Name: In Vitro modello di differenziazione delle cellule di memoria umana normale B a plasmacellule longevo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Scopri un modello in vitro per la differenziazione delle cellule B di memoria in plasmacellule longevo. Questo sistema multistep replica i cambiamenti trascrizionali e le caratteristiche fenotipiche osservate in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal francese INCA (Institut National du Cancer) Institute (PLBIO15-256), ANR (Tie-Skip) e cancro ITMO (MM & TT).

Il protocollo segue le linee guida in conformità con l'accordo del centro ospedale università di Montpellier per le risorse biologiche e la dichiarazione di Helsinki.
1. in Vitro normale modello di differenziazione delle cellule di Plasma
Nota: Pezzi vengono generati attraverso una cultura di quattro fasi11,12,13.
<ol><li>
Differenziazione e amplificazione delle cellule di b
	<ol>
<li>Utilizzare globuli periferici da volontari sani per la purificazione delle cellule di B di memoria.</li>
		<li>Diluire 7,5 mL di sangue con 24,5 mL di terreno RPMI 1640.</li>
		<li>Aggiungere 12,5 mL di pendenza di densità temperatura ambiente (ad es., Ficoll) in una provetta conica sterile 50 mL. Delicatamente e sovrapporre il gradiente di densità con il 32 mL di sangue diluito. Ridurre al minimo la miscelazione delle due fasi.</li>
		<li>Centrifugare 20 min a 500 x g con il freno fuori. Raccogliere i PBMCs dall'interfaccia di gradienti di densità/plasma diluito e collocare le cellule in una provetta sterile da 50 mL e portare a 45 mL con soluzione salina bilanciata di Hank.</li>
		<li>Centrifugare le cellule per 5 min a 500 x g. Con attenzione rimuovere il supernatante e tenere il pellet.</li>
		<li>Aggiungere 45 mL di siero fetale di vitello RPMI1640/10% (FCS) e centrifugare 5 min a 500 x g. Con attenzione rimuovere il supernatante e tenere il pellet. Aggiungere 30 mL di FCS PBS/2%.</li>
		<li>
Rimuovere le cellule CD2 + usando i branelli magnetici anti-CD2. Aggiungere 4 perline per cella uno obiettivo. Incubare 30 min a 4 ° C.
		<ol>
<li>Celle di tallone associato separate dalle cellule non associate utilizzando un magnete per applicazione di separazione cellulare. Raccogliere le cellule non associate e incubare il pellet cellulare con CD19 APC e anti anticorpi CD27 PE per 15 minuti a 4 ° C (2 µ l di anticorpo per 106 cellule).</li>
			<li>Lavare due volte in siero di capra PBS/10%.</li>
			<li>Rimuovere gli eventi contaminanti su trame sia FSC e SSC. Trama camiciole su FSC-A vs FSC-H e SSC-A vs CHE SSC-H trame per rimuovere i detriti e per selezionare la popolazione totale del leucocita. Selezionare le celle di memoria B CD19/CD27 e CD19+CD27+.</li>
			<li>Purificare MBCs utilizzando un sorter delle cellule con una purezza del 95%.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Eseguire tutti i passaggi di cultura utilizzando IMDM e 10% FCS, completati con umana insulina umana della transferrina e 5 mg/mL 50 mg/mL.</li>
		<li>
Piastra purificato MBCs in piastre di coltura di sei-pozzo (1,5 x 105 MBCs/mL a 5 mL/pozzetto), per 4 giorni, con il-2 (20 U/mL), IL-10 (50 ng/mL) e IL-15 (10 ng/mL).
		<ol>
<li>Aggiungere fosforotioato CpG ODN 2006, istidina-etichettate ricombinante umana solubile CD40L (sCD40L; 50 ng/mL) e anti-polyhistidine mAb (5 mg/mL) per l'attivazione MBCs (Figura 1). Attivazione di sCD40L o ODN solo con la citochina stessa cocktail cede alla più bassa amplificazione12. La combinazione di segnali di attivazione descritta qui al piombo per il numero massimo di attivato le cellule B e PrePBs11,12 (Figura 1).</li>
			<li>Per profili di espressione genica, purificare CD38 /CD20–– PrePBs, al giorno 4, utilizzando un sorter delle cellule (Figura 2).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Generazione di cellule plasmoblastico
	<ol>
<li>Al giorno 4, contare le celle.</li>
		<li>Cellule di piastra in piastre di coltura 12-pozzetti a 2,5 x 105/ml a 2 mL/pozzetto.</li>
		<li>Indurre la differenziazione dalla rimozione di oligonucleotidi CpG e sCD40L e aggiunta di un nuovo terreno di coltura con una citochina nuovo cocktail compreso il-2 (20 U/mL), IL-6 (50 ng/mL), IL-10 (50 ng/mL) e IL-15 (10 ng/mL) (Figura 1). Cellule di coltura per 3 giorni (dal giorno 4 al giorno 7) a 37 ° C.</li>
		<li>Per profili di espressione genica, purificare CD38+/CD20– PBs, giorno 7, utilizzando un sorter delle cellule (Figura 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Generazione delle cellule di plasma anticipata
	<ol>
<li>Al giorno 7, contare le celle.</li>
		<li>Piastra di cellule in piastre di coltura 12-pozzetti a 5 x 105/ml a 2 mL/bene.</li>
		<li>Differenziare PB nei primi PC utilizzando il terreno di coltura fresco con IL-6 (50 ng/mL), IL-15 (10 ng/mL) e IFN-α (500 U/mL) per 3 giorni a 37 ° C. Per profili di espressione genica, purificare CD20–/CD38+/CD138+ pz precoce, al giorno 10, utilizzando un sorter delle cellule (Figura 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Generazione delle cellule di plasma longevo
	<ol>
<li>Differenziarsi primi pz in longevo PC modificando le condizioni di coltura.</li>
		<li>Cultura le cellule in piastre di coltura 12-pozzetti a 5 x 105/ml a 2 mL/bene o in piastre di coltura 24 pozzetti in 1ml/bene a 37 ° C, utilizzando IL-6 e cellule stromali condizionata medio e aprile (200 ng/mL).</li>
		<li>Ottenere stromal cell-condizionato medium di coltura delle cellule stromale per 5 giorni con terreno di coltura. Filtrare il surnatante della cultura di cellule stromali (0,2 µm) e congelare.</li>
		<li>Aggiungere il 50% di media stromal cell-condizionato alle culture di PC con rinnovo ogni settimana. Generato pz longevo essere conservato per mesi13. Sopravvivenza a lungo termine di PC potrebbe essere ottenuto con IL-6 e aprile solo come segnalati13.</li>
		<li>Secrezione di Ig misura da citometria a flusso ordinato pz.</li>
		<li>Cultura pz a 106 cellule/mL per 24 h e raccogliere il surnatante della cultura. Misurare IgG e IgA usando umano enzima-collegata dell'immunosorbente (ELISA) l'analisi Kit11,12,13. La secrezione di IgG mediana ha variata da 10 pg/cellula/giorno al giorno 10 a 17 pg/cellula/giorno al giorno 6013.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. molecolare Atlas di B alla differenziazione di PC
Nota: Abbiamo costruito un accesso comodo e strumenti bioinformatici per estrarre e visualizzare le informazioni più importanti dai dati Affymetrix GEP relazionati al PC differenziazione (GenomicScape)15. GEP sono pubblicamente disponibili da ArrayExpress database (http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/) tra cui purificato MBCs, PrePBs, PBs ed EPCs: E-MTAB-1771, E-MEXP-2360 ed E-MEXP-3034 e BMPC E-MEXP-236014,15. Genomicscape è un webtool liberamente disponibile.
<ol><li>
Selezione di B per PC dataset
	<ol>
<li>Selezionare B per PC dataset nel menu Sfoglia dati nello strumento di bioinformatica di accesso aperto di GenomicScape (http://www.genomicscape.com) chiamato B umano cellule alle cellule di plasma. Visualizzazione del profilo di espressione genica del gene unico o una lista di geni è disponibile utilizzando lo strumento di Espressione-Coexpression Report negli Strumenti di analisi disponibili nella home page.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Analisi di supervisione e analisi delle componenti principali (PCA)
	<ol>
<li>Selezionare Analysis Tools | Webcam per caricare lo strumento di SAM.</li>
		<li>Selezionare il dataset B umano cellule alle cellule di plasma e selezionare i gruppi di campioni da confrontare.</li>
		<li>Utilizzare i diversi filtri disponibili per applicare le opzioni di filtro di interesse.</li>
		<li>Per confrontare i profili di espressione genica con strumento di SAM, modificare le opzioni di filtro tra cui il cambiamento di Fold, numero di permutazioni, tasso di False discovery e il tipo di confronto. GenomicScape calcola l'analisi e fornire geni differenzialmente espressi tra i gruppi selezionati.</li>
		<li>Eseguire analisi delle componenti principali selezionando Analisi delle componenti principali nel menu Strumenti di analisi .</li>
		<li>Selezionare il dataset B umano cellule alle cellule di plasma e selezionare i gruppi di interesse.</li>
