Name: Purificazione e analisi di un anticorpo monoclonale da cellule ovaio Cesster cinese utilizzando un sistema microbioreante automatizzato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-05-01T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 50 s
Description: Impara la purificazione e l'analisi di anticorpi monoclonali da fluidi di coltura cellulare utilizzando microbioreattori automatizzati. Questo metodo consente di determinare gli attributi critici di qualità con volumi di campione minimi.

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Gli autori desiderano ringraziare Scott Lute per il supporto analitico che ha fornito. Il finanziamento interno parziale e il sostegno a questo lavoro sono forniti dal CDER Critical Path Program (CA #1-13). Questo progetto è sostenuto in parte da un appuntamento al programma di partecipazione tirocinio/ricerca presso l'Office of Biotechnology Products, U.S. Food and Drug Administration, amministrato dall'Oak Ridge Institute for Science and Education attraverso un accordo interagenzia tra il Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti e la FDA.

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Questa pubblicazione riflette le opinioni dell'autore e non deve essere interpretata per rappresentare le opinioni o le politiche della FDA.

L'HCCF contiene detriti e particelle di grandi dimensioni che possono intasare e distruggere costose strumentazioni, quindi è necessario un chiarimento della coltura prima di un'ulteriore elaborazione a valle. La centrifugazione è generalmente il primo approccio per separare le cellule e altre particelle insolubili dalle proteine seguite dalla filtrazione. Questo HCCF filtrato viene quindi sottoposto alla cromatografia Liquida delle Proteine Veloci (FPLC) per la purificazione. La purificazione dell'HCCF da microbiorifici automatizzati per ottenere il prodotto è un passo importante nella lavorazione a valle. Qui, un sistema FPLC da banco con una colonna proteina A viene utilizzato per ottenere anticorpi monoclonali dall'HCCF. L'analisi per i processi a monte può fornire informazioni utili sul comportamento delle cellule e guidare la progettazione dei bioprocessi, contribuendo a ottenere un prodotto di qualità coerente e affidabile. Analytics ci permette anche di collegare gli attributi di qualità critica (CQA) ai processi a monte e a valle. Qui sono presentati quattro saggi che sono comunemente utilizzati nella caratterizzazione degli anticorpi monoclonali. Queste tecniche sono robuste, affidabili e facilmente dispiegabili per l'analisi dei processi e dei prodotti da una varietà di fonti a monte che sono solo parzialmente purificate e possono ancora contenere livelli residui di DNA e HCP.
Quando si puliscono i campioni per l'analisi, è necessario trovare un importante equilibrio tra la creazione di un campione sufficientemente pulito per l'analisi, preservando al contempo la variabilità presente nel bioreattore. I due contaminanti più comuni che colpiscono il prodotto sono il DNA e l'HCP, che possono essere controllati misurando l'assorbimento del rapporto a 260/280 nm e attraverso SDS-PAGE o .CE-SDS. I saggi qui presentati non sono sensibili a bassi livelli di contenuto di DNA. La purezza del prodotto è pura >95%, come determinato da .CE-SDS.
L'analisi delle varianti di carica con un sistema di elettroforesi microcapillare fornisce un metodo ad alta velocità effettiva per identificare le varianti di carica, con chip e reagenti che sono relativamente facili da implementare. La natura della tecnica e la chimica del reagente di etichettatura sono sensibili sia agli eccipienti che ad altre ammine primarie, richiedendo quindi una fase di salvifica per la maggior parte delle matrici campione. Per esperienza, bassi livelli di co-migrazione del DNA con il colorante libero dalla reazione di etichettatura e non influiscono sulla qualità dei risultati. Mentre la variabilità della quantificazione di picco di base, principale e acida è in genere <1%, livelli più elevati di DNA e altri contaminanti possono aumentare la variabilità del saggio. È estremamente importante essere coerenti con l'etichettatura delle proteine e garantire l'uso tempestivo di DMF dopo la rimozione dalla bottiglia e il composto con il tinrito. Lisina e/o standard di istina sono raccomandati come controlli di etichettatura. Nel corso del tempo e a seconda della qualità del campione, i trucioli possono fallire o perdere il rivestimento sui canali microfluidici, portando a un maggiore rumore, alla presenza di picchi fantasma e a una maggiore variazione da campione a campione. Per identificare questa occorrenza, gli spazi vuoti e uno standard di idoneità del sistema (ad esempio NISTmAb) sono stati analizzati contemporaneamente con i campioni a intervalli regolari. Quando si verificano problemi di trucioli, i trucioli possono essere lavati con la soluzione di stoccaggio o sostituiti.
