Name: Simultanea stimolazione elettrica e meccanica per migliorare il potenziale di cardiomiogenici delle cellule (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: Scopri la stimolazione elettromeccanica simultanea per migliorare il potenziale cardiomiogenico delle cellule. Questa tecnica avanzata consente applicazioni in terapia cellulare, modellazione di malattie e screening farmacologico.

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Gli autori desiderano ringraziare i membri del gruppo Strumentazione Biomedica (UPC, Barcellona), soprattutto prof J. Rosell-Ferrer ed elettronica e il programma di ricerca di ICREC (IGTP, Badalona). Inoltre, gli autori riconoscono le cellule staminali Translational Medicine journal e AlphaMed Press per consentire l'adattamento delle figure precedentemente pubblicati (Llucià-Valldeperas, et al. 30). lo sviluppo di questo prototipo e la progettazione del protocollo sono stati sostenuti dal Ministerio de Educación y Ciencia (SAF 2008-05144), Ministerio de Economía y Competitividad (SAF 2014-59892), la Commissione europea 7 ° programma quadro ( RECATABI, NMP3-SL-2009-229239), Fundació La Marató de TV3 (080330, 201516, 201502) e Fundación para la Innovación y la Prospectiva dell'en Salud España (FIPSE; 06-00001396-15).