		<li>Incollare un elenco di geni di interesse o selezionare geni secondo la varianza. Per incollare un elenco di geni, selezionare Genomicscape per analizzare una lista di geni/ncRNAs, clicca qui... calcolerà PCA che poteva essere visualizzato e scaricato.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Shapiro-Shelef, M., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+plasma-cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of plasma-cell development.</a> Nature Reviews Immunology. 5 (3), 230-242 (2005).</li>
<li>Nutt, S. L., Hodgkin, P. D., Tarlinton, D. M., Corcoran, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+antibody-secreting+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Immunology%22%5BJournal%5D)">The generation of antibody-secreting plasma cells.</a> Nature Reviews Immunology. 15 (3), 160-171 (2015).</li>
<li>Shaffer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blimp-1+orchestrates+plasma+cell+differentiation+by+extinguishing+the+mature+B+cell+gene+expression+program%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Blimp-1 orchestrates plasma cell differentiation by extinguishing the mature B cell gene expression program.</a> Immunity. 17 (1), 51-62 (2002).</li>
<li>Minnich, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional+role+of+the+transcription+factor+Blimp-1+in+coordinating+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Multifunctional role of the transcription factor Blimp-1 in coordinating plasma cell differentiation.</a> Nature Immunology. 17 (3), 331-343 (2016).</li>
<li>Klein, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+IRF4+controls+plasma+cell+differentiation+and+class-switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Immunology%22%5BJournal%5D)">Transcription factor IRF4 controls plasma cell differentiation and class-switch recombination.</a> Nature Immunology. 7 (7), 773-782 (2006).</li>
<li>Gass, J. N., Gunn, K. E., Sriburi, R., Brewer, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stressed-out+B+cells%3F+Plasma-cell+differentiation+and+the+unfolded+protein+response%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Stressed-out B cells? Plasma-cell differentiation and the unfolded protein response.</a> Trends in Immunology. 25 (1), 17-24 (2004).</li>
<li>Goldfinger, M., Shmuel, M., Benhamron, S., Tirosh, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+synthesis+in+plasma+cells+is+regulated+by+crosstalk+between+endoplasmic+reticulum+stress+and+mTOR+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Protein synthesis in plasma cells is regulated by crosstalk between endoplasmic reticulum stress and mTOR signaling.</a> European Journal of Immunology. 41 (2), 491-502 (2011).</li>
<li>Yoshida, H., Matsui, T., Yamamoto, A., Okada, T., Mori, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XBP1+mRNA+is+induced+by+ATF6+and+spliced+by+IRE1+in+response+to+ER+stress+to+produce+a+highly+active+transcription+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">XBP1 mRNA is induced by ATF6 and spliced by IRE1 in response to ER stress to produce a highly active transcription factor.</a> Cell. 107 (7), 881-891 (2001).</li>
<li>Shaffer, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XBP1%2C+downstream+of+Blimp-1%2C+expands+the+secretory+apparatus+and+other+organelles%2C+and+increases+protein+synthesis+in+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">XBP1, downstream of Blimp-1, expands the secretory apparatus and other organelles, and increases protein synthesis in plasma cell differentiation.</a> Immunity. 21 (1), 81-93 (2004).</li>
<li>Reimold, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+cell+differentiation+requires+the+transcription+factor+XBP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Plasma cell differentiation requires the transcription factor XBP-1.</a> Nature. 412 (6844), 300-307 (2001).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+transitional+preplasmablast+population+in+the+process+of+human+B+cell+to+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a transitional preplasmablast population in the process of human B cell to plasma cell differentiation.</a> Journal of Immunology. 187 (8), 3931-3941 (2011).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+differentiation+of+memory+B+cells+into+plasmablasts+and+plasma+cells+including+detailed+phenotypic+and+molecular+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of differentiation of memory B cells into plasmablasts and plasma cells including detailed phenotypic and molecular characterization.</a> Blood. 114 (25), 5173-5181 (2009).</li>
<li>Jourdan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-6+supports+the+generation+of+human+long-lived+plasma+cells+in+combination+with+either+APRIL+or+stromal+cell-soluble+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia%22%5BJournal%5D)">IL-6 supports the generation of human long-lived plasma cells in combination with either APRIL or stromal cell-soluble factors.</a> Leukemia. , (2014).</li>
<li>Kassambara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+miRNA+expression+analysis+identifies+novel+key+regulators+of+plasma+cell+differentiation+and+malignant+plasma+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Global miRNA expression analysis identifies novel key regulators of plasma cell differentiation and malignant plasma cell.</a> Nucleic Acids Research. 45 (10), 5639-5652 (2017).</li>
<li>Kassambara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GenomicScape%3A+an+easy-to-use+web+tool+for+gene+expression+data+analysis.+Application+to+investigate+the+molecular+events+in+the+differentiation+of+B+cells+into+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Computational+Biology%22%5BJournal%5D)">GenomicScape: an easy-to-use web tool for gene expression data analysis. Application to investigate the molecular events in the differentiation of B cells into plasma cells.</a> PLOS Computational Biology. 11 (1), 1004077(2015).</li>
<li>Miremadi, A., Oestergaard, M. Z., Pharoah, P. D., Caldas, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+genetics+of+epigenetic+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Cancer genetics of epigenetic genes.</a> Human Molecular Genetics. 16, Spec No 1 28-49 (2007).</li>
<li>Pei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histone+methyltransferase+MMSET+regulates+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">The histone methyltransferase MMSET regulates class switch recombination.</a> Journal of Immunology. 190 (2), 756-763 (2013).</li>
<li>Le Gallou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-2+requirement+for+human+plasma+cell+generation%3A+coupling+differentiation+and+proliferation+by+enhancing+MAPK-ERK+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-2 requirement for human plasma cell generation: coupling differentiation and proliferation by enhancing MAPK-ERK signaling.</a> Journal of Immunology. 189 (1), 161-173 (2012).</li>
<li>Cocco, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+generation+of+long-lived+human+plasma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">In vitro generation of long-lived human plasma cells.</a> Journal of Immunology. 189 (12), 5773-5785 (2012).</li>
<li>Leung-Hagesteijn, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xbp1s-negative+tumor+B+cells+and+pre-plasmablasts+mediate+therapeutic+proteasome+inhibitor+resistance+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Xbp1s-negative tumor B cells and pre-plasmablasts mediate therapeutic proteasome inhibitor resistance in multiple myeloma.</a> Cancer Cell. 24 (3), 289-304 (2013).</li>
<li>Orlowski, R. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+proteasome+inhibitors+cannot+ERADicate+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Why proteasome inhibitors cannot ERADicate multiple myeloma.</a> Cancer Cell. 24 (3), 275-277 (2013).</li>
<li>Ding, B. B., Bi, E., Chen, H., Yu, J. J., Ye, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IL-21+and+CD40L+synergistically+promote+plasma+cell+differentiation+through+upregulation+of+Blimp-1+in+human+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">IL-21 and CD40L synergistically promote plasma cell differentiation through upregulation of Blimp-1 in human B cells.</a> Journal of Immunology. 190 (4), 1827-1836 (2013).</li>