I metodi utilizzati per l'analisi glicana delle glicoproteine terapeutiche coinvolgono principalmente la cromatografia liquida (LC) e/o la spettrometria di massa (MS), con l'analisi del microarray lectin che guadagna popolarità come terza opzione25. Il metodo descritto in questo documento utilizza sia LC che MS, che presenta vantaggi e svantaggi. I metodi spettrometrici di massa hanno il vantaggio di verificare di massa i glicani analizzati, il che non è possibile con i metodi basati su LC utilizzando un'uscita di rilevamento fluorescente o microarray di lectina. Questo metodo utilizza il rilevamento LC e fluorescenza per assegnare identità glicani utilizzando il confronto del tempo di conservazione a uno standard di scala dextran. Il monitoraggio della fluorescenza consente una maggiore sensibilità e quantificazione grazie alla facilità di rilevazione, dove la sola SM potrebbe non essere in grado di quantificare le specie a bassa abbondanza a causa della scarsa efficienza ionizzazione degli oligosaccari. Le informazioni di massa provenienti dalla SM vengono utilizzate per confermare le identità glican, ma il software di elaborazione non utilizza le informazioni di massa come criteri di assegnazione primari. Quindi, senza cromatografia riproducibile e picchi facilmente risolvibili, questo metodo può soffrire per quanto riguarda le assegnazioni di glicani. Fortunatamente, le informazioni di massa possono aiutare con le assegnazioni di glicani anche in situazioni in cui la cromatografia è scadente, come i cambiamenti nel tempo di ritenzione che ostacolano le assegnazioni di glicani riproducibili. Se questo metodo viene utilizzato senza SM, la cromatografia deve essere al livello più alto poiché le informazioni di massa non possono essere utilizzate per correggere la deriva del tempo di soggiorno.
Il metodo di analisi degli amminoacidi qui descritto utilizza LC-MS per la rapida quantificazione di aminoacidi non derivati nei media di coltura cellulare grezza. I metodi alternativi di analisi degli amminoacidi richiedono agenti di derivazione degli amminoacidi per abilitare il rilevamento UV26. Il metodo LC-MS offre importanti vantaggi rispetto al metodo LC-UV: consente l'identificazione in base sia al tempo di ritenzione che alla massa di ioni rispetto al metodo LC-UV, che è limitato dalla mancanza di caratterizzazione di massa. Inoltre, il metodo LC-MS offre vantaggi in termini di tempo e riproducibilità, in quanto il metodo LC-UV richiede una reazione di derivazione che richiede molto tempo, che può impartire variabilità del campione27. Tuttavia, l'iniezione di supporti per la coltura delle cellule grezze nel metodo LC-MS può causare effetti nocivi sul segnale MS a causa dell'incrostazione dello skimmer io. Una scala di calibrazione viene iniettata frequentemente come un controllo di idoneità del sistema e l'ordine dei campioni viene randomizzato per evitare distorsioni nei dati.
Il processo di coltura cellulare per la produzione di anticorpi mediante microbioriche è descritto in precedenza9. In questo studio, i protocolli dettagliati per i metodi di caratterizzazione dell'anticorpo monoclonale che massimizzano i dati acquisiti da volumi di campioni limitati sono ben definiti. Quantità limitate di fluido di coltura cellulare raccolte possono talvolta limitare le informazioni sui prodotti acquisite e la selezione delle giuste procedure analitiche per ottenere i dati sulla qualità del prodotto è essenziale. Le analisi sono importanti per collegare i parametri di processo a monte alle variazioni della qualità del prodotto. Qui, è prevista una linea guida per gli utenti per caratterizzare mAbs quando si lavora con microbiorici.

Le terapie proteiche vengono utilizzate per trattare una crescente varietà di condizioni mediche, tra cui complicazioni del trapianto di tessuto, disturbi autoimmuni e tumori1. Dal 2004, la Food and Drug Administration (USFDA) degli Stati Uniti ha documentato una percentuale crescente di domande di licenza biologica (BLA) di tutte le approvazioni regolate dal Center for Drug Evaluation and Research (CDER), con BLA che rappresentano oltre il 25% nel 2014 e nel 20152.
