pompa su 0,5 litri al minuto.Esporre le cellule alle nanoparticelle di rame per dieci minuti prima di chiudere le valvole e spegnere la pompa. Rimuovere PIVEC dal sistema aerosol. Estraere l'inserto di coltura cellulare utilizzando una pinzetta e posizionarlo nella piastra sterile del pozzo per iniziare i saggi biologici desiderati.Punti di esposizione proposti, rimettere l'inserto nell'incubatore di anidride carbonica. Aspirare i supporti da PIVEC utilizzando un contagocce. Utilizzare il 70% di etanolo per lavare il PIVEC e sterilizzarlo con luce ultravioletta per almeno 30 minuti prima dell'esperimento successivo.Il PIVEC è stato caratterizzato usando tre dimensioni di nanoparticelle di rame per determinare l'efficienza della deposizione. Una maggiore deposizione si osserva complessivamente per il design dei 24 pozzi, quindi il design dei sei pozzi. Diminuisce leggermente per 100 nanometri rispetto alle particelle di rame da 40 nanometri e 800 nanometri.La concentrazione del numero di particelle degli aerosol di nanoparticelle di rame è stata determinata dal sizer di particelle di mobilità a scansione a base di filtro, così come dalle misurazioni del sizer di particelle ottiche. L'analisi post-esposizione può essere accelerata determinando la relazione di dose tra il filtro da 37 millimetri e l'inserto di coltura cellulare. Il confronto mostra una forte correlazione per particelle di rame di 800 nanometri con un valore p inferiore a 0,05.Rispetto ai sistemi di esposizione in vitro a flusso perpendicolare in tutta la letteratura, l'efficienza di deposizione del PIVEC nell'intervallo delle dimensioni delle particelle testate è paragonabile o aumentata rispetto ai valori riportati. La cosa più importante da ricordare è che sebbene questo protocollo dimostri l'uso del PIVEC in un ambiente di laboratorio, è stato progettato per misurare le risposte cellulari agli aerosol nel sito di esposizione. Quando si eseguono test in loco, è importante caratterizzare l'efficienza di deposizione dell'aerosol di prova.L'efficienza di deposizione determina la dose depositata di particelle a cui sono esposte le cellule. Ulteriori test biologici possono essere eseguiti per indagare più endpoint di risposta cellulare a causa dell'esposizione. Il PIVEC è stato utilizzato per valutare la risposta cellulare dovuta agli aerosol generati durante i processi di stampa 3D, come il getto del legante metallico e la fabbricazione di filamenti fusi.L'uso di nanoparticelle, in particolare in forma di aerosol, può essere pericoloso e qualsiasi esposizione deve essere eseguita in una cappa aspirante. Il lavoro cellulare dovrebbe essere fatto in un armadietto di bio-sicurezza.

a-new-portable-in-vitro-exposure-cassette-for-aerosol-sampling

Research

Ricerca

JoVE Journal

Environment

Ambiente

Source: Schaeffer, J. W., Chandler, et al. Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin. J. Vis. Exp. (2018).This video demonstrates the detection of viruses from bioaerosols using an anion exchange resin. A liquid impinger containing the resin is used to capture viruses from the air. The resin is collected and treated with a virus lysis buffer containing carrier RNA. The lysate is transferred to a microcentrifuge tube for viral RNA isolation, followed by qRT-PCR to amplify...

Anion Exchange Resin–Based Detection of Viruses from Bioaerosols

Questo video dimostra la generazione di aerosol di farmaci e la somministrazione mirata di questi aerosol solo per il naso ai topi utilizzando un'unità di inalazione dotata di un generatore di aerosol. Il topo è trattenuto in un sistema di ritenuta solo per il naso e collegato all'unità di inalazione, che eroga il farmaco direttamente nella cavità nasale del topo. Successivamente, il farmaco passa attraverso la trachea ed entra nei polmoni.

Una tecnica per generare e somministrare aerosol di farmaci direttamente nei polmoni dei topi

A tutto il corpo nanoparticelle aerosol impianto esposizione per inalazione è stato costruito per dimensioni nanometriche di biossido di titanio...