<li>Tsai, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-1+promotes+immunoglobulin+production+during+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Galectin-1 promotes immunoglobulin production during plasma cell differentiation.</a> Journal of Immunology. 181 (7), 4570-4579 (2008).</li>
<li>Tsai, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin-1+and+galectin-8+have+redundant+roles+in+promoting+plasma+cell+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Galectin-1 and galectin-8 have redundant roles in promoting plasma cell formation.</a> Journal of Immunology. 187 (4), 1643-1652 (2011).</li>
<li>Anginot, A., Espeli, M., Chasson, L., Mancini, S. J., Schiff, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Galectin+1+modulates+plasma+cell+homeostasis+and+regulates+the+humoral+immune+response%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Galectin 1 modulates plasma cell homeostasis and regulates the humoral immune response.</a> Journal of Immunology. 190 (11), 5526-5533 (2013).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homing+and+adhesion+patterns+determine+the+cellular+composition+of+the+bone+marrow+plasma+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Homing and adhesion patterns determine the cellular composition of the bone marrow plasma cell niche.</a> Journal of Immunology. 188 (3), 1283-1291 (2012).</li>
<li>Belnoue, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APRIL+is+critical+for+plasmablast+survival+in+the+bone+marrow+and+poorly+expressed+by+early-life+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">APRIL is critical for plasmablast survival in the bone marrow and poorly expressed by early-life bone marrow stromal cells.</a> Blood. 111 (5), 2755-2764 (2008).</li>
<li>Huard, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((APRIL+secreted+by+neutrophils+binds+to+heparan+sulfate+proteoglycans+to+create+plasma+cell+niches+in+human+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">APRIL secreted by neutrophils binds to heparan sulfate proteoglycans to create plasma cell niches in human mucosa.</a> Journal of Clinical Investigation. 118 (8), 2887-2895 (2008).</li>
<li>Ame-Thomas, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+mesenchymal+stem+cells+isolated+from+bone+marrow+and+lymphoid+organs+support+tumor+B-cell+growth%3A+role+of+stromal+cells+in+follicular+lymphoma+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Human mesenchymal stem cells isolated from bone marrow and lymphoid organs support tumor B-cell growth: role of stromal cells in follicular lymphoma pathogenesis.</a> Blood. 109 (2), 693-702 (2007).</li>
<li>Ramachandrareddy, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BCL6+promoter+interacts+with+far+upstream+sequences+with+greatly+enhanced+activating+histone+modifications+in+germinal+center+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">BCL6 promoter interacts with far upstream sequences with greatly enhanced activating histone modifications in germinal center B cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (26), 11930-11935 (2010).</li>
<li>Li, G., Zan, H., Xu, Z., Casali, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetics+of+the+antibody+response%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Epigenetics of the antibody response.</a> Trends in Immunology. 34 (9), 460-470 (2013).</li>
<li>Miles, R. R., Crockett, D. K., Lim, M. S., Elenitoba-Johnson, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+BCL6-interacting+proteins+by+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Analysis of BCL6-interacting proteins by tandem mass spectrometry.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 4 (12), 1898-1909 (2005).</li>
<li>McManus, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Pax5+regulates+its+target+genes+by+recruiting+chromatin-modifying+proteins+in+committed+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Pax5 regulates its target genes by recruiting chromatin-modifying proteins in committed B cells.</a> The EMBO Journal. 30 (12), 2388-2404 (2011).</li>
<li>Ahmadnejad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+expression+of+DNMT1+is+associated+with+increased+expansion+and+proliferation+of+hematopoietic+stem+cells+co-cultured+with+human+MSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Research%22%5BJournal%5D)">Elevated expression of DNMT1 is associated with increased expansion and proliferation of hematopoietic stem cells co-cultured with human MSCs.</a> Blood Research. 52 (1), 25-30 (2017).</li>
<li>Beguelin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+is+required+for+germinal+center+formation+and+somatic+EZH2+mutations+promote+lymphoid+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">EZH2 is required for germinal center formation and somatic EZH2 mutations promote lymphoid transformation.</a> Cancer Cell. 23 (5), 677-692 (2013).</li>
<li>Herviou, L., Cavalli, G., Cartron, G., Klein, B., Moreaux, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+in+normal+hematopoiesis+and+hematological+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">EZH2 in normal hematopoiesis and hematological malignancies.</a> Oncotarget. 7 (3), 2284-2296 (2016).</li>
<li>Beguelin, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EZH2+enables+germinal+centre+formation+through+epigenetic+silencing+of+CDKN1A+and+an+Rb-E2F1+feedback+loop%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">EZH2 enables germinal centre formation through epigenetic silencing of CDKN1A and an Rb-E2F1 feedback loop.</a> Nature Communications. 8 (1), 877(2017).</li>
<li>Herviou, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PRC2+targeting+is+a+therapeutic+strategy+for+EZ+score+defined+high-risk+multiple+myeloma+patients+and+overcome+resistance+to+IMiDs%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Epigenetics%22%5BJournal%5D)">PRC2 targeting is a therapeutic strategy for EZ score defined high-risk multiple myeloma patients and overcome resistance to IMiDs.</a> Clinical Epigenetics. 10 (1), 121(2018).</li>
<li>Asangani, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+EZH2-MMSET+histone+methyltransferase+regulatory+axis+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Characterization of the EZH2-MMSET histone methyltransferase regulatory axis in cancer.</a> Molecular Cell. 49 (1), 80-93 (2013).</li>
<li>Pei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MMSET+regulates+histone+H4K20+methylation+and+53BP1+accumulation+at+DNA+damage+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MMSET regulates histone H4K20 methylation and 53BP1 accumulation at DNA damage sites.</a> Nature. 470 (7332), 124-128 (2011).</li>
<li>Cui, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EHMT2+inhibitor+BIX-01294+induces+apoptosis+through+PMAIP1-USP9X-MCL1+axis+in+human+bladder+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+International%22%5BJournal%5D)">EHMT2 inhibitor BIX-01294 induces apoptosis through PMAIP1-USP9X-MCL1 axis in human bladder cancer cells.</a> Cancer Cell International. 15 (1), 4(2015).</li>
<li>Santo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+activity%2C+pharmacodynamic%2C+and+pharmacokinetic+properties+of+a+selective+HDAC6+inhibitor%2C+ACY-1215%2C+in+combination+with+bortezomib+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Preclinical activity, pharmacodynamic, and pharmacokinetic properties of a selective HDAC6 inhibitor, ACY-1215, in combination with bortezomib in multiple myeloma.</a> Blood. 119 (11), 2579-2589 (2012).</li>
<li>Amengual, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Targeting+of+Protein+Degradation+Pathways+with+the+Selective+HDAC6+Inhibitor+ACY-1215+and+Bortezomib+Is+Synergistic+in+Lymphoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Dual Targeting of Protein Degradation Pathways with the Selective HDAC6 Inhibitor ACY-1215 and Bortezomib Is Synergistic in Lymphoma.</a> Clinical Cancer Research. 21 (20), 4663-4675 (2015).</li>
<li>Schoenhals, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forced+KLF4+expression+increases+the+generation+of+mature+plasma+cells+and+uncovers+a+network+linked+with+plasma+cell+stage%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Forced KLF4 expression increases the generation of mature plasma cells and uncovers a network linked with plasma cell stage.</a> Cell Cycle. 15 (14), 1919-1928 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare

Negli umani, PC sono rare cellule con fasi di differenziazione che si svolgono in luoghi anatomici che ostacolare la caratterizzazione biologico completo. Abbiamo sviluppato un B in vitro per modello di differenziazione PC utilizzando sistemi di coltura multifase dove varie combinazioni di molecole di attivazione e citochine vengono successivamente applicate al fine di riprodurre il differenziamento sequenziale che si verificano nella diversi organi/tessuti in vivo11,1...

La differenziazione dei linfociti B a plasmacellule (pz) è essenziale per l'immunità umorale e proteggere l'ospite contro le infezioni1. B alla differenziazione di PC è associata con importanti cambiamenti nel metabolismo e capacità di trascrizione per ospitare a secrezione dell'anticorpo. I fattori di trascrizione che controllano B alla differenziazione di PC sono stati ampiamente studiati e rivelate reti esclusive tra cui trascrizione B - e PC-specifici fattori (TFs)2. In cellule di B, PAX5, BCL6 e BACH2 TFs sono i guardiani delle cellule B identità2,3. Induzione di IRF4, PRDM1 codifica BLIMP1 e XBP1 PC TF sarà estinguere i geni delle cellule B e indurre un coordinato disecrezione cella programma trascrizionale3,4,5. Queste modifiche trascrizionali coordinate sono associate con attivazione di trascrizione di geni Ig insieme con un interruttore dal modulo membrana-limita per la forma secreta della catena pesante dell'immunoglobulina2,3, 4. B alla differenziazione di PC è collegato con l'induzione di geni coinvolti nel reticolo endoplasmatico e Apparato del Golgi funzioni concomitante con l'attivazione di risposta (UPR) spiegata della proteina conosciuta per svolgere un ruolo chiave nel PC ospitando la sintesi di secreto immunoglobuline6,7. Il TF XBP1 svolge un ruolo importante in questo adattamento cellulare8,9,10.
Linfociti B e i PC sono attori chiave della immunità umorale. Comprendere il biologico, i processi che controllano la produzione e la sopravvivenza delle cellule di plasma normale è cruciale in interventi terapeutici che devono garantire efficienti risposte immunitarie e prevenire l'autoimmunità o immunodeficienza. PC sono rare cellule con le fasi iniziali di differenziazione che si svolgono nelle posizioni anatomiche che ostacolano la caratterizzazione biologico completo, particolarmente nell'uomo. Utilizzando sistemi di coltura di multi-step, abbiamo segnalato un B in vitro al modello di differenziazione del PC. Questo modello riproduce il sequenziale di differenziamento e maturazione che si verificano in diversi organi in vivo11,12,13. In una prima fase, le cellule B di memoria sono attivate in primo luogo per quattro giorni da CD40 ligando, oligodeoxynucleotides e citochina combinazione e differenziano in preplasmablasts (PrePBs). In una seconda fase, preplasmablasts sono indotte a differenziarsi in plasmablasts (PBs) rimuovendo la stimolazione CD40L e oligodeoxynucleotides e cambiando la combinazione di citochina. In una terza fase, plasmablasts sono indotte a differenziarsi nei primi PC modificando la citochina combinazione11,12. Un quarto passo è stato introdotto per ottenere pienamente matura pz coltivando questi primi PC con medium condizionate di cellule stromali di midollo osseo o selezionati fattori di crescita13. Questi PC maturi potrebbero sopravvivere parecchi mesi in vitro e secernono una quantità elevata di immunoglobulina (Figura 1). È interessante notare che, il nostro modello in vitro ricapitola le modifiche trascrizionali coordinate e il fenotipo della B diverso a fasi di PC che possono essere rilevati in vivo11,12,13,14 ,15. I PC sono rare cellule e il nostro modello di differenziazione in vitro permette di studiare umano B alla differenziazione di PC.