Considerando questo mercato in espansione, i produttori di biofarmaceutici sono sfidati con la fornitura rapida di più prodotti con qualità costante. Gli sforzi per aumentare la resa dei prodotti si sono concentrati sull'ingegneria delle celle CHO e sullo screening della linea di produzione, anche se i miglioramenti più significativi sono dovuti ai progressi nell'ottimizzazione della strategia media/feed e nei controlli ambientali della coltura cellulare1, 3 (COM del nome , 4 DEL psu' , 5 durante il processo di produzione.
Poiché i mAb sono prodotti in un sistema biologico, ci può essere una variabilità intrinseca delle proteine. La composizione degli anticorpi può essere alterata post-traduzione, come la glicosilazione o influenzata da degradazione o reazioni enzimatiche. Queste variazioni strutturali possono provocare reazioni immunitarie pericolose o alterare il legame degli anticorpi, che a sua volta può ridurre o eliminare la funzione terapeutica prevista5. Pertanto, gli attributi di qualità critica (CQA) degli anticorpi monoclonali - profilo N-glican, distribuzione della variante di carica e percentuale di anticorpi in forma monomerica - sono regolarmente monitorati e controllati come parte di un approccio Quality by Design (QbD) durante processi di produzione1,6. In un ambiente di produzione regolamentato, le proteine terapeutiche devono soddisfare i criteri di accettazione per essere autorizzate come prodotto farmacologico commerciale approvato7. I metodi qui presentati sono in genere parte del processo di caratterizzazione di qualità per un anticorpo7,8, e qualsiasi scienziato proteico avrà familiarità con il loro utilizzo.
Nel lavoro precedente9, è stata descritta l'applicazione e il funzionamento di microbioricheper lo screening ad alta produttività delle condizioni di coltura cellulare nel bioprocesso a monte. Il prodotto purificato ottenuto dalle diverse condizioni dei supporti è sottoposto ad analisi N-glycan utilizzando modelli LC-MS. Glycosylation di proteine terapeutiche può essere rilevato e caratterizzato utilizzando tecniche LC-MS10,11, e la presenza di varie specie di glicani è stata collegata a parametri di bioprocesso quali strategia di alimentazione, pH e temperatura12. L'effetto delle diverse condizioni dei media sulla qualità del prodotto, indicato dalla percentuale dell'IgG risultante in forma monomerica, viene valutato anche con La cromatografia di esclusione delle dimensioni- Dispersione luminosa multi-angolo (SEC-MALS)13,14 , 15.Il profilo della variante di carica rappresenta una serie di modifiche16 che potrebbero influire sulla funzione di un prodotto. L'elettroforesi a zona microcapillare (mC) è una tecnica che offre un tempo di analisi notevolmente più veloce rispetto alla cromatografia tradizionale dello scambio di cation (CEX) e ai metodi di messa a fuoco isoelettrica capillare (cIEF) utilizzati per l'analisi delle varianti di carica17 ,18. Sono stati analizzati i supporti di bioreattori spesi per monitorare il consumo di amminoacidi durante la produzione di proteine in relazione ai cambiamenti negli attributi identificativi dell'anticorpo19,20,21,22 , 23.
L'analisi delle proteine ci consente di identificare i parametri di processo critici (CPP) in base alle relazioni tra gli input di processo e i cambiamenti nei CQA. Durante lo sviluppo del bioprocesso, l'identificazione e la misurazione dei CPC dimostra fondamentalmente il controllo dei processi e assicura che il prodotto non sia cambiato, il che è essenziale in ambienti di produzione altamente regolamentati. In questo documento vengono presentate tecniche analitiche per misurare alcune delle caratteristiche biochimiche delle proteine più pertinenti al prodotto CQA (profilo N-glican, varianti di carica e omogeneità delle dimensioni).

