Name: Rilevazione di attività di proteasi dallo Zymography Peptide fluorescente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-01-20T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 56 s
Description: Scopri la zimografia con peptidi fluorescenti per rilevare proteasi in campioni biologici con maggiore sensibilità rispetto ai metodi tradizionali. Questa tecnica modulare supporta la ricerca su biomateriali e ingegneria tissutale.

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Finanziamento fornito da The Ohio State University College of Engineering, dipartimento di ingegneria biomedica e il Comprehensive Cancer Center - Arthur G. James Cancer Hospital e Richard J. Solove Research Institute.

1. preparazione di strato di Gel di risoluzione
<ol><li>Preparare un poliacrilammide 10% Risoluzione soluzione di gel come da tabella 1. Aggiungere il tetrametiletilendiammina (TEMED) e l'ammonio persolfato (APS) immediatamente prima di versare il gel come loro aggiunta avvia la reazione di polimerizzazione.</li>
	<li>Riempire un vassoio del mini-gel vuoto 1,5 mm a metà strada (5 mL) con la soluzione di gel di risoluzione 10%.</li>
	<li>Aggiungere uno strato sottile di isopropanolo (~ 500 µ l) nella parte superiore del gel di poliacrilammide per produrre un livello gel e prevenire bolle. Utilizzare la soluzione di poliacrilammide avanzi per tenere traccia dell'avanzamento della reazione di polimerizzazione. Quando il poliacrilammide nel tubo è completamente solidificato, la reazione è completa (~ 40 min).</li>
</ol>2. preparazione della molecola del Linker Azido-PEG3-maleimide
<ol><li>Mentre il primo strato di gel di risoluzione è polimerizzando, recuperare il kit azido-PEG3-maleimide dallo stoccaggio-20 ° C e lasciare i componenti a temperatura ambiente. Ci sono due componenti in ogni kit. 1 flaconcino contiene un estere di maleimide-NHS, un bianco sporco al grigio solido. Flacone 2 contiene azido-PEG3-ammina, un olio leggermente giallo. Nota: Gli autori suggeriscono utilizzando il kit di azido-PEG3-maleimide 25 mg come può essere conservato solo per brevi periodi di tempo (1-2 ore) a-20 ° C dopo essere preparati prima che inizia a degradare. 25 mg è sufficiente a produrre 10 peptide gel. Utilizzare gel entro 3 settimane di preparazione.</li>
	<li>Sciogliere i componenti del flaconcino 2 nel produttore consigliato volume di solfossido dimetilico (DMSO) e vortex per 30 s per garantire i liquidi sono stati mescolati bene.</li>
	<li>Trasferire il contenuto di 1 fiala in un pallone asciutto 100 mL contenente un'ancoretta. Nota: Risciacquare il matraccio con acetone e asciugare completamente prima dell'uso per evitare che l'umidità da interferire con la reazione.</li>
	<li>Immediatamente inserire un tappo di setto di gomma con un diaframma che può essere perforato con una siringa nella bocca del pallone. Lavorare rapidamente per impedire all'umidità di entrare il pallone.</li>
	<li>Inserisci due 18 gauge siringa aghi nel diaframma e collegare uno ad un serbatoio di gas inerte (ad es. gas argon). Lasciare il gas inerte per riempire il pallone per 3 min Mix i componenti di fiale 1 e 2 sotto gas inerte per evitare che i prodotti di reazione indesiderabile. Attenzione: Il secondo ago di siringa è quello di fornire uno sfogo, consentendo in tal modo l'aria atmosferica contenuta all'interno della muffola a fluire fuori il pallone come si riempie con gas inerte. Non dimenticate di includere un ago di sfiato!</li>
	<li>Chiudere il gas inerte e staccarlo dall'ago. Utilizzando una siringa, iniettare l'intero contenuto del flaconcino 2 nel pallone.</li>
	<li>Rimuovere la siringa e aghi e consentire ai componenti di mescolare per 30 min a temperatura ambiente mescolando.</li>
	<li>Rimuovere il tappo di gomma del setto e trasferire il contenuto in una provetta da centrifuga pulita 5 mL. La soluzione di azido-PEG3-maleimide deve essere utilizzata entro 1 ora a temperatura ambiente.</li>
</ol>3. preparazione del Peptide risoluzione strato di Gel