<table><tbody><tr><td>perline magnetiche anti-CD2</td><td>Invitrogen</td><td>11159D</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD138-APC</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td>B49219</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD19-APC</td><td>BD</td><td>555415</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD20-PB</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td>B49208</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD27-PE</td><td>BD</td><td>555441</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD38-PE</td><td>Beckman-Coulter&nbsp;</td><td>A07779</td><td></td></tr><tr><td>Anti-istidina</td><td>R& D Systems</td><td>MAB050</td><td></td></tr><tr><td>CpG ODN(PT)</td><td>sigma</td><td></td><td>T*C*G*T*C*G*T*T*T*T*T*T*T*C* G*T*T*T*C*G*T*T</td></tr><tr><td>transferina umana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3309</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&alpha;</td><td>Merck</td><td>Intron A</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>31980-022</td><td></td></tr><tr><td>Ricombinante Umano CD40L-hi</td><td>R& D Systems</td><td>2706-CL</td><td></td></tr><tr><td>Umano Ricombinante APRIL</td><td>R& D Systems</td><td>5860-AP-010</td><td></td></tr><tr><td>IL-10 umano ricombinante</td><td>R& D Systems</td><td>217-IL-IL-Ricombinante</td><td></td></tr> <tr><td>Umano IL-15</td><td>Peprotech</td><td>200-15-10ug</td><td></td></tr><tr><td>Ricombinante Umano IL-2 Proteina</td><td>R & D Systems</td><td>202-IL-IL-Ricombinante</td><td></td></tr> <tr><td>Umano IL-6</td><td>Peprotech</td><td>200-06</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro modello di differenziazione delle cellule di memoria umana normale b a plasmacellule longevo