Questo studio utilizza ATDPCs cardiaco umano da campioni di pazienti. Loro uso è stato approvato dal comitato etico locale, e tutti i pazienti hanno dato il consenso informato. Il protocollo di studio è conforme ai principi delineati nella dichiarazione di Helsinki.
1. preparati
<ol><li>Autoclave due pinzette, 12 elettrodi di platino PTFE per la stimolazione elettrica e alcuni asciugamani di carta, a 121 ° C per 20 min.</li>
	<li>
Sterilizzare 12 costrutti su ordine di PDMS (Figura 1A).
	<ol>
<li>Lavare ogni costrutto con 5 mL di acqua distillata sterile con agitazione magnetica a temperatura ambiente per 15 min.</li>
		<li>Lavare 1 x 5 ml di etanolo al 70% con agitazione magnetica a temperatura ambiente per 5 min.</li>
		<li>Lavare 5 volte con 5 mL di acqua distillata sterile con agitazione magnetica a temperatura ambiente per 10 min per lavaggio, per rimuovere i residui alcolici.</li>
		<li>Asciugare i costrutti su carta sterile assorbente all'interno il pernottamento del gabinetto di flusso.</li>
		<li>Memorizzarli in provette da centrifuga sterile 50ml fino all'utilizzo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. cellula semina (giorno -1)
<ol><li>Prima semina cellulare, trasferire i costrutti PDMS puliti a piastre sterili ed esporli alla luce ultravioletta per 5 min garantire una sterilizzazione completa.</li>
	<li>Trasferire ogni costrutto a una piastra di coltura cellulare di 35 mm o 6 pozzetti, per il seeding cellulare immediato.</li>
	<li>
Tripsinizzano un pallone T75 confluente di ATDPCs cardiaca.
	<ol>
<li>Lavare il matraccio T75 con 5 mL di tampone fosfato salino (PBS): 1x.</li>
		<li>Aggiungere 1 mL di tripsina-EDTA 0,05% e incubare a 37 ° C per 5 min staccare le cellule.</li>
		<li>Aggiungere 5 mL di terreno completo per inattivare la tripsina-EDTA.</li>
		<li>Raccogliere tutte le celle in un tubo da 15 mL e lavare la beuta 2 volte con 5 mL di PBS per raccogliere tutte le cellule rimanenti.</li>
		<li>Centrifugare a 230 x g per 5 min a 22 ° C, eliminare il surnatante e risospendere le cellule in 2 mL di terreno completo di contarli con la camera di un emocitometro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Seme 200 µ l di ATDPCs cardiaca (2,5 x 105 cellule/mL) nel pool delle cellule dei costrutti PDMS 12 (Figura 1A, B) avere ~ 80% della superficie della semina coperta dalle cellule il giorno dopo e incubare a 37 ° C e 5% CO2. Nota: Dopo 2 – 4 h, le cellule devono essere collegate. Inoculo di cellule è preparata secondo la dimensione delle cellule e la crescita. Per cellule più piccole, la densità di semina deve essere aumentata.</li>
	<li>Delicatamente aggiungere 2 mL di terreno completo preriscaldata (α-MEM completati con 10% fetale bovino del siero, 1% L-Glutammina e 1% penicillina-streptomicina) per piastra.</li>
	<li>Incubare per una notte i costrutti alle condizioni di coltura (di solito 37 ° C e 5% CO2).</li>
</ol>3. elettromeccanico stimolazione Setup (giorno 0)
<ol><li>Prima di iniziare la procedura di prendere sei costrutti per stimolazione elettromeccanico e sei come controlli nonstimulated. Con meno di sei piastre per stimolazione, utilizzare costrutti di vuoti con lo stesso volume medio per garantire il corretto campo elettrico stimolazione.</li>
	<li>Pulire l'unità di stimolazione con etanolo al 70% e collocare nel flusso di armadio.</li>
	<li>Portare gli elettrodi sterili e pinzette all'interno dell'armadio di flusso.</li>
	<li>Eliminare il 90% dei media dalla piastra di coltura per manipolare facilmente degli elettrodi e dei costrutti. In primo luogo, è possibile posizionare i costrutti PDMS nella giusta posizione per garantire attrazione magnetica (spostamento di PDMS all'interno del piatto di cultura verso il magnete) tra magneti fissi e mobili. Quindi, collegare il filo di platino per i connettori di elettrodo e la parte PTFE nel suo spazio designato nel costrutto PDMS.</li>
	<li>Aggiungere 2,5 mL di terreno completo preriscaldato nuovo ogni costrutto. Nota: Mantenere la sterilità durante tutta la procedura e operare su un costrutto in un momento. Mantenere il resto dei costrutti in incubatore a 37 ° C e 5% CO2 fino all'utilizzo.</li>
	<li>Una volta che tutti i costrutti di PDMS sono collocati ed elettricamente collegati alla piattaforma, riportare la piattaforma in incubatore a 37 ° C e 5% CO2.</li>
	<li>Collegare la sorgente elettrica e meccanica.</li>
	<li>
Configurare il programma di stimolazione. Specificare i regimi di stimolazione elettrica e meccanica attraverso le interfacce utente di stimolatori elettrici e l'applicazione, che controlla la stimolazione meccanica. Impostare il sincronismo come segue.
	<ol>
<li>Accendere l'elettrostimolatore. Attesa per il menu principale ad apparire sul display.<ol>
<li>Quindi, selezionare opzione 2: modificare la sequenza + invio.</li>
			<li>Modificare la sequenza di Menu come segue.<ol>
<li>Utilizzare la scheda di modalità per selezionare tensione o corrente. Selezionare corrente facendo + e premere invio.</li>
				<li>Per la scheda di ampiezza , selezionare 1 (mA) con + /- e premere invio.</li>
				<li>Per il Periodo (T), seleziona 1000 (ms) con + /- e premere invio.</li>
				<li>Impostare la durata dell'impulso (Tw) su 2 (ms) con + /- e premere invio.</li>
				<li>Per la scheda di Trigger modalità , selezionare esterno dal software e premere invio.</li>
				<li>Ritorna al menu principale, selezionare opzione 4: generare la sequenza e premere invio. Nota: Lo stimolatore elettrico riposa in standby fino a quando riceve un comando di trigger dall'applicazione di stimolatore meccanico attraverso la porta seriale.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Eseguire la procedura seguente nella sezione stimolazione meccanica l'applicazione del pannello di controllo (Figura 2C).<ol>
<li>Scrivere 1.000 (ms) nel controllo di testo Periodo di impulso .</li>
			<li>Scrivere 500 (ms) nel controllo di testo tempo ON (Tw) per impostare la durata dell'impulso meccanico.</li>