Tutto il corpo Nanoparticelle Aerosol esposizioni inalatorie

Presentiamo il VacuSIP, un metodo semplice, non intrusivo e affidabile per il campionamento puntuale pulito e accurato dell'acqua. Il sistema è stato sviluppato e valutato per la raccolta simultanea dell'acqua inalata ed espirata da alimentatori di sospensioni bentoniche in situ, per misurare in modo pulito la rimozione e l'escrezione del particolato e dei composti disciolti.

VacuSIP, un metodo migliorato per Inex<em&gt; In Situ</em&gt; Misura di particolato e sciolto composti elaborati da Alimentatori sospensioni attive

Determinare la diversità fungina all'interno di un ambiente è un metodo utilizzato in studi di salute sul lavoro per identificare i pericoli per la salute. Questo protocollo descrive estrazione del DNA dai campioni d'aria professionali per l'amplificazione e sequenziamento delle regioni ITS fungine. Questo approccio rileva molte specie fungine che possono essere trascurati dai metodi tradizionali di valutazione.

Raccolta e l'estrazione di campioni d'aria professionale per l'analisi del DNA fungoso

Gli utenti di sigaretta elettronica (e-cig) sono in aumento in tutto il mondo. Piccolo, tuttavia, è conosciuto circa gli effetti di salute indotti dagli aerosol inalato di e-cig. Questo articolo descrive una tecnica di generazione dell'aerosol di e-cig adatta per esposizioni animali e successivi studi tossicologici. Tali protocolli sono tenuti a istituire sistemi di esposizione sperimentalmente riproducibile e standardizzato di e-cig.

Generazione di Aerosol di sigaretta elettronica da un dispositivo di macchina-Vaping di terza generazione: applicazione agli studi tossicologici

Un anione cambio metodo a base di resine, adattato a liquido basato su urto bioaerosol campionamento dei virus è dimostrato. Quando accoppiato con rilevazione molecolare a valle, il metodo consente facile e sensibile di rilevazione di virus da bioaerosols.

Rilevamento di virus da Bioaerosols utilizzando resina a scambio anionico

Presentiamo un sistema di esposizione in vitro robusto, trasferibile e predittivo per lo screening e il monitoraggio delle particelle trasportate dall'aria sulla loro citotossicità polmonare acuta esponendo le cellule polmonari umane coltivate all'interfaccia aria-liquido (ALI).

Valutazione della tossicità dell'inalazione acuta delle particelle aerotrasportate esponendo cellule polmonari umane coltivate all'interfaccia aria-liquida

Il protocollo descrive le impostazioni e l'uso di un generatore di aerosol capillare per la produzione continua di aerosol controllato da una soluzione liquida multispecie, adatta per la somministrazione costante di aerosol di grandi volumi (ad esempio, studi di inalazione in vivo ).

Uso del generatore di aerosol capillare nella produzione continua di aerosol controllato per studi non clinici

Descritto è il metodo di coltura cellulare e di esposizione di un modello bronchiale in vitro per un'esposizione realistica e ripetuta all'inalazione alle particelle per le prove di tossicità.

Un modello epiteliale bronchiale interfaccia aria-liquido per un'esposizione realistica e ripetuta all'inalazione alle particelle trasportate dall'aria per i test di tossicità

Stabiliamo un modello standardizzato in vitro per lo studio dell'esposizione ai vapori di cannabis all'interfaccia aria-liquido. Questo modello fornisce un approccio sistematico per esaminare gli impatti della cannabis vaporizzata, affrontando il crescente interesse per i vaporizzatori di cannabis come alternativa al fumo.

In vitro Esposizioni alla cannabis delle cellule epiteliali polmonari all'interfaccia aria-liquido

Scopri il sistema PIVEC per esporre colture cellulari ad aerosol ambientali in tempo reale. Questo metodo permette di valutare lo stress ossidativo e la citotossicità su cellule polmonari coltivate all'interfaccia aria-liquido.

Una nuovo portatile In Vitro l'esposizione Cassette per il campionamento di Aerosol

Esplora altri video