In Vitro Differentiation Model of Human Normal Memory B Cells to Long-lived Plasma Cells

Le cellule di plasma (pz) secernono grandi quantità di anticorpi e si sviluppano dalle cellule di B che sono state attivate. PC sono rare cellule situate nel midollo osseo o mucosa e garantire l'immunità umorale. A causa della loro bassa frequenza e la posizione, lo studio dei PC è difficile nell'essere umano. Abbiamo segnalato un B per PC modello di differenziazione in vitro utilizzando combinazioni selezionate di citochine e l'attivazione di molecole che consentono di riprodurre la differenziazione delle cellule sequenziale che si verificano in vivo. In questo modello in vitro, cellule di B (MBCs) differenzierà in pre-plasmablasts (prePBs), plasmablasts (PBs), presto PC memoria e infine, longevo pz, con un fenotipo vicino alle loro controparti in individui sani. Abbiamo inoltre sviluppato un accesso aperto bioinformatica strumenti per analizzare le informazioni più importanti dai dati GEP legate alla differenziazione di PC. Queste risorse possono essere utilizzate per studiare umano B alla differenziazione di PC e nello studio corrente, abbiamo studiato la regolazione dell'espressione genica di fattori epigenetici durante B umana alla differenziazione di PC.

La procedura complessiva di differenziazione in vitro di PC normale è rappresentata nella Figura 1. Utilizzando il protocollo presentato qui, potremmo generiamo un'adeguata quantità di cellule che non potrebbero essere ottenuti con campioni ex vivo umano. Anche se è stato studiato il ruolo della complessa rete di fattori di trascrizione coinvolti nella differenziazione dei PC, i meccanismi che regolano la reti di trascrizione chiave PC differenziazione ancora...

Utilizzando sistemi di coltura di multi-step, segnaliamo un in vitro delle cellule B al modello di differenziazione delle cellule di plasma.

In Vitro modello di differenziazione delle cellule di memoria umana normale B a plasmacellule longevo

Plasma cells (PCs) secrete large amounts of antibodies and develop from B cells that have been activated. PCs are rare cells located in the bone marrow or ...

Le cellule plasmatiche sono cellule rare con 30 fasi di differenziazione che si svolgono in luoghi anatomici che compromettono la piena caratterizzazione biologica, in particolare nell'uomo. Il nostro modello di differenziazione delle cellule plasmatiche B2 in vitro riproduce la differenziazione sequenziale delle cellule e la maturazione che si verificano nei diversi organi in vivo. Questo modello in vitro riassume i cambiamenti trascrizionale coordinati e il fenotipo dei diversi stadi delle cellule plasmatiche B2 che possono essere rilevati in vivo.Abbiamo anche creato uno strumento bioinformatico ad accesso aperto per analizzare le informazioni più importanti dai dati di esplorazione relativi alla differenziazione delle cellule plasmatiche. A dimostrare la procedura sarà Hugues de Boussac, un postdoc del mio laboratorio. Per iniziare, ottenere cellule del sangue periferiche da volontari sani per la purificazione cellulare della memoria B.Diluire 7,5 millilitri di sangue con 24,5 millilitri di mezzo RPMI 1640. Successivamente, aggiungere 12,5 millilitri di gradiente di densità a temperatura ambiente a un tubo conico sterile da 50 millilitri. Sovrapporre delicatamente il gradiente di densità con i 32 millilitri di sangue diluito, assicurandosi di ridurre al minimo la miscelazione delle due fasi.Centrifugare per 20 minuti a 500 volte la gravità con il freno spento. Raccogliere le cellule mononucleari del sangue periferico dall'interfaccia del plasma diluito e del gradiente di densità. Trasferire le cellule in un tubo sterile da 50 millilitri e riempire il tubo fino a 45 millilitri con la soluzione di sale bilanciato di Hank.Centrifuga a 500 volte la gravità per cinque minuti. Rimuovere con cura il supernatante e conservare il pellet. Quindi, aggiungere 45 millilitri di mezzo RPMI 1640, integrati con il 10%FCS.Centrifuga a 500 volte la gravità per cinque minuti. Rimuovere con cura il supernatante e conservare il pellet. Aggiungere 30 millilitri di PBS, integrati con il 2%FCS.Utilizzare perline magnetiche anti-CD per rimuovere le cellule cd2 positive aggiungendo quattro perline per una cella di destinazione. Incubare a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Utilizzando un magnete per l'applicazione della separazione cellulare, separare le cellule legate al tallone dalle celle non associate.Raccogliere le cellule non unite e incubarle con anticorpi anti-CD19 APC e anti-CD27 PE per quindici minuti a quattro gradi Celsius. Lavare le cellule due volte in PBS contenente il 10% di siero di capra. Utilizzare quindi lo smistatore di celle per purificare le celle della memoria B con una purezza del 95%.Successivamente, aggiungere ligando CD40 solubile e anticorpo monoclonale anti-poliistidina per l'attivazione delle cellule B della memoria. Placcare le cellule B della memoria purificata in piastre di coltura a sei pozzi per quattro giorni con interleuchina-2, interleuchina-10 e interleuchina-15. Per la profilazione dell'espressione genica, usa uno smistatore di cellule per purificare i preplasmablasti CD38-negativi CD20-negativi al quarto giorno.Il quarto giorno, conta le cellule e placcale in piastre di coltura di 12 pozzetti ad una densità cellulare di 250.000 cellule per millilitro aggiungendo due millilitri di sospensione cellulare in ogni pozzo. Per indurre la differenziazione, rimuovere gli oligonucleotidi CPG e il ligando CD40 solubile e aggiungere un nuovo mezzo di coltura contenente un nuovo cocktail di citochine tra cui interleuchina-2, interleuchina-6, interleuchina-10 e interleuchina-15. Coltura delle cellule per tre giorni a 37 gradi Celsius.Per la profilazione dell'espressione genica, usa uno smistatore di cellule per purificare i plasmablasti CD38 positivi, CD20 negativi al settimo giorno. Il settimo giorno, conta le cellule. Placcare le cellule in piastre di coltura di 12 porcile a una densità cellulare di 500.000 cellule per pozzo, aggiungendo due millilitri di sospensione cellulare ad ogni pozzo.Differenziare i plasmablasti in prime cellule plasmatiche usando un mezzo di coltura fresco contenente interleuchina-6, interleuchina-15 e interferone-alfa per tre giorni a 37 gradi Celsius. Per la profilazione dell'espressione genica, utilizzare uno smistatore di cellule per purificare le cellule plasmatiche precondo cd20 negative, CD38 positive, CD138-positive al giorno 10. In primo luogo, coltura cellule stromali per cinque giorni con mezzo di coltura.Utilizzare un filtro da 0,2 microliter per filtrare il supernatante di coltura cellulare stromale per ottenere un mezzo condizionato della cella stromica e congelare fino a quando non è pronto per l'uso. Successivamente, coltura le prime cellule plasmatiche in piastre di coltura a 12 pozzi, usando il mezzo cellulare stromale precedentemente ottenuto con interleuchina-6 e APRIL ad una densità cellulare di 500.000 cellule per pozzo, aggiungendo due millilitri di sospensione cellulare ad ogni pozzo. Incubare a 37 gradi Celsius, rinnovando il mezzo condizionato della cellula stromale ogni settimana.Quindi, misurare la secrezione di immunoglobulina dalla citometria del flusso ordinata cellule plasmatiche. Coltura delle cellule plasmatiche ad una densità di un milione di cellule per millilitro per 24 ore e raccogliere il supernatante di coltura. Utilizzando un kit ELISA, misurare l'immunoglobulina G e l'immunoglobulina A.First, lanciare lo strumento web di bioinformatica ad accesso aperto GenomicScape.Nel menu sfoglia dati selezionare il set di dati denominato cellule B umane in celle plasmatiche. La visualizzazione del profilo di espressione genica di un gene univoco o di un elenco di geni è disponibile utilizzando lo strumento Expression/Coexpression Report negli strumenti di analisi. Selezionare Quindi Strumenti di analisi webSAM per caricare lo strumento SAM.Scegliere le cellule B umane nel set di dati delle celle plasmatiche e selezionare il gruppo di campioni da confrontare. Utilizzare i diversi filtri disponibili per applicare le opzioni di filtro di interesse. Per confrontare i profili di espressione genica con lo strumento SAM, modificare le opzioni di filtro, tra cui la modifica della piegatura, il numero di permutazioni, la velocità di individuazione falsa e il tipo di confronto.Il software calcola l'analisi e fornisce geni espressi in modo differenziato tra i gruppi selezionati. In questo studio, vengono studiati i cambiamenti di espressione dei fattori epigenetici nella normale differenziazione delle cellule plasmatiche. Utilizzando l'analisi SAM multiclasse, Si vede che 71 geni sono significativamente espressi in modo differenziato tra le cellule B della memoria, i preplasmablasti, i plasmablasti, le prime cellule plasmatiche e le cellule plasmatiche del midollo osseo con un tasso di scoperta falso inferiore al 5%Lo stadio cellulare della memoria B è caratterizzato dalla sovraespressione di 23 geni del giocatore epigenetico, tra cui il 39,13% dell'acetiltransferasi istonale, il 30,43% delle transferasi istonali , il 21,74% delle demetilasi istone, il 4,35% delle proteine leganti metiliche e il 4,35% delle deacetilasi istono.14 geni del giocatore epigenetico sono sovraespressi in modo significativo allo stadio del preplasmablasto, tra cui il 50% dell'istone metiltransferasi, il 14,28% del DNA metiltransferasi, il 21,43% delle deacetilasi istone, il 7,14% delle demetilasi istone e il 17,14% delle acetiltransferasi istone. Seguendo questa procedura, potrebbero essere eseguite diverse analisi per identificare e comprendere le modifiche nella struttura e nell'architettura della cromatina durante questa differenziazione delle cellule plasmatiche B2. Questo modello di differenziazione in vitro permetterà di generare abbastanza cellule per completare questa analisi molecolare per rivelare sia le vie coinvolte in tutta questa modellazione che il loro impatto trascrizionale a valle durante la differenziazione delle cellule plasmatiche B2.Queste conoscenze derivate da questa ricerca potrebbero informare e istruire sulle strategie diagnostiche e terapeutiche per i disturbi delle cellule plasmatiche, come nel caso del mieloma multiplo, un cancro senza una cura definitiva, per il quale sono fondamentali una migliore prognosi e strategie terapeutiche migliorate. Caratterizzare e comprendere i cambiamenti strutturali e architettonici di rimodellamento epigenetico che influenzano la cromatina durante la differenziazione delle cellule plasmatiche B2 sarà di particolare interesse. Questo potrebbe essere fatto usando sequenziamento genico, ERRBS, sequenziamento ATAC, IC e sequenziamento dell'RNA.Un'eterogeneità moderata potrebbe essere osservata nella percentuale di cellule B attivate, preplasmablasti, plasmablasti e cellule plasmatiche, a seconda del sangue del donatore sano, utilizzato per la purificazione cellulare della memoria B.

in-vitro-differentiation-model-human-normal-memory-b-cells-to-long

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Descriviamo un metodo per generare linee cellulari B trasformate con virus di Epstein-Barr virus. Abbiamo anche illustrare un nuovo metodo di analisi in grado di identificare le cellule B destinato a subire trasformazioni già tre giorni dopo l'infezione.

Istituzione di Epstein-Barr Virus Growth-trasformata linee linfoblastoidi

La sintesi di anticorpi monoclonali umani è il primo passo negli studi volti a svelare i meccanismi fisiopatologici delle risposte immunitarie mediate da auto-anticorpi. Abbiamo sviluppato un protocollo per generare anticorpi monoclonali ricombinanti di immunoglobuline G (IgG) umane da cellule B selezionate per sangue, tra cui l'isolamento delle cellule B, il clonaggio di anticorpi e la sintesi in vitro.

Generazione di ricombinante umano IgG anticorpi monoclonali da immortalizzate cellule ordinati B

Il sangue periferico umano è comunemente usato per la valutazione della risposta immunitaria umorale. Qui vengono descritti i metodi per isolare le cellule B umane dal sangue periferico, differenziare le cellule B umane in cellule B secernenti anticorpi (ASC) in coltura ed enumerare le IgM- e IgG-ASC totali tramite un test ELISpot.

L&#39;isolamento, la differenziazione e quantificazione di Human anticorpo-secernenti cellule B da sanguigno: ELISpot come una lettura funzionale del umorale immunità

Questo protocollo descrive la generazione riproducibile e fenotipizzazione delle cellule T regolatorie indotte umane (iTregs) dalle cellule naïve T CD4 + in vitro. Diversi protocolli per l'induzione FOXP3 permettono lo studio di specifici fenotipi iTreg ottenuti con rispettivi protocolli.

La differenziazione in vitro di cellule CD4 + umana FOXP3 + indotta da T regolatorie (iTregs) da cellule T CD4 Naïve utilizzando un protocollo TGF-β contenenti

Un semplice metodo di lisi dei globuli rossi per stabilire B-LCL stato sviluppato con alta efficienza di immortalizzazione, richiede una piccola quantità di sangue e risparmio di tempo tra l'inizio di crioconservazione.

Un cellulare semplice Red Blood Metodo Lysis per l&#39;istituzione di B linfoblastoidi linee cellulari

Descriviamo un metodo per la produzione di anticorpi umani specifici per un antigene di interesse, a partire da rari linfociti B circolanti nel sangue umano. Generazione di questi anticorpi naturali è efficiente e rapido, e gli anticorpi ottenuti in grado di discriminare tra antigeni altamente correlati.

Generazione di anticorpi monoclonali umani discriminante da rari B antigene-specifiche cellule circolanti nel sangue

Questo articolo descrive un nuovo metodo per generare emigranti timici (iTE) derivati da cellule staminali specifiche dell'antigene tumorale del tumore da un sistema di coltura timica tridimensionale (3D). ITE sono un sottoinsieme omogeneo di cellule T strettamente correlate alle cellule T ingenue con la capacità di proliferazione, formazione della memoria, e la soppressione del tumore.

Un sistema di coltura timica tridimensionale per generare emigrati timici derivati da murine

Il metodo BSelex per identificare e recuperare singoli anticorpi specifici dell'antigene dalle cellule mononucleari del sangue periferico umano combina citometria di flusso con PCR a cella singola e clonazione.

Metodo di screening a singola cellula per la selezione e il recupero di anticorpi con specifiche desiderate da popolazioni di cellule di memoria umana b arricchite

Descriviamo qui una semplice analisi dell'eterogeneità del compartimento delle cellule B immunitarie murine nel peritoneo, nella milza e nei tessuti del midollo osseo mediante citometria a flusso. Il protocollo può essere adattato ed esteso ad altri tessuti di topo.

Caratterizzazione citometrica a flusso dello sviluppo delle cellule B murine

Questo protocollo descrive la differenziazione di cellule T CD4+ naive in cellule Th17 patogene in vitro. In particolare, se combinato con un approccio basato sulla citometria a flusso multiparametrica, è possibile ottenere una purezza del 90% delle cellule Th17 patogene da cellule T CD4+ naive utilizzando questo metodo di differenziazione.

Differenziazione in vitro di cellule T CD4+ naive in cellule Th17 patogene nel topo

Per studiare la differenziazione e la funzione in vitro delle cellule T CD8, le cellule T CD8 possono essere isolate dal topo per essere co-colte a lungo termine con organoidi epiteliali vaginali murini infetti preformati. Qui descriviamo questo processo e valutiamo l'acquisizione dei marcatori residenti delle cellule T della memoria durante la co-coltura.

In vitro Differenziazione delle cellule T CD8 della memoria residente utilizzando il sistema di co-coltura organoide-cellula T epiteliale

Scopri un modello in vitro per la differenziazione delle cellule B di memoria in plasmacellule longevo. Questo sistema multistep replica i cambiamenti trascrizionali e le caratteristiche fenotipiche osservate in vivo.

In Vitro modello di differenziazione delle cellule di memoria umana normale B a plasmacellule longevo

Esplora altri video