			<li>Scrittura 2.000 (AU) nel controllo di testo escursione a consegnare un allungamento del costrutto di 10%. Questo è il numero di passi del motore di controllo lineare. Nota: Il protocollo di stimolazione applicato qui consiste di impulsi a onda quadra monofasica corrente alternata 2 ms 50 mV/cm a 1 Hz e 10% che si estende per 7 giorni. I tempi di ascesa e la caduta dell'impulso meccanico sono impostati su 100 ms, per imitare approssimativamente la forma dell'impulso di pressione di focolare. Inoltre, la modalità di ripetizione è impostata su continua e c'è un contatore che Visualizza il numero di impulsi.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cambiare il supporto 2 volte alla settimana (lunedì e giovedì pomeriggio). Innanzitutto, rimuovere i vecchi media; Successivamente, aggiungere i media caldi sui lati del supporto PDMS, mai direttamente sulla piscina cella. Nota: Se le cellule hanno un tasso di crescita elevato, i media dovrebbe essere cambiata 3 volte a settimana (ad esempio, lunedì, mercoledì e venerdì). È necessario scollegare e ricollegare tutti i cavi, ma non c'è nessuna necessità di rimuovere le piastre di coltura ed elettrodi dal loro posto.</li>
	<li>Raccogliere i campioni dopo la sperimentazione viene eseguita.</li>
</ol>4. campione insieme alla fine della sperimentazione (giorno 7)
<ol><li>
Per le analisi di RNA
	<ol>
<li>Lavare il costrutto 2x con 3 mL di PBS 1X per 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Aggiungere 3 mL di tripsina-EDTA 0,05% per ogni piatto (sufficiente a coprire l'intero costrutto) e aspettare per 5 min a 37 ° C.</li>
		<li>Dopo le cellule sono staccate, aggiungere 2 mL di terreno completo per inattivare la tripsina-EDTA.</li>
		<li>Raccogliere tutte le celle in una 15 mL tubo e lavare il costrutto 2x con 3 mL di PBS per raccogliere tutte le cellule rimanenti.</li>
		<li>Centrifugare a 230 x g per 5 min 22 ° C.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet in 1 mL di PBS.</li>
		<li>Trasferire la soluzione di cella in una provetta da 1,5 mL e centrifugare a 230 x g per 5 min.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante e conservare il pellet a-80 ° C a 700 µ l di reagente di lisi per ulteriore isolamento del RNA.</li>
		<li>Isolare il RNA usando un kit commerciale, seguendo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Retromarcia-trascrivere il RNA isolato usando il kit di esameri casuali, secondo il protocollo del produttore.</li>
		<li>Piccole concentrazioni di RNA, preamplificare e, quindi, diluire 1:5 con acqua RNAsi-libera prima che venga eseguita la reazione a catena della polimerasi successiva trascrizione d'inversione in tempo reale (RT-PCR). Continuare con il protocollo standard per RT-PCR in tempo reale e controllare i principali marcatori cardiaci. Nota: Gli indicatori cardiaci tipici comprendono marcatori precoci e tardi da diverse categorie, come fattori di trascrizione cardiaco (rinforzatore del miocita specifico fattore 2A [MEF2A], proteina GATA-4 [GATA-4]) e strutturali (troponina cardiaca ho [cTnI], cardiaca troponina T [cTnT], α-actinina) e regolamento del calcio (Connexin43 [Cx43], sarco-/ del reticolo endoplasmatico Ca2 +-ATPase [SERCA2])30. Isolamento della proteina può essere eseguita anche se necessaria. Isolamento di RNA e proteina simultanea può essere eseguita con lo stesso campione, utilizzando commercialmente disponibili reagenti e Kit (Tabella materiali) se la quantità di campione è minore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Per immunostainings Nota: Questa operazione è eseguita direttamente sulle cellule adiacente alla piscina di cella del costrutto PDMS. Pertanto, si consiglia di mettere, ogni volta, 1 x 1 cm della pellicola di paraffina nella parte superiore della piscina di cella, a parte la piastra del coperchio, per ridurre al minimo l'evaporazione delle soluzioni di incubazione.<ol>
<li>Lavare il costrutto 2x con 3 mL di PBS per 5 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Fissare le cellule attaccate al costrutto con 2 mL di formalina al 10% per 15 min a temperatura ambiente.</li>
		<li>Lavare le cellule 3 x con 3 mL di PBS per 5 min a temperatura ambiente. Per l'archiviazione a lungo termine, lasciare i campioni in PBS con 0,1% di sodio azide a 4 ° C.</li>
		<li>Permeabilize le cellule con 3 mL di PBS + 0,5% detergente (3x, in ogni tempo di 5 – 10 min, a temperatura ambiente).</li>
		<li>Incubare le cellule con 100 µ l di PBS + 0,2% detergente + 10% di siero equino, albumina di siero bovino 1% a temperatura ambiente per 1 h, per bloccare il legame non specifico anticorpo.</li>
		<li>Incubare le cellule con 100 µ l di PBS + 10% di siero di cavallo + detergente 0,2% + 1% di albumina di siero bovino e anticorpo primario a temperatura ambiente per 1 h. Ad esempio, gli anticorpi primari contro Cx43 (1: 100), sarcomeriche α-actinina (1: 100), GATA-4 (01:50), MEF2 (01:25) e SERCA2 (01:50).</li>
		<li>Lavare 3 volte con 3 mL di PBS a temperatura ambiente per 5 min.</li>
		<li>Incubare le cellule con 100 µ l di PBS + anticorpo secondario a temperatura ambiente al buio per 1 h. Nota: Anticorpi secondari coniugati con diversi fluorofori e un agente di counterstaining sono stati usati.</li>
		<li>Lavare 3 volte con 3 mL di PBS a temperatura ambiente al buio per 5 min.</li>
		<li>Incubare le cellule con 100 µ l di (0,1 µ g/mL) di macchiatura nucleare PBS a temperatura ambiente al buio per 15 min.</li>
		<li>Lavare 3 volte con 3 mL di PBS a temperatura ambiente al buio per 5 min.</li>
		<li>Conservare i campioni in 3 mL di PBS con 0,1% di sodio azide a 4 ° C fino all'acquisizione. Nota: Acquisizione di microscopio è possibile su microscopi fluorescenti e confocale con obiettivi di distanza lunga-lavoro perché lo spessore di costrutto è di circa 0,5 mm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare, ad eccezione del fatto che il dispositivo di stimolazione e il protocollo precedentemente sono stati brevettati (WO-2013185818-A1, WO-2017125159-A1).