<table><tbody><tr><td>CHO DG44 Linea cellulare</td><td>Invitrogen</td><td>A1100001</td><td></td></tr><tr><td>Akta Avant 25</td><td>General Electric Life Sciences</td><td>28930842</td><td></td></tr><tr><td>Pro Sep vA Ultra Cromatografia Resina</td><td>Millipore Sigma</td><td>115115830</td><td>Purificazione Fase stazionaria</td></tr><tr><td>Omnifit Colonna da 10 cm</td><td>Diba Fluid Intelligence</td><td>006EZ-06-10-AA</td><td>Alloggiamento per fase stazionaria</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-1</td><td></td></tr><tr><td>Superloop 10 ml</td><td>GE Healthcare</td><td>18-1113-81</td><td></td></tr><tr><td>&micro; Dawn Rilevatore di diffusione della luce multiangolare</td><td>Wyatt</td><td>WUDAWN-01</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; m Unità di filtro Millex GV Membrana PVDF</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGV033RB</td><td></td></tr><tr><td>10X Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Corning</td><td>46-013-CM</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 12 ml</td><td>Covidien</td><td>8881512878</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity Binary Pump</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4220A</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity DAD&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4212A</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity Campionatore</td><td>Agilent Technologies</td><td>G4226A</td><td></td></tr><tr><td>1290 Termostato Infinity</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1330B</td><td></td></tr><tr><td>1290 Infinity Scomparto colonna termostatata</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1316C</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Falcon tube</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>Inserti in vetro da 150 uL con piedini in polimero&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5183-2088</td><td></td></tr><tr><td>Provetta Falcon da 50 mL</td><td>Corning Inc.</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 96 pozzetti</td><td>Bio-Rad</td><td>127737</td><td></td></tr><tr><td>acido acetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695072</td><td></td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Fisher Chemical</td><td>BPA996-4</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY Classe I UPLC</td><td>BSM Waters Corporation</td><td>18601504612</td><td></td></tr><tr><td>ACQUITY Classe I UPLC Sample Manager</td><td>Waters Corporation</td><td>186015000</td><td></td></tr><tr><td>Rivelatore ACQUITY UPLC FLR</td><td>Waters Corporation</td><td>176015029</td><td></td></tr><tr><td>Filtri centrifughi Amicon Ultra-4 100 kDa</td><td>Merck Millipore</td><td>UFC810096</td><td></td></tr><tr><td>Amino Acid Standard, 1 nmol/&micro; L&nbsp;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5061-3330</td><td></td></tr><tr><td>Integratore di aminoacidi</td><td>Agilent Technologies</td><td>5062-2478</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di formiato di ammonio - Analisi dei glicani</td><td>Waters Corporation</td><td>186007081</td><td></td></tr><tr><td>Tappi a vite blu con setti</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0717</td><td></td></tr><tr><td>CD OptiCHO AGT Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A1122205</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>22363352</td><td></td></tr><tr><td>Charge Variant Chip</td><td>Perkin Elmer</td><td>760435</td><td></td></tr><tr><td>Kit di reagenti</td> per cromatografia <td>CLS760670</td><td></td><td>Perkin Elmer</td></tr> (<tr><td>grado MS)</td><td>Fisher Chemical</td><td>W6-4</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilformammide</td><td>Thermo Scientific</td><td>20673</td><td></td></tr><tr><td>Collettore per piastre di estrazione per Oasis 96-Well Plates</td><td>Waters Corporation</td><td>186001831</td><td></td></tr><tr><td>Acido formico</td><td>Fisher Chemical</td><td>A117-50</td><td></td></tr><tr><td>GlycoWorks RapiFlour-MS N-Glycan Starter Kit - 24 Sample</td><td>Waters Corporation</td><td>176003712</td><td></td></tr><tr><td>GXII Buffer Tubes</td><td>E& K Scientific</td><td>697075- Panno</td> per la pulizia delle finestre di rilevamento NC <td></td></tr><tr><td>GXII</td><td>VWR</td><td>21912-046</td><td></td></tr><tr><td>GXII HT Touch</td><td>Perkin Elmer</td><td>CLS138160</td><td></td></tr><tr><td>GXII Tubi per scale</td><td>Genemate</td><td>C-3258-1</td><td></td></tr><tr><td>GXII Tampone privo di lanugine</td><td>ITW Texwipe</td><td>TX758B</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-500</td><td></td></tr><tr><td>Controllo della massa mAb intatto Standard</td><td>Waters Corporation</td><td>186006552</td><td></td></tr><tr><td>Colonna di aminoacidi Intrada 150 x 2 mm</td><td>Spettrofotometro UV-Vis a microvolume Imtakt</td><td>WAA25</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>840274100</td><td></td></tr><tr><td>Optilab UT-rEX Rilevatore di indice di rifrazione differenziale</td><td>Wyatt</td><td>WTREX-11</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Aldrich Chemistry</td><td>311421</td><td></td></tr><tr><td>Puntali per pipette con microcapillare per il caricamento di gel</td><td>Labcon</td><td>1034-960-008</td><td></td></tr><tr><td>Micropiastra in polipropilene a 96 pozzetti, fondo F, a camino, Greiner nero</td><td>Bio-One</td><td>655209</td><td></td></tr><tr><td>RapiFlour-MS Scaletta di calibrazione del destrano</td><td>Waters Corporation</td><td>186007982</td><td></td></tr><tr><td>Fiala trasparente con tappo a vite da 2 ml</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0715</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>383112</td><td></td></tr><tr><td>TSKgel UP-SW3000 4,6 mm ID x 30 cm L</td><td>Tosoh Biosciences</td><td>003449</td><td></td></tr><tr><td>UNIFI Scientific Information System</td><td>Waters Corporation</td><td>667005138</td><td></td></tr><tr><td>Collettore a vuoto Waters</td><td>Corporation</td><td></td><td></td>186007986</tr><tr><td>Pompa per vuoto</td><td>Waters Corporation</td><td>725000604</td><td></td></tr><tr><td>Xevo G2 Q-ToF</td><td>Waters Corporation</td><td>186005597</td><td></td></tr><tr><td>Colonna di desalinizzazione Zeba Spin, 0,5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>89883</td><td></td></tr></tbody></table>

purificazione e analisi di un anticorpo monoclonale da cellule ovaio cesster cinese utilizzando un sistema microbioreante automatizzato

Purification and Analytics of a Monoclonal Antibody from Chinese Hamster Ovary Cells Using an Automated Microbioreactor System

Gli anticorpi monoclonali (mAbs) sono uno dei prodotti biologici più popolari e ben caratterizzati prodotti oggi. Più comunemente prodotto utilizzando cellule dell'ovaio di criceto cinese (CHO), coltura e condizioni di processo devono essere ottimizzati per massimizzare i titer anticorpe e raggiungere profili di qualità target. In genere, questa ottimizzazione utilizza bioreattori automatizzati su microscala (15 mL) per lo screening di più condizioni di processo in parallelo. I criteri di ottimizzazione includono le prestazioni di coltura e gli attributi di qualità critici (CQA) del prodotto anticorpo monoclonale (mAb), che possono influenzare la sua efficacia e sicurezza. Le metriche delle prestazioni legate alla cultura includono la crescita delle cellule e il consumo di nutrienti, mentre i CQA includono i profili di N-glicosilazione e aggregazione del mAb, le varianti di carica e il peso molecolare. Questo protocollo dettagliato descrive come purificare e successivamente analizzare i campioni HCCF prodotti da un sistema microbioriale automatizzato per ottenere preziose metriche e output delle prestazioni. In primo luogo, una proteina automatizzata Un metodo di cromatografia liquida a proteina veloce (FPLC) viene utilizzato per purificare il mAb da campioni di coltura cellulare raccolti. Una volta concentrati, i profili glicani vengono analizzati dalla spettrometria di massa utilizzando una piattaforma specifica (fare riferimento alla Tabella dei Materiali). I pesi molecolari dell'anticorpo e i profili di aggregazione sono determinati utilizzando la cromatografia ad esclusione di dimensioni- la dispersione della luce ad angolo multiplo (SEC-MALS), mentre le varianti di carica vengono analizzate utilizzando l'elettroforesi della zona capillare del microchip . Oltre alle metriche delle prestazioni culturali acquisite durante il processo di bioreattore (cioè la vitalità della coltura, il numero di cellule e i metaboliti comuni, tra cui glutammina, glucosio, lattato e ammoniaca), vengono analizzati i supporti spesi per identificare i nutrienti migliorare le strategie di alimentazione e la progettazione complessiva del processo. Pertanto, viene descritto anche un protocollo dettagliato per la quantificazione assoluta degli amminoacidi mediante spettrometria di massa di cromatografia liquida (LC-MS) dei supporti esauriti. I metodi utilizzati in questo protocollo sfruttano le piattaforme ad alta velocità effettiva compatibili per un numero elevato di campioni di piccoli volumi.