<ol><li>Una volta che il primo strato di gel di risoluzione ha polimerizzato, versare lo strato di isopropanolo. Sciacquare la parte superiore del gel di pipettaggio 1 mL di acqua deionizzata sulla parte superiore del gel e quindi versare l'acqua.</li>
	<li>Recuperare il peptide fluorescente del tiolo-funzionalizzati da-80 ° C stoccaggio e lasciarlo scongelare a temperatura ambiente. Nota: Il peptide del tiolo-funzionalizzate possa essere preparato come descritto in precedenza11,12. Commercialmente disponibile peptidi possono anche essere usati ma richiedono l'aggiunta di un residuo di cisteina terminale per abilitare il maleimide-tiolo clicca reazione. Sciogliere il peptide ad una concentrazione stock di 10 mM e conservare a-80 ° C in piccole aliquote (30 uL) per limitare i cicli ripetuti di congelamento-scongelamento.</li>
	<li>Preparare un 10% risoluzione dei gel di soluzione contenente la molecola azido-PEG3-maleimide del linker e il peptide fluorescente come da tabella 1. Aggiungere il TEMED e APS immediatamente prima di versare il gel come loro aggiunta avvia la reazione di polimerizzazione.</li>
	<li>Riempire a metà della parte restante del vassoio del gel (3 mL) con il peptide soluzione gel di risoluzione. Nota: Un approccio di gel di risoluzione multistrato riduce la quantità di peptide e del linker necessario per ogni gel. La dimensione dello strato di gel di risoluzione del peptide può essere regolata per soddisfare un'ampia gamma di pesi molecolari come necessario.</li>
	<li>Pipettare un sottile strato di isopropanolo (~ 500 µ l) alla parte superiore del gel di poliacrilammide per produrre un livello gel e prevenire bolle. Utilizzare la soluzione di poliacrilammide avanzi per tenere traccia dell'avanzamento della reazione di polimerizzazione. Quando il poliacrilammide nel tubo è completamente solidificato, la reazione è completa (~ 40 min). Nota: Il peptide fluorescente è sensibile alla luce. Mantenere i gel coperti con carta stagnola per evitare che photobleaching durante lo sviluppo, l'elettroforesi, lavaggio e preparazione del gel.</li>
	<li>Versare lo strato di isopropanolo e sciacquare la parte superiore del peptide risoluzione dei gel con acqua deionizzata come descritto al punto 3.1.</li>
	<li>Se si utilizza il gel immediatamente, procedere al passaggio 4, in caso contrario, immergere i gel preparati in 100 mL di tampone fosfato salino (PBS) a 4 ° C in una scatola di plastica per evitare che il gel secchi: 1x. Avvolgere la scatola in carta stagnola per evitare che photobleaching. Gel possono essere memorizzati in PBS per fino a 3 settimane prima dell'uso.</li>
</ol>4. preparazione del Gel d'impilamento
<ol><li>Preparare una soluzione di gel d'impilamento 5% secondo la tabella 1. Aggiungere il TEMED e APS immediatamente prima di versare il gel come loro aggiunta avvia la reazione di polimerizzazione.</li>
	<li>Riempire la parte vuota rimanente del vassoio del gel (~ 2 mL) con la soluzione di gel di impilamento.</li>
	<li>Inserire rapidamente un pettine di gel di 1,5 mm in strato di gel d'impilamento, assicurandosi che non ci sono bolle rimangono intrappolate sotto i pozzi. Utilizzare la soluzione di poliacrilammide avanzi per tenere traccia dell'avanzamento della reazione di polimerizzazione. Quando il poliacrilammide nel tubo è completamente solidificato, la reazione è completa (~ 10 min).</li>
	<li>Rimuovere delicatamente il pettine e il nastro dal retro del vassoio del gel.</li>
</ol>5. preparazione dei campioni biologici per elettroforesi
<ol><li>Preparare la media condizionato delle cellule, lisati cellulari, omogenati e MMP standard come descritto altrove sotto non riducenti condizioni2. Non riscaldare i campioni.</li>
	<li>Ad esempio, preparare media condizionato delle cellule come segue:<ol>
<li>Cellule a piastra 40.000 cellule/cm2 in una piastra a 6 pozzetti in terreni di coltura di 10% siero bovino fetale (FBS). Incubare le cellule in una camera umidificata (5% CO2 a 37 ° C) per 24 ore e consentire loro di raggiungere la confluenza di 70-80%. Nota: Se le cellule non hanno raggiunto la confluenza desiderato dopo 24 ore, consentire loro di crescere in terreni di coltura di 10% FBS per altre 24 ore.</li>
		<li>Lavare le cellule due volte con PBS e aggiungere 2 mL di terreno di coltura privo di siero. Incubare le cellule in una camera umidificata (5% CO2 a 37 ° C) per altre 24 ore.</li>
		<li>Utilizzando una pipetta sierologica, raccogliere i media condizionati da ciascun pozzetto. Centrifugare i media a 1200 rpm per 3 minuti per rimuovere eventuali detriti cellulari. Prendere il surnatante e concentrarsi utilizzando un 15 mL, filtro centrifugo cutoff peso molecolare 10 kDa. Centrifugare le unità filtro a 4.000 x g per 15 min in un rotore oscillante o 5.000 x g per 15 min in un rotore ad angolo fisso. Nota: Questo passaggio è facoltativo, ma può migliorare l'intensità delle bande proteolitici nei gel di zymography del peptide.</li>
		<li>Trasferire il filtrato concentrato in una provetta da centrifuga fresca 1,5 mL. Aliquotare e conservare i campioni a-80 ° C per fino a tre cicli di gelo-disgelo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantificare il contenuto di proteine usando un'analisi di quantificazione della proteina standard (ad es. BCA, analisi di Bradford, ecc.).</li>
</ol>6. elettroforesi del biologico campioni in Peptide Zymography gel
<ol><li>Sciogliere i campioni nel buffer del campione convenzionale zymography (62,5 mM Tris-HCl, pH 6.8, 25% glicerolo, 4% SDS, 0,01% bromofenolo). Per i campioni di cellule e tessuti, ~ 30 µ g di proteina totale per pozzetto è raccomandato e 50-100 ng di proteina per gli standard di MMP.</li>
	<li>Aggiungere 400 mL di 1 x Tris-glicina SDS Running Buffer all'apparato di gel. Caricare fino a 35 µ l di campione per pozzetto. Eseguire gli esempi a 120 V a 4 ° C per 1,5 ore o fino a quando gli standard di peso molecolare indicano che le proteasi di interesse sono all'interno del peptide risoluzione strato di gel (che ha un colore arancio visibile). Nota: La maggior parte delle MMPs e loro varianti cadono all'interno della gamma di 35-100 kDa. Quando gli standard di peso molecolare indicano che quei pesi sono all'interno del peptide risoluzione strato di gel, elettroforesi può essere fermato. Lo stesso principio può essere applicato ad altre classi di proteasi con pesi molecolari noti. Se c'è un interesse nella rilevazione della proteasi più sopra una più vasta gamma di pesi molecolari, ridurre le dimensioni della risoluzione strato di gel e aumentare le dimensioni dello strato di gel di risoluzione del peptide.</li>
	<li>A seguito di elettroforesi, rimuovere il gel dalla cassetta plastica e lavare gel tre volte per 10 minuti ciascuno, a temperatura ambiente sotto agitazione delicata in tampone di rinaturazione con 2,5% Triton X-100, 1 µM ZnCl2e 5 mM CaCl2 a 50 mM Tris-HCl, pH 7.5.</li>
	<li>Trasferimento gel per una sviluppo soluzione tampone contenente 1% Triton X-100, 1 µM ZnCl2 e 5 mM CaCl2 a 50 mM Tris-HCl, pH 7.5 per 15 min. Sostituisci con sviluppo fresco soluzione tampone e incubare gel a 37 ° C sotto agitazione delicata per 24 ore , assicurandosi che i gel sono completamente immerso nella soluzione.</li>
</ol>7. formazione immagine del Peptide Zymography gel
<ol><li>Dopo 24 ore, gel di immagine utilizzando un fluorescente gel scanner/imager utilizzando i filtri di eccitazione e di emissione appropriati. Ad esempio, i gel di peptide indicati nei risultati rappresentativi sono coniugati con fluoresceina ed erano imaged utilizzando un filtro di eccitazione di 488 nm e un filtro di emissione di 521 nm. Utilizzando i filtri appropriati per il fluoroforo ci permetterà di ottimizzare il rilevamento di attività proteolitica. Nota: Immagini possono anche essere preso con un imager di gel con un transilluminatore UV, spesso utilizzato per l'imaging del DNA gel colorato con bromuro di etidio. Immagine del gel utilizzando il transilluminatore UV (365 nm) impostazione e un filtro di emissione di 590 nm.</li>
	<li>Condurre la valutazione densitometrica delle intensità di banda usando ImageJ come descritto altrove13.</li>
</ol>

<ol><li>Vandooren, J., Geurts, N., Martens, E., Vanden Steen, P. E., Opdenakker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zymography+methods+for+visualizing+hydrolytic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Zymography methods for visualizing hydrolytic enzymes.</a> Nature Methods. 10 (3), 211-220 (2013).</li>
<li>Toth, M., Fridman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+Gelatinases+%28MMP-2+and+MMP-9%29+by+Gelatin+Zymography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Assessment of Gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by Gelatin Zymography.</a> Methods in Molecular Medicine. 57, (2001).</li>
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<li>Nagase, H., Fields, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+matrix+metalloproteinase+specificity+studies+using+collagen+sequence-based+synthetic+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Human matrix metalloproteinase specificity studies using collagen sequence-based synthetic peptide.</a> Biopolymers. 40 (4), 399-416 (1996).</li>
<li>Mucha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+Type-1+Matrix+Metalloprotease+and+Stromelysin-3+Cleave+More+Efficiently+Synthetic+Substrates+Containing+Unusual+Amino+Acids+in+Their+P1%E2%80%B2+Positions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Membrane Type-1 Matrix Metalloprotease and Stromelysin-3 Cleave More Efficiently Synthetic Substrates Containing Unusual Amino Acids in Their P1′ Positions.</a> Journal of Biological Chemistry. 273 (5), 2763-2768 (1998).</li>
<li>Thimon, V., Belghazi, M., Labas, V., Dacheux, J. -L., Gatti, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-+and+two-dimensional+SDS-PAGE+zymography+with+quenched+fluorogenic+substrates+provides+identification+of+biological+fluid+proteases+by+direct+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">One- and two-dimensional SDS-PAGE zymography with quenched fluorogenic substrates provides identification of biological fluid proteases by direct mass spectrometry.</a> Analytical Biochemistry. 375 (2), 382-384 (2008).</li>
<li>Sun, X., Salih, E., Oppenheim, F. G., Helmerhorst, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-based+mass+spectrometric+characterization+of+proteases+and+inhibitors+in+human+saliva%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics.+Clinical+Applications%22%5BJournal%5D)">Activity-based mass spectrometric characterization of proteases and inhibitors in human saliva.</a> Proteomics. Clinical Applications. 3 (7), 810-820 (2009).</li>
<li>Yu, W., Woessner, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin-Enhanced+Zymographic+Detection+of+Matrilysin+and+Collagenases%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Heparin-Enhanced Zymographic Detection of Matrilysin and Collagenases.</a> Analytical Biochemistry. 293 (1), 38-42 (2001).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Le attuali tecniche di zymographic si affidano l'incorporazione di substrati nativi in gel di poliacrilammide per la rilevazione di proteolisi. Mentre queste tecniche hanno raccolto l'uso molto diffuso, sono ancora limitati nel numero di proteasi che sono in grado di rilevare. Qui, un protocollo è stato descritto in quali peptidi fluorescenti, proteasi-degradabile sono incorporate la risoluzione di gel di poliacrilammide. Covalente accoppiamento usando una molecola del linker azido-PEG3-maleimide consente la separazione ...

Zymography gel è una tecnica biologica utilizzata per misurare l'attività proteolitica all'interno di campioni biologici, quali fluidi corporei o delle cellule di coltura1,2,3. I campioni sono separati dai loro pesi molecolari con l'elettroforesi attraverso un gel di poliacrilammide incorporato con un substrato degradabile. I substrati degradabili comuni includono gelatina, caseina, collagene ed elastina, che sono stati utilizzati per misurare l'attività delle metalloproteinasi di matrice (MMP) -1, -2, -3, -7, -8, -9 e -11, oltre ad una varietà di catepsine1,2 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8. dopo elettroforesi, gli enzimi sono rinaturalizzato e permesso di degradare le proteine all'interno del gel. In zymography tradizionale gel, il gel è colorato con un colorante di proteine, come blu di Coomassie, e l'attività della proteasi è rilevato come una perdita di segnale, cioè, bianco bande (degradazione della proteina) su uno sfondo blu scuro.
Qui, descriviamo un protocollo per un metodo alternativo di gel zymography, in cui il substrato degradabile è un breve, peptide fluorogenico covalentemente incorporato in gel di poliacrilammide (Figura 1). La sostituzione di peptidi sintetici come i substrati degradabile consente il rilevamento di una gamma più ampia di proteasi rispetto al tradizionale gel zymography con proteine native9. Covalente del peptide fluorogenico impedisce la diffusione del peptide e la migrazione durante l'elettroforesi del gel, osservato con precedenti metodi9,10. Inoltre, l'uso di un substrato fluorogenico consente rilevazione diretta delle attività della proteasi senza ulteriori macchiatura e passi de-colorazione. L'obiettivo generale di questo metodo è la rilevazione di attività di proteasi in campioni biologici tramite l'incorporazione covalente di peptidi fluorogenici in gel di zymogram.

<table><tbody><tr><td>Cassette di gel vuote da 1,5 mm</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC2015</td><td></td></tr><tr><td>Pettini per cassette di gel vuote da 1,5 mm, 10 pozzetti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>NC3510</td><td></td></tr><tr><td>1x soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-010-049</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione SDS al 20%</td><td>Ambion</td><td>AM9820</td><td></td></tr><tr><td>3x tampone per campioni per zimografia</td><td>Bio-Rad</td><td>1610764</td><td></td></tr><tr><td>40% (p/v) Acrilammide/Bis (19:1)</td><td>Ambion</td><td>AM9022</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture tissutali a 6 pozzetti</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>087721B</td><td></td></tr><tr><td>Unità di filtro centrifugo Amicon Ultra-2 (10 kDa MWCO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>UFC201024</td><td></td></tr><tr><td>Ammounium Persulfate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Azido-PEG3-Maleimmide Kit</td><td>Clicca sulla chimica Strumenti</td><td>AZ107</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di calcio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP510100</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil solfossido</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416P</td><td></td></tr><tr><td>Kit di analisi delle proteine Micro BCA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>23235</td><td></td></tr><tr><td>N N N' N' -Tetrametiletilendiammina (TEMED)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac Alimentatore di base</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>Aghi ipodermici PrecisionGlide</td> Fisher <td>Scientific</td><td>14-826</td><td></td></tr><tr><td>Pallone a fondo tondo (100 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-873-144</td><td></td></tr><tr><td>Tappo in gomma del setto</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-872-546</td><td></td></tr><tr><td>Siringa sterile con punta scorrevole (1 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-434</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Trizma hydrochlroide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9410 Molecular Imager</td><td>GE Amersham</td><td>8149-30-9410</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di zinco</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td>208086</tr></tbody></table>

rilevazione di attività di proteasi dallo zymography peptide fluorescente

Detection of Protease Activity by Fluorescent Peptide Zymography

Lo scopo di questo metodo è quello di misurare l'attività proteolitica dei campioni biologici complessi. I campioni sono separati dal peso molecolare tramite l'elettroforesi attraverso un gel di risoluzione incorporato con un substrato degradabile. Questo metodo si differenzia dal tradizionale gel zymography in quanto un peptide fluorogenico estiguuto covalentemente incorporò il gel di risoluzione invece di proteine integrale, come gelatina o caseina. Uso dei peptidi fluorogenici consente il rilevamento diretto di attività proteolitica senza ulteriori passaggi di colorazione. Gli enzimi all'interno i campioni biologici fendono il peptide fluorogenico estiguuto, conseguente a un aumento di fluorescenza. Il segnale fluorescente nel gel è allora imaged con uno scanner standard del gel fluorescente e quantificati tramite densitometria. L'uso di peptidi come il substrato degradabile espande notevolmente le possibili proteasi rilevabile con le tecniche di zymographic.

Utilizzando il metodo descritto qui, due peptidi di proteasi-degradabile fluorescenti sono state incorporate in gel di poliacrilammide: GGPQG↓IWGQK(PEG)2C (abbreviato come QGIW in tutto il testo e le figure) e GPLA↓CpMeOBzlWARK(PEG)2 C (abbreviato come LACW in tutto il testo e le figure). ↓ indica il sito di clivaggio. QGIW è un collagene-I derivati sequenza progettato per rilevare le collagenasi cellulare14. LACW è una sequenza che...

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per una tecnica di zymographic modificate in cui peptidi fluorescenti vengono utilizzati come substrato degradabile al posto di proteine native. L'elettroforesi dei campioni biologici in zymograms peptide fluorescente consente il rilevamento di una vasta gamma delle proteasi che tecniche zymographic precedenti.

Rilevazione di attività di proteasi dallo Zymography Peptide fluorescente

The purpose of this method is to measure the proteolytic activity of complex biological samples. The samples are separated by molecular weight using ...

Le attuali tecniche zigografiche rilevano un numero limitato di proteasi. La zimografia peptidica fluorescente utilizza peptidi fluorescenti come substrato degradabile consentendo la misurazione di una maggiore gamma di proteasi. Il vantaggio principale di questo metodo è il suo design modulare.La sequenza del peptide fluorescente determina quali proteasi vengono rilevate e il peptide fluorescente può essere facilmente scambiato con un peptide di una sequenza diversa, una capacità di rilevare altre proteasi. Questa tecnica può aiutare a informare la progettazione dell'uso dei peptidi come cross-linker degradabili in biomateriali ingegnerizzati come quelli utilizzati per la somministrazione di farmaci o applicazioni di ingegneria tissutale. L'incorporazione di questo peptide in questa tecnica può identificare le proteasi secrete dai tessuti che sono responsabili della degradazione dei biomateriali.La dimostrazione di questa tecnica è importante per visualizzare l'approccio multistrato unico rispetto ad altre tecniche di zimografia. A dimostrare questa tecnica sarà, Ameya Deshmukh, una studentessa laureata del mio laboratorio. Per iniziare, preparare una soluzione di gel risolutivo al 10% di poliacrilammide come descritto nella tabella uno del protocollo di testo.Immediatamente prima di versare il gel, aggiungere il TEMED e l'APS. Quindi, riempire e svuotare la mini cassetta gel da 1,5 millimetri a metà strada con la soluzione di gel risolutivo. Aggiungere un sottile strato di isopropanolo nella parte superiore del gel di poliacrilammide per produrre un gel di livello e prevenire le bolle.Utilizzare la soluzione di poliacrilammide rimasta per tenere traccia dell'avanzamento della reazione di polimerizzazione. Quando la poliacrilammide nel tubo ha completamente solidificato la reazione è completa. Mentre il primo strato di gel risolutivo è la polimerizzazione, recuperare il kit Azido-PEG3-Maleimide dallo stoccaggio a 20 gradi Celsius e consentire ai componenti di raggiungere la temperatura ambiente.Quindi, sciogliere i componenti della fiala due nel volume raccomandato dal produttore di DMSO. E vortice per 30 secondi per garantire che i liquidi siano ben miscelati. Trasferire il contenuto di una fiala in un pallone inferiore rotondo pulito e asciutto da 100 milliletteri che contiene una barra di agitazione.Inserire immediatamente un tappo di setto di gomma con un diaframma che può essere perforato con una siringa nella bocca del pallone. Quindi, inserire due aghi per siringhe calibro 18 nel diaframma. Collegare uno degli aghi della siringa a un serbatoio di gas inerte e consentire al gas di riempire il pallone inferiore rotondo per tre minuti.Quindi, spegnere il gas inerte e staccarlo dall'ago. Usando una siringa, iniettare l'intero contenuto del flaconcino due nel pallone. Rimuovere entrambi gli aghi e la siringa.Lasciare mescolare i componenti per 30 minuti a temperatura ambiente durante l'agitazione. Dopo questo rimuovere il tappo del setto di gomma e trasferire il contenuto in un tubo di centrifuga pulito da cinque millilitri. Una volta che il primo strato di gel risolutivo ha polimerizzato versare lo strato di isopropanolo.Pipettare un millilitro di acqua deionizzata sopra il gel e quindi versare l'acqua per risciacquare il gel. Recuperare il peptide fluorescente funzionalizzato al tiolo dallo stoccaggio a 80 gradi Celsius. Lasciare scongelare a temperatura ambiente.Preparare una soluzione di gel risolutivo al 10% contenente la molecola del linker Azido-PEG3-Maleimide e il peptide fluorescente come descritto nella tabella uno del protocollo di testo. Immediatamente prima di versare il gel aggiungere il TMED e l'APS. Quindi, riempire metà della porzione rimanente della cassetta di gel con la soluzione di gel risolutivo peptidico.Aggiungere un sottile strato di isopropanolo nella parte superiore del gel di poliacrilammide per produrre un gel di livello e prevenire le bolle. Utilizzare la soluzione di poliacrilammide rimasta per tenere traccia dell'avanzamento della reazione di polimerizzazione. Al termine della reazione, versare lo strato isopropanolo.Pipettare un millilitro di acqua deionizzata sopra il gel e quindi versare l'acqua per risciacquare il gel. Se non si utilizzano immediatamente i gel, conservarli immergendoli in una scatola di plastica piena di 100 millilitri di 1x PBS a quattro gradi Celsius. Avvolgere la scatola in un foglio di alluminio per evitare il fotobleaching.Preparare innanzitutto una soluzione gel di impilamento del 5% come descritto nella tabella uno del protocollo di testo. Immediatamente prima di versare il gel aggiungere il TMED e l'APS. Riempire la porzione vuota rimanente della cassetta di gel con la soluzione di gel impilamento.Inserire rapidamente un pettine di gel da 1,5 millimetri nello strato di gel impilamento assicurandosi che non rimangano bolle intrappolate sotto i pozzi. Utilizzare la soluzione di poliacrilammide rimasta per tenere traccia dell'avanzamento della reazione di polimerizzazione. Al termine della reazione, rimuovere delicatamente il pettine e il nastro dal retro della cassetta di gel.Per iniziare, sciogliere i campioni nel buffer del campione di zimografia convenzionale. Aggiungere 400 millilitro os 1X tris glicenico SDS running buffer all'apparato gel. Caricare fino a 35 microlitri di campione per pozzo.Eseguire i campioni a 120 volt a quattro gradi Celsius per un'ora e mezza o fino a quando gli standard di peso molecolare indicano che le proteasi di interesse si trovano all'interno dello strato di gel che risolve i peptidi. Dopo questo, rimuovere i gel dalla cassetta di plastica. Lavare i gel tre volte in tampone di ri-naturing a temperatura ambiente sotto delicata agitazione.Ad ogni lavaggio, della durata di 10 minuti. Trasferire i gel in una soluzione tampone in via di sviluppo per 15 minuti. Quindi sostituire la soluzione con un tampone di sviluppo fresco e incubare a 37 gradi Celsius sotto delicata agitazione per 24 ore.Successivamente, utilizzare un imager dello scanner di gel fluorescente con i filtri di eccitazione ed emissione appropriati per l'immagine dei gel. In questo studio alla proteasi fluorescente i peptidi degradabili sono incorporati nei gel di poliacrilammide. QGIW è una sequenza derivata dal collagene progettata per rilevare la collagenesi cellulare, mentre LACW è una sequenza ottimizzata per il rilevamento di MMP-14 e MMP-11.L'imaging fluorescente rivela numerose bande all'interno dei gel peptidici LACW, mentre solo una singola banda è vista nei gel QGIW. Rispetto alla zimografia della gelatina, i gel LACW sono in grado di rilevare più bande proteolitiche, il che dimostra la capacità della zimografia peptidica di rilevare una gamma più ampia di proteasi presenti all'interno di campioni biologici rispetto ai metodi tradizionali che utilizzano substrati nativi. Le cellule nemografiche peptidiche vengono quindi incubate in un tampone di sviluppo contenente GM6001, un inibitore dell'MMP ad ampio spettro, o E64, un inibitore generale della catesina.Il trattamento dei gel peptidici LACW con GM6001, diminuisce l'intensità delle bande. Mentre il trattamento con E64 non ha alcun effetto percepibile. Il trattamento dei gel peptidici QGIQ con GM6001 si traduce in una completa ablazione delle bande precedentemente viste.Mentre E64 non ha alcun effetto. La zimografia della gelatina viene condotta utilizzando MMP-9 purificato e attivato per confrontare la sensibilità della zimografia peptidica con l'attuale gold standard. I gel LACW sono in grado di rilevare le concentrazioni più piccole di MMP-9.Le proteasi richiedono condizioni specifiche per riprotersi e attivarsi. Preparare con cura le soluzioni tampone per garantire che la composizione e il PH siano corretti. Questo metodo può essere integrato dalle tecniche esistenti per verificare l'identità ed eseguire ulteriori analisi delle proteasi misurate.Ciò include l'assorbimento occidentale, la PCR in tempo reale e la spettrometria di massa. Fare attenzione quando si maneggia poliacrilammide. La soluzione non ipnotizzata è considerata una potente neurotossina e i dispositivi di protezione individuale appropriati devono sempre essere indossati durante la manipolazione.

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Il fluorescente Detection Kit proteasi è progettato per la misurazione dell'attività della proteasi con fluorometria. E 'anche adatto per il rilevamento di tracce di contaminazione della proteasi. Il metodo si basa sulla hydroysis proteolitica di una formulazione proprietaria di un marcato con FITC substrato di caseina.

L&#39;uso del kit di rilevamento a fluorescenza della proteasi per determinare l&#39;attività della proteasi

Questo protocollo descrive una basata sulle attività di analisi per la rilevazione di metalloproteinasi della matrice in sovranatanti o fluidi corporei.

Rilevamento delle metalloproteinasi della matrice funzionale di zimografia

In questo video, eseguiamo la zimografia, una tecnica elettroforetica, per analizzare l'attività proteolitica all'interno di campioni biologici.

Zimografia peptidica fluorescente: una tecnica modificata per rilevare l'attività della proteasi utilizzando substrati fluorogenici in gel per zimogrammi

Questo video mostra la tecnica di elettroforesi su gel per zimografia per valutare l'attività delle metalloproteinasi della matrice (MMP) presenti nel surnatante di coltura cellulare. Le MMP attive degradano il substrato specifico per MMP incorporato in un gel di poliacrilammide, che appare come bande chiare su uno sfondo macchiato scuro dopo la colorazione.

Elettroforesi su gel per zimografia: una tecnica elettroforetica per rilevare le metalloproteinasi della matrice valutando l'attività enzimatica

Questo video mostra un test per lo screening dell'attività proteolitica delle proteasi utilizzando peptidi fluorogenici. La proteasi riconosce il suo sito di scissione sul peptide, scorporandolo e separando il quencher dal fluoroforo, consentendone l'emissione di fluorescenza. Il segnale di fluorescenza viene rilevato e analizzato per verificare l'efficienza di scissione di diverse varianti peptidiche.

Un saggio di scissione del peptide fluorogenico per lo screening dell'attività proteolitica delle proteasi

Descriviamo un semplice test colorimetrico quantitativo che misura specificamente l'attività proteolitica del Granzima B (GzmB) umano, di topo o di ratto. Questo protocollo può essere facilmente adattato per determinare l'attività proteasica di altre serina proteasi in granuli mediante l'idrolisi di altri substrati peptidici sintetici con un'appropriata sequenza di riconoscimento.

Un colorimetrico metodo che misura particolare Granzyme B proteolitici attività: idrolisi di Boc-Ala-Ala-Asp-S-Bzl

Qui, presentiamo un protocollo per determinare l'orientamento e la topologia delle proteine integrali di membrana nelle cellule viventi. Questo semplice protocollo si basa sulla sensibilità selettiva alla proteasi delle chimere tra la proteina di interesse e la GFP.

Determinazione Membrane Protein Topologia Usando fluorescenza Protease Protection (FPP)

Qui, presentiamo un protocollo per determinare la specificità di proteasi in tessuto grezzo del mouse estratti usando spettrometria MALDI-TOF.

La determinazione della specificità della proteasi nel Mouse tessuto estratti mediante spettrometria di massa MALDI-TOF: manipolazione di PH per causare i cambiamenti di specificità

Qui, presentiamo la procedura dettagliata di una piattaforma di analisi sviluppata di recente proteasi che utilizza N-terminale hexahistidine/maltosio-proteina e substrati ricombinante fusi con proteine fluorescenti attaccati alla superficie di nichel-nitrilotriacetico acido dell'agarosi magnetico perline. Una successiva analisi in gel dei campioni test separati da elettroforesi dodecilica del gel del solfato-poliacrilammide di sodio inoltre è presentata.

Uso delle proteine di fusione ricombinante in una piattaforma di analisi fluorescente proteasi e loro rinaturalizzazione In-gel

Presentiamo un'analisi di clivaggio di peptide fluorogenico che consente un rapido screening dell'attività proteolitica delle proteasi su peptidi che rappresenta il sito di clivaggio di peptidi virali fusione. Questo metodo può essere utilizzato anche su qualsiasi altro motivo dell'amminoacido all'interno di una sequenza della proteina per verificare l'attività della proteasi.

Un'analisi di clivaggio Peptide fluorogenico alla schermata per attività proteolitica: applicazioni per coronavirus spike l'attivazione della proteina

Le proteinasi sono vitali per la patogenesi batterica, consentendo l'invasione e l'evasione immunitaria. L'estrazione in un'unica fase delle proteine citoplasmatiche e di membrana dei batteri nella loro forma attiva è straziante. Questo articolo video mostra l'estrazione di intere proteine cellulari di Leptospira per l'analisi zimografica per rilevare e caratterizzare le gelatinasi.

Estrazione in un'unica fase e analisi zimografica delle gelatinasi batteriche

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Rilevazione di attività di proteasi dallo Zymography Peptide fluorescente

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