Elettromeccanica stimolazione sembra essere un'alternativa sicura per preparare le celle per un ambiente ostile cardiaco e rafforzare il loro impegno cardiaco. Qui, un protocollo descritto per cellule progenitrici cardiache aumenta l'espressione di marcatori cardiaci principali ed era segnalato per essere utile per loro prossimo impianto il miocardio infartuato murino30. In generale, ATDPCs cardiaco elettromeccanico stimolato ha aumentato l'espressione di geni correlati a presto, strutturali e reg...

Funzione del cuore è basata sull'accoppiamento di eccitazione elettrica e meccanica contrazione. Brevemente, le giunzioni intercellulari del cardiomyocyte permettono di propagazione del segnale elettrico per produrre quasi sincrone contrazioni del cuore quel sangue pompa sistemica e attraverso il sistema polmonare. Le cellule cardiache, subiscono così sia elettriche che meccaniche forze che regolano la funzione cellulare e l'espressione del gene. Di conseguenza, molti gruppi hanno tentato di sviluppare piattaforme di cultura che simulano l'ambiente fisiologico cardiaco per comprendere il ruolo della stimolazione elettrica e meccanica sullo sviluppo cardiaco, la funzione e la maturazione. In vitro stimolazioni elettriche e meccaniche individualmente sono stati applicati estesamente in ingegneria del tessuto cardiaco per migliorare proprietà funzionali, aumentare la maturazione delle cellule o accoppiamento cellula-cellula e calcio manipolazione1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21. Tuttavia, sincrono condizionata elettromeccanico rimane inutilizzato a causa la sfida di sviluppare un protocollo e stimolatore e per l' obbligatorio ottimizzazione22.
Lavoro preliminare indirizzata stimolazione elettromeccanica come una combinazione di stimolazione elettrica e l'aspersione di media; Tuttavia, il flusso non comporta la deformazione basati su ceppo tipica del riempimento ventricolare23,24,25. Più tardi, più fisiologici approcci combinati stimoli elettrici con deformazione fisica o tratto di imitare le isovolumetrico contrazione26,27,28,29,30 ,31. Feng et al. descritto la prima dimostrazione di stimolazione elettromeccanica nel 2005, segnalazione migliorata dei cardiomiociti le proprietà size e contrattili26. Wang et al. pretrattato le cellule staminali mesenchimali con 5-azacitidina e applicato simultanea condizionata elettrica e meccanica, migliorare ricellularizzazione, vitalità cellulare, differenziamento cardiaco ed il tessuto che ritocca27. Poiché tali pubblicazioni, altri gruppi hanno segnalato sulla stimolazione elettromeccanica di monostrati di cellule umane o progettato tessuti (ad es., nero28, Vunjak-Novakovic29,31e il nostro gruppo30) con la prime condizionate cellule testate in vivo30. Brevemente, Morgan e nero testato diverse combinazioni di stimoli elettrici e meccanici, segnalare che la tempistica tra stimolazioni era cruciale perché in ritardo stimolazione combinata elettromeccanica ha prodotto i migliori risultati28. Successivamente, Godier-Furnémont e collaboratori ottimizzato un protocollo di stimolazione elettromeccanici per i costrutti di muscolo cardiaco ingegnerizzato da cellule del cuore neonatale del ratto e raggiunto, per la prima volta, un rapporto di forza-frequenza positiva29. In seguito, il nostro gruppo ha riferito che cellule elettromeccanico precondizionate ha aumentato l'espressione di marcatori cardiaci principale in vitro e generica benefica effetti in vivo, come ha migliorato la funzione cardiaca o aumentato la densità del vaso in infarto regione di confine30. La pubblicazione più recente ha dimostrato che i tessuti cardiaci da cardiomiociti derivati da cellule staminali sottoposti a elettromeccanico condizionata ha raggiunto una maturazione livello più vicino all'essere umano adulto cardiaca struttura e funzione31. Inoltre, piattaforme di stimolazione tridimensionale alternativi comprendono elettroattivi impalcature che forniscono elettrici, meccanici e topografiche segnali alle cellule allegato32. Inoltre, la deformazione meccanica (cellulare dello strato monomolecolare stretching e compressione) possa anche essere indotti con elettrodi estensibili che imita condizioni fisiologiche normali, come pure le condizioni estreme33.
Di conseguenza, la logica è che stimoli elettromeccanici in vitro basati su condizioni fisiologiche potrebbero migliorare il potenziale di cardiomiogenici di una cella. Infatti, questa stimolazione potrebbe beneficiare di ulteriori integrazioni di cellule terapeutiche nel miocardio in uno scenario clinico o aumentare la maturazione del tessuto per applicazioni di screening di stupefacenti.
Inoltre, abbiamo isolato e caratterizzato una popolazione di cellule progenitrici derivate dal tessuto adiposo umano di cardiaco di origine (ATDPCs cardiaca)34. Queste cellule si trovano nel grasso dell'epicardio. Queste cellule visualizzare effetti istopatologici e funzionali benefici nel trattamento di infarto miocardico e anche mantengono la differenziazione cardiaca ed endoteliale potenziali. 30 , 35. abbiamo supposto che questi benefici aumenterebbero dopo stimolazione biofisica.
Di conseguenza, abbiamo sviluppato un dispositivo e un regime di stimolazione per la popolazione delle cellule di interesse e studiato gli effetti. Questo protocollo elettromeccanico è una nuova strategia per indurre la cella attiva, che si estende in modo sterile e non invadente rispetto a precedenti pubblicazioni36, in combinazione con la stimolazione del campo elettrico. La tecnica segnalata qui spiega in dettaglio il dispositivo e il metodo utilizzato per la stimolazione elettrica, meccanica ed elettromeccanica delle cellule.
Questo dispositivo può fornire stimolazione sia elettrica che meccanica, singolarmente o contemporaneamente. La stimolazione viene eseguita con un metodo novello non invadente e asettico che include il supporto di cella presterilizzati, elettrodi posizionati all'interno di una piastra di coltura standard e una piattaforma che induce le forze meccaniche ed elettriche (Figura 1).
La piattaforma può contenere fino a sei cultura piastre ed è costituito da una struttura a sandwich del taglio laser poly(methyl methacrylate) e pezzi di bordo del circuito stampato. Il prototipo di piattaforma si basa su una combinazione di una monofasica programmabile computerizzato stimolatore elettrico, scheda a circuiti stampati per la potente connessione degli elettrodi e magneti al neodimio-fisso nichelato sei 10 x 10 mm x 5 mm disposti vicino a un lato delle piastre di coltura. C'è anche una barra di alluminio con sei magneti guida (stesso modello) posta di fronte l'altro lato delle piastre cultura e spostato con un servomotore lineare. Il motore è comandato da un controllore motore, operato attraverso una porta RS-232 da software commerciale (Vedi la Tabella materiali). Attraverso l'interfaccia utente e stimolatore programmabile, è possibile programmare l'intensità elettrica, la durata dell'impulso e frequenza, la frequenza di stimolazione meccanica, ciclo di dovere, il numero di impulsi, l'ampiezza di impulso (escursione magnete), e la pendenza.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58934/58934fig1.jpg"> Figura 1 : Stimolatore elettromeccanico. (A) PDMS costrutto utilizzato per il condizionamento delle cellule. (B) disegno del costrutto PDMS, compresi elettrodi e magneti. (C) particolare del bordo del circuito stampato (piattaforma) utilizzato per eseguire il condizionamento elettromeccanico. Questo pannello è stato modificato da Llucià-Valldeperas et al.30. (D) foto della stimolazione elettromeccanici piattaforma e l'interfaccia utente (computer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58934/58934fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Lo stimolatore sia il metodo per il condizionamento elettromeccanico sono descritti in due brevetti internazionali, WO-2013185818-A137 e WO-2017125159-A138.
Il silicone biocompatibile costrutti progettati per fornire un sostegno strutturale a cellule, elettrodi e magneti sono stati descritti precedentemente10,21. Brevemente, si tratta di polidimetilsilossano (PDMS), modellato e curato a temperatura ambiente, con un modulo di Young di 1,3 MPa, vicino ai livelli fisiologici. Il costrutto contiene un pool di cultura delle cellule in un'area flessibile (10 x 10 x 2 mm), due slot trasversale interna per tenere gli elettrodi e due incorporato 6 x 2 mm x 4 mm nichelato del neodimio. Gli elettrodi sono costruiti con 0.2 mm platino filo attorcigliato un 2 x 3 mm x 12 di politetrafluoroetilene (PTFE) di mm core (21 cm per elettrodo, circa 23 giri) e collocati ai lati opposti della zona flessibile per creare un campo elettrico per l'induzione stimolazione elettrica. Stiramento meccanico avviene attraverso l'attrazione magnetica tra magneti incorporati nel supporto e magneti esterni collocati accanto la piastra di coltura e sul movimento braccio in alluminio. In questo modo, il supporto di cella può essere esteso senza rompere la barriera sterile. Questo approccio è adatto per un monostrato di cellule ma potrebbe essere adattato ai costrutti tridimensionali, pure.
Inoltre, uno schema regolare potrebbe essere impresso dove le cellule sono seminate, utilizzando un reticolo di diffrazione governato (1.250 scanalature/mm). La visualizzazione diretta delle cellule coltivate sul costrutto di PDMS sotto campo chiaro e microscopi fluorescenti è possibile grazie alla sua trasparenza e 0,5 mm di spessore. Nel caso attuale, la piscina di cultura PDMS ha un modello di superficie verticale, perpendicolare alla forza di stiramento, per allineare le cellule perpendicolarmente al campo elettrico, che minimizza il gradiente di campo elettrico attraverso la cella.
La figura 1 Mostra una descrizione dettagliata del costrutto e del dispositivo utilizzato per la stimolazione. Costruire il PDMS e caratteristiche sono ottimizzate per la cella che si estende (Figura 1A, B). Lo stimolatore è sviluppato e validato per l'efficace applicazione della stimolazione elettrica e meccanica desiderata a cellule allegate al costrutto di PDMS. Questo processo include la garanzia buona operabilità connettività e utente tramite l'interfaccia software (Figura 1, D).
La procedura per la stimolazione di cellule utilizzando questo dispositivo su misura è descritta nella sezione protocollo.

<table><tbody><tr><td>Stimolator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magneti al neodimio nichelati</td><td>Supermagnete</td><td>Q-10-10-05-N</td><td></td></tr><tr><td>Magneti al neodimio nichelato</td><td>Supermagnete</td><td>Q-06-04-02-HN</td><td></td></tr><tr><td>polidimetilsilossano (PDMS) SYLGAR 184 Kit di elastomeri siliconici</td><td>Dow Corning Corp</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>reticolo di diffrazione a righe (1250 Newport</td><td></td> <td>05RG150-1250-2</td><td></td></tr><tr><td>Controllore motore</td><td>Faulhaber</td><td>MCLM-3006-S</td><td></td></tr><tr><td>Labview</td><td>National Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell culture</td><td></td><td></td><td></td></tr>soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Gibco</td><td>70013-065</td><td></td></tr><tr><td>0,05% tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>Piastra per coltura cellulare da 35 mm</td><td>BD Falcon</td><td>45353001</td><td></td></tr><tr><td>siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina 200 mM, 100x</td><td>Gibco</td><td>25030-024</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina/Streptomicina, 10.000 U/mL</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Minimo essenziale aquila media (alfa-MEM)</td><td>Sigma</td><td>M4526-24x500ML</td><td></td></tr><tr><td><forte>Proteine & Analisi dell'RNA</cocktail di</td> inibitori > <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>proteasi</td><td>forti Sigma</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Reagente per lisi QIAzol</td><td>Qiagen</td><td>79306</td><td></td></tr><tr><td>Kit per RNA/proteine AllPrep Kit</td><td>Qiagen</td><td>50980404</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Sonde universali iTaq Kit One-Step</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>172-5140</td><td></td></tr><tr><td>Esameri casuali</td><td>Qiagen</td><td>79236</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan PreAmp MasterMix 2x</td><td>Applied Biosystems</td><td>4391128</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Universal PCR MasterMix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4324018</td><td></td></tr><tr><td>Immunocoloring</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10% formalina</td><td>Sigma</td><td>HT-501128-4L</td><td></td></tr><tr><td>siero di cavallo</td><td>Sigma</td><td>H1138</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Siero Bovino Albumina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>PARAFILM</td><td>Sigma</td><td>P6543</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Falloidina Alexa 568</td><td>Invitrogen</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>sodio azide</td><td>Sigma</td><td>S8032-100g</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma</td><td>14533</td><td></td></tr><tr><td>Connexin-43 coniglio anticorpo primario</td><td>Sigma</td><td>C6219 lotto#061M4823</td><td></td></tr><tr><td>sarcomerico &alfa;-actinina topo anticorpo primario</td><td>Sigma</td><td>A7811 lotto#080M4864</td><td></td></tr><tr><td>GATA-4 capra anticorpo primario</td><td>R& D</td><td>AF2606 VAZ0515101</td><td></td></tr><tr><td>MEF2 anticorpo primario di coniglio</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-313 lotto#E0611</td><td></td></tr><tr><td>SERCA2 anticorpo primario di capra</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8095 lotto#D2709</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 anticorpo secondario</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 anticorpo secondario</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-165-151</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 secondario anticorpo</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>712-165-150</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario Cy2</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-225-150</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario Cy2</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-225-152</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario Cy2</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-225-147</td><td></td></tr></tbody></table>

simultanea stimolazione elettrica e meccanica per migliorare il potenziale di cardiomiogenici delle cellule

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Le malattie cardiovascolari sono la principale causa di morte nei paesi sviluppati. Di conseguenza, la domanda di terapie efficaci cellula cardiaca ha motivato i ricercatori nei campi di Bioingegneria e cellule staminali a sviluppare in vitro ad alta fedeltà miocardio umano per la ricerca di base e applicazioni cliniche. Tuttavia, il fenotipo immaturo delle cellule cardiache è una limitazione sull'ottenere tessuti che imitano funzionalmente il miocardio adulto, che è principalmente caratterizzato da segnali meccanici ed elettrici. Così, lo scopo del presente protocollo è di preparare e maturare la popolazione delle cellule di destinazione attraverso la stimolazione elettromeccanica, ricapitolare i parametri fisiologici. Ingegneria del tessuto cardiaco si sta evolvendo verso approcci più biologici e strategie basate sugli stimoli biofisici, così, stanno guadagnando slancio. Il dispositivo sviluppato per questo scopo è unico e permette individuo o simultanea stimolazione elettrica e meccanica, accuratamente caratterizzata e convalidato. Inoltre, anche se la metodologia è stata ottimizzata per questo stimolatore e una popolazione di cellule specifiche, può facilmente essere adattato ad altri dispositivi e linee cellulari. Qui i risultati offrono la prova dell'impegno cardiaco aumentato della popolazione cellulare dopo stimolazione elettromeccanica. Elettromeccanico stimolato le cellule mostrano un incremento dell'espressione dei principali marcatori cardiaci, compreso i geni precoce, strutturali e diregolamento. Questo condizionamento cella potrebbe essere utile per ulteriormente la terapia rigenerativa cellulare, la modellazione di malattia e screening di farmaci di alto-rendimento.

Figura 2 rappresenta lo schema generale seguito per la stimolazione delle cellule. Brevemente, cellule sono state seminate sul costrutto PDMS e sottoposti a stimolazione elettromeccanica, con una media modifica eseguita due volte a settimana. Cellule nonstimulated sono state usate come controllo per il condizionamento elettromeccanico. Inoltre, abbiamo aggiunto un controllo supplementare per l'esperimento e sottocutaneo ATDPCs sono stati utilizzati come contr...

Qui presentiamo un protocollo per la formazione di una popolazione delle cellule usando stimoli elettrici e meccanici, emulando la fisiologia cardiaca. Questa stimolazione elettromeccanica migliora il potenziale di cardiomiogenici delle cellule trattate ed è una strategia promettente per ulteriore terapia cellulare, la modellazione di malattia e lo screening di stupefacenti.

Simultanea stimolazione elettrica e meccanica per migliorare il potenziale di cardiomiogenici delle cellule

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Questo è un metodo per applicare la stimolazione elettromeccanica sulle cellule. Ha molteplici applicazioni per studiare i suoi effetti su una popolazione cellulare, pre-allenamento per la consegna in vivo e maturazione cellulare. Il vantaggio è che gli stimoli elettrici e meccanici possono essere applicati con lo stesso dispositivo singolarmente o simultaneamente mantenendo intatto il virale sterile.Questa tecnica è un approccio indiretto alla nostra terapia. La terapia cellulare è considerata cellule stimolate elettromeccanicamente può essere un'interessante popolazione cellulare per trattare l'intro-miocardio. Questo metodo appartiene generalmente al campo cardiovascolare, ma potrebbe anche essere applicato al sistema nervoso.Questa è una tecnica facile che richiede pazienza. La parte più difficile sarà lavorare con i piccoli pezzi e mantenere la sterilità per tutto il tempo. Ci sono pochi dettagli di manipolazione che sono difficili da spiegare, quindi la dimostrazione visiva è davvero utile.Inizia trasferendo 12 costrutti PDMS puliti su piastre sterili da 10 centimetri. Per assicurare la completa sterilizzazione, esporre le piastre alla luce UV per cinque minuti. Quindi trasferire ogni costrutto su una piastra di coltura cellulare separata di 35 millimetri o piastre a 6 po 'per la semina immediata delle cellule.Per iniziare la semina cellulare, lavare prima un pallone T75 confluente di ATDPC cardiaci con cinque millilitri di 1x PBS. Per scollegare le celle, aggiungere un millilitro dello 0,05% di tripside-EDTA. E incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti.Quindi, aggiungere cinque millilitri di mezzo completo per inattivare la tripina-EDTA. Raccogliere tutte le celle staccate in un tubo da 15 millilitri. Lavare il vetro cellulare due volte con cinque millilitri di PBS per raccogliere eventuali celle rimanenti e aggiungerle al tubo da 15 millilitri.Centrifuga a 230 g per cinque minuti a 22 gradi Celsius. Rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo le cellule in due millilitri di mezzo completo e contarle con l'emocitometro. Seme 200 microlitri di ATDPC cardiaci in ogni piastra con i costrutti PDMS per ottenere circa l'80% della superficie di semina coperta da cellule il giorno seguente.Incubare a 37 gradi Celsius e 5%CO2. Aggiungere delicatamente 2 millilitri di mezzo completo preri riscaldato per piastra. Incubare le cellule con i costrutti a 37 gradi Celsius e 5%CO2 durante la notte.Prima di iniziare questa procedura, assegnare sei costrutti su 12 per la stimolazione elettromeccanica e conservarne sei per i controlli non stimolati. Utilizzare il 70% di etanolo per pulire l'unità di stimolazione. Posizionare l'unità di stimolazione, gli elettrodi sterili e le pinzette all'interno dell'armadio di flusso.Per manipolare facilmente gli elettrodi e i costrutti, rimuovere il 90% del mezzo da ogni piastra di coltura cellulare. Posizionare i costrutti PDMS nella posizione giusta verso il magnete per assicurare l'attrazione magnetica tra magneti fissi e mobili. Questi due passaggi precedenti in cui manipoli i costrutti PDMS seminati della cellula e gli elettrodi mantenendo la sterilità durante tutto il processo sono i più critici.Quindi, collegare il filo di platino ai connettori dell'elettrodo. Orientate la parte PTFE degli elettrodi nei loro spazi designati nei costrutti PDMS. Aggiungere 2,5 millilitri di mezzo completo fresco preri warmed per ogni costrutto.Una volta posizionati e collegati elettricamente alla piattaforma tutti i costrutti PDMS, riposizionare la piattaforma nell'incubatore di 37 gradi Celsius e 5%CO2. Quindi collegare la sorgente elettrica e meccanica. Per configurare il programma di stimolazione, specificare i regimi di stimolazione elettrica e meccanica attraverso le interfacce utente dello stimolatore elettrico e l'applicazione, che controlla la stimolazione meccanica.Per impostare il sincronismo, accendere lo stimolatore elettrico e attendere che il menu principale venga visualizzato sul display. Quindi selezionare l'opzione due, modificare la sequenza e quindi INVIO. Per modificare il menu di sequenza, utilizzare la scheda modalità per selezionare corrente"facendo clic su più" e premendo INVIO"Per il periodo, selezionare 1000"con più/meno e premere INVIO"E per la scheda modalità trigger, selezionare esterno per software e premere INVIO"Per la scheda ampiezza, selezionare 1"con più/meno e premere INVIO"Quindi, di nuovo nel menu principale, selezionare l'opzione 4, quindi generare sequenza, quindi premere INVIO"Nella sezione di stimolazione meccanica del pannello applicazione di controllo, prima scrivere 1000" nel controllo del testo del periodo più.Quindi scrivi 500" nel controllo del testo on time, per impostare la durata meccanica dell'impulso. Infine, scrivi 2000" nel controllo del testo dell'escursione per fornire un allungamento del 10% del costrutto. Cambiare il supporto cellulare due volte a settimana, rimuovendo prima i vecchi supporti e quindi aggiungendo supporti caldi e freschi sui lati del supporto PDMS.Il settimo giorno, alla fine dell'esperimento, raccogliere i campioni come descritto nel manoscritto. Gli ATDPC cardiaci stimolati elettromeccanicamente hanno migliorato il loro potenziale cardiomiogenico. Questo è stato indicato dalla PCR in tempo reale che mostra una maggiore espressione dei geni cardiaci precoci e tardivi in particolare il fattore di trascrizione cardiaca GATA-4, la catena pesante della beta-miosina del marcatore strutturale e il gene correlato al calcio Connexin43.La colorazione della phalloidina contro le fibre di actina ha mostrato che la maggior parte delle cellule allineate secondo il modello verticale. La distribuzione di Connexin43 era principalmente nel citoplasma e nella membrana plasmatica, contribuendo alla comunicazione intracellulare attraverso le giunzioni gap. I fattori di trascrizione MEF2 e GATA-4 sono stati localizzati nei nuclei negli ATDPC cardiaci.Ma GATA-4 non è stato rilevato negli ATDPC sottocutanei. I marcatori citoplasmatici SERCA2, e l'alfa-actina sarcomerica, non mostravano un'organizzazione sarcomerica matura tipica dei cardiomiociti. E il pestaggio non è stato osservato nel controllo e ha stimolato le popolazioni cellulari.Un monostrato cellulare sano all'inizio di questo protocollo e mantenere la sterilità durante tutta la procedura sono cruciali. Dopo la raccolta del campione, è possibile eseguire le tecniche standard di espressione delle proteine del genoma. Questa tecnica aiuta a comprendere meglio l'effetto degli stimoli elettrici e/o meccanici cellulari.Fino a poco tempo fa, era impossibile utilizzare lo stesso dispositivo per entrambe le stimolazioni, il che rendeva i risultati più difficili da confrontare.

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Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione della cardioblasts pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di risorse umane progenitori cardiaci e funzionale cardiomiociti per la riparazione cardiovascolare.

Derivazione efficiente dei diritti dell&#39;uomo e precursori cardiaci e cardiomiociti pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

Consegna cellula intramiocardico in modelli murini di malattie cardiovascolari, come ipertensione o infarto del miocardio, è ampiamente utilizzato per testare il potenziale terapeutico di diversi tipi di cellule in studi rigenerativi. Pertanto, una descrizione dettagliata e una chiara visualizzazione di questa procedura chirurgica contribuiranno a definire i limiti ei vantaggi di cellule cardiovascolari analisi terapeutici in piccoli roditori.

Intramiocardico cellulare di consegna: Osservazioni in murini Hearts

Questo manoscritto descrive la creazione di tessuti cardiaci ingegnerizzati definiti utilizzando l'espressione di marcatori di superficie e la selezione cellulare. I tessuti definiti possono quindi essere utilizzati in un bioreattore multi-tessuto per studiare i meccanismi della terapia cellulare cardiaca al fine di fornire un sistema modello funzionale, ma controllato, del cuore umano.

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Presentiamo tre protocolli nuovi e più efficienti per la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane in cardiomiociti, cellule endoteliali e cellule muscolari lisce e un metodo di consegna che migliora l'attecchimento delle cellule trapiantate, combinando l'iniezione di cellule con la consegna citochine patch-mediata.

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La piattaforma BIOWIRE cardiaco è un metodo in vitro utilizzato per maturare embrionale umano e cardiomiociti derivati dalle cellule staminali pluripotenti indotte (HPSC-CM) combinando coltura cellulare tridimensionale con stimolazione elettrica. Questo manoscritto presenta la configurazione dettagliata della piattaforma BIOWIRE cardiaco.

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Qui descriviamo la preparazione di fette ventricolari vitali da topi adulti e il loro utilizzo per registrazioni potenziali di azione elettrodo. Queste preparazioni multicellulari forniscono una struttura tissutale conservata in vivo , che li rende un prezioso modello per studi elettrofisiologici e farmacologici in vitro .

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Qui presentiamo un metodo affidabile per riprogrammare i fibroblasti embrionali primari in cardiomiociti funzionali tramite sovraespressione di GATA4, Hand2, Mef2c, Tbx5, miR-1 e miR-133 (GHMT2m) al fianco di inibizione di segnalazione di TGF-β. Il nostro protocollo genera pestaggio cardiomyocytes fin dal post-traduzionali di 7 giorni con fino a 60% efficienza.

Soppressione della segnalazione Pro-fibrotici rafforza fattore-mediata riprogrammazione di fibroblasti embrionali di topo in cardiomiociti indotti

In questo protocollo, dimostriamo ed elaboriamo su come utilizzare cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo per la differenziazione e la purificazione cardiomiocitati, e ulteriormente, su come migliorare la sua efficienza di trapianto con inibitore della chinasi proteica associata a Rho pretrattamento in un modello di infarzione miocardico del topo.

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