Il fluido di coltura cellulare raccolto dal bioreattore automatizzato su microscala viene purificato utilizzando la cromatografia liquida a proteina veloce (FPLC), come si è visto nella Figura 1 e gli attributi di qualità critica delle proteine purificate (CQA) sono stati caratterizzati da vari metodi analitici a valle. Questo è un vantaggio chiave del sistema microbioreale automatizzato; le differenze nei CQA possono essere valutate rapidamente in un'ampia gamma di condizioni. I dati N-glycan provenienti da mAbs prodotti da CHO elaborati dalla spettrometria di massa dovrebbero apparire come i cromatogrammi illustrati nella Figura 2. La figura raffigura un confronto tra due cromatogrammi che mostrano che il picco mannose 5 (M5) da un campione è notevolmente inferiore. Se si osserva solo una linea di base rumorosa invece dei picchi, ciò può significare che l'impostazione della cromatografia è difettosa o che la procedura non ha esito positivo. Utilizzando i controlli, la risoluzione dei problemi può essere semplificata. In primo luogo, valutare i picchi DI FLR dalla scala dextran; questi picchi indicano che il sistema cromatico funziona correttamente. Successivamente, confrontare i picchi ottenuti sperimentalmente con quelli ottenuti da uno standard mAb intatto elaborato. Se i picchi dello standard sono visibili, ma non vengono identificati picchi di campione, i campioni mAb non sono stati elaborati correttamente. Ciò può essere dovuto alla presenza di SDS o nucleofilo nel tampone che interferisce con l'etichettatura e la purificazione di N-glicani.
SEC-MALS può essere utilizzato per valutare altri due CQA: il profilo di aggregazione e il peso molecolare dell'anticorpo. Un cromatogramma SEC-MALS rappresentativo è paragonabile a quello illustrato nella figura 3. La distribuzione di massa molecolare e il peso molecolare assoluto sono stati determinati utilizzando il software richiesto con un coefficiente di estinzione di 1,37 mL (mg-cm)-1 e un dn/dc di 0,185 mL/g. Poiché le chiamate di picco e l'impostazione della linea di base nel software vengono eseguite manualmente, i risultati possono variare leggermente da utente a utente. Il peso molecolare assoluto del monomerico IgG1 della Figura 3 è 1,504 x 105 Da - 0,38% (blu) e il complesso di ordine superiore è 7,799 x 105 Da - 3,0% (rosso). La polidispersità degli aggregati è molto maggiore di quella del monomero, come indicato dalla distribuzione di massa molare rossa del picco 1 (Figura 3). La piccola quantità di campione e l'importanza dell'aggregazione come CQA rendono questa tecnica uno strumento analitico complementare di grande valore per il sistema microbioretico automatizzato.
Il risultato di mC-E è un elettropherogram, come in Figura 4, che mostra il profilo della variante di carica per un anticorpo monoclonale. Il profilo è una firma unica per la proteina in fase di studio ed è altamente sensibile al pH operativo. È visibile anche un picco di tinri liberi a sinistra del profilo della variante di carica. Quando si stabilisce un pH operativo, c'è una certa discrezionalità per l'operatore di bilanciare la risoluzione e il segnale; inoltre, l'operatore deve garantire una buona separazione dal picco di tinture libere che migra a 30 dollari. Il campione può essere dissalato dopo l'etichettatura per rimuovere questo picco, anche se questo porta ad una perdita significativa nel segnale. Una volta stabilito un pH di esercizio, è possibile confrontare i profili campione. Sebbene generalmente coerenti, i cambiamenti nell'efficienza dell'etichettatura o le differenze negli eccipienti possono portare a piccole differenze nella migrazione di un campione e nel profilo della variante di carica che rende gli elettroferigrammi difficili da confrontare direttamente. Invece, il metodo di confronto è di solito basato sulle percentuali delle specie di base, principali e acide. In questo caso, le differenze relative fino all'1-2% possono essere identificate utilizzando mC-E.
Il consumo di amminoacidi può essere monitorato per determinare se l'esaurimento sta causando cambiamenti nei CQA. Le letture di croromatogramma dallo spettrometro di massa possono essere utilizzate per valutare la creazione di una curva di calibrazione per la quantificazione assoluta degli amminoacidi nei campioni di supporti bioreattori grezzi. La figura 5 illustra due cromatogrammi ionici totali (TIC) e un cromatogramma iostrai estratto (XIC) come risultati rappresentativi durante questo processo. Nella Figura 5A, il TIC illustrato illustra il segnale di fondo dal sistema di buffer come solo un vuoto d'acqua è stato iniettato. Figura 5 B raffigura un TIC rappresentativo dello standard aminoacido in cui, rispetto al vuoto d'acqua, si possono osservare piccoli picchi che corrispondono alle singole specie di amminoacidi (come la lisina a 7,96 minuti). Per integrare il picco e facilitare la quantificazione dell'area di picco (e quindi la concentrazione), viene utilizzato l'XIC dove viene visualizzato solo il segnale proveniente da una "finestra di massa cromatogramma" definita. A seconda della sensibilità dello strumento e della qualità della separazione cromatica, la finestra di massa ottimale dovrà essere determinata dall'utente. In questo esempio (Figura5C), lo XIC della lisina (m/z - 147.1144) con una finestra di massa di 10 ppm viene visualizzata in cui la lisina nello standard degli amminoacidi eviene dalla colonna a 8,03 minuti.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig1.jpg"> Figura 1 . Cromatogramma rappresentativo dello schema di purificazione utilizzando la tecnica Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC). Le fasi del metodo di purificazione corrispondenti al volume (mL) sono etichettate lungo l'asse x. L'assorbimento UV a 280 nm (asse y mAU, linea continua) viene monitorato durante l'intero ciclo di purificazione. Le impurità non specificamente legate vengono spostate aumentando la conduttività (mS/cm asse y, linea tratteggiata) durante l'anticorpo High Salt Wash. (visualizzato). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig1large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig2.jpg"> Figura 2. Un cromatogramma a fluorescenza rappresentativo ottenuto da glicani etichettati che vengono verificati in massa. L'asse x è il tempo di ritenzione (minuti) mentre l'asse y è l'intensità del segnale. Il picco a 14,94 min rappresenta il glicano Mannose 5 (M5), dove si può osservare una grande differenza tra la potenza del segnale M5 tra i due campioni sovrapposti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig2large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig3.jpg"> Figura 3. Distribuzione del peso molecolare dell'anticorpo monoclonale IgG1. Cromatogramma di un anticorpo monoclonale IgG1 intatto separato da cromatografia di esclusione di dimensioni in 1x PBS (pH7.4). L'assorbimento è monitorato a 280 nm (asse nero; asse sinistro) e sono stati utilizzati rilevatori di indici di dispersione della luce e di rifrazione per calcolare il peso molecolare assoluto di ogni picco (rosso e blu; asse destro). Le specie ad alto peso molecolare sono indicate con il picco etichettato "HMW". <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig3large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig4.jpg"> Figura 4 . Profilo variante di carica di un anticorpo monoclonale IgG1. Questo elettroferogramma viene generato su una piattaforma mC-E. Un picco di tinture libere migra a 30 s ed è ben separato dall'IgG1. Per la quantificazione, i picchi sono stati suddivisi in specie di base, principali e acide utilizzando un software di analisi dei dati strumentali. La linea rossa delinea le aree di picco integrate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig4large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58947/58947fig5.jpg"> Figura 5. Risultati rappresentativi dei cromotogrammi ionici per l'analisi degli amminoacidi a base di spettrometria di massa dei supporti bioreattori grezzi. L'asse x è il tempo (minuti) mentre l'asse y è l'intensità del segnale (A) Uno spazio d'acqua funge da controllo negativo e rivela il segnale di fondo osservato nel corso del gradiente di cromatografia liquida (B) Il 225 pmol / amminoacido standard è usato qui come un controllo positivo, come i singoli picchi osservati in questo cromatogramma iosrappresentatore totale rappresentano i diversi aminoacidi della miscela standard in fase di risoluzione cromatograficamente (C) Un rappresentativo cromatogramma iostrai per m /z 147.1144, che è lisina. Il picco di 7,96 min in B corrisponde al picco 8.03 in C di lisina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58947/58947fig5large.jpg" target="_blank">Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

È stato descritto un protocollo dettagliato per la purificazione e la successiva analisi di un anticorpo monoclonale proveniente da fluido di coltura cellulare raccolto (HCCF) di microbiorici automatizzati. Viene inoltre presentato l'uso di analisi per determinare gli attributi di qualità critica (CQA) e massimizzare il volume di campione limitato per estrarre informazioni vitali.

Purificazione e analisi di un anticorpo monoclonale da cellule ovaio Cesster cinese utilizzando un sistema microbioreante automatizzato

Monoclonal antibodies (mAbs) are one of the most popular and well-characterized biological products manufactured today. Most commonly produced using ...

Questo protocollo affronta l'analisi di campioni limitati ottenuti da microbioreattori per estrarre informazioni vitali sugli attributi critici di qualità dei prodotti. Un altro vantaggio di queste tecniche è che utilizzano tempi minimi di analisi per determinare gli attributi chiave che dettano i parametri di qualità del prodotto fabbricato. A dimostrare la procedura saranno David Powers, Talia Faison e Phillip Angart, ricercatori del mio laboratorio.Iniziare aprendo il software collegato al sistema di purificazione e posizionando 15 tubi conici millilitro per raccogliere l'eluato anticorpale purificato e tubi conici da 50 millilitri per raccogliere il flusso durante il lavaggio ad alto sale nel collettore di frazione. Aggiungere quindi un liquido di coltura cellulare raccolto filtrato a poro da 0,22 micrometri a una siringa vuota da 12 millilitri con un ugello chiuso. Dopo aver rimosso il cappuccio, inserire l'ugello della siringa nella porta di iniezione manuale del sistema di purificazione.Ruotare la siringa per stringerla in posizione e deprimere lo stantuffo fino a quando l'intero volume del campione non è stato iniettato ed è visibile nell'anello del campione di grande volume da 10 millilitri collegato. Selezionare il metodo salvato e fare clic su Esegui quando richiesto dal software dello strumento. Quando tutto l'anticorpo è stato eluso, neutralizzare immediatamente la proteina purificata con una base tris molare ad un pH di circa 5,5.Per concentrare l'anticorpo purificato mediante centrifugazione, posizionare 100 filtri di kilodalton in tubi di raccolta dei filtrati. Lavare i filtri con 500 microlitri di acqua distillata doppia, quindi centrifugare. Ripetere il lavaggio del filtro due volte.Dopo il secondo lavaggio, scartare il filtrato e trasferire i filtri risciacquati in nuovi tubi di centrifuga. Aggiungere quindi 500 microlitri di campione a ciascun filtro per la centrifugazione. Al termine dello spin, invertire il filtro in un nuovo tubo di raccolta per ottenere il campione concentrato con una centrifugazione finale.Per l'etichettatura e l'isolamento degli N-glicani, diluire 7,5 microlitri di ciascun campione di anticorpi concentrati. Con 15,3 microlitri di spettrometria di massa cromatografica liquida o acqua di grado LCMS in tubi da un millilitro dal kit e denaturare gli anticorpi con sei microlitri di una soluzione al 5% di un tensioattivo rispettoso dell'enzima e della spettrometria di massa a 90 gradi Celsius per tre minuti. Al termine della denaturazione, lasciare raffreddare i campioni a temperatura ambiente per tre minuti prima di aggiungere 1,2 microlitri di peptide N-glicosidasi F per un'incubazione di cinque minuti a 50 gradi Celsius.Dopo aver raffreddato i campioni per tre minuti a temperatura ambiente, etichettare i campioni con 12 microlitri di reagente di tagging fluorescente sciolto in dimetilformamide anidra per cinque minuti a temperatura ambiente. Al termine dell'incubazione, diluire la miscela N-glicina etichettata con 358 microlitridi di acetonitrile e posizionare una lastra di cromatografia ad interazione idrofila in un collettore sottovuoto con shm e vassoio di scarto. Condizionare i pozzi con 200 microlitri d'acqua con il vuoto regolato a 10-15 kilopascal per garantire che il liquido ci prenderà dai 15 ai 30 secondi per passare attraverso la resina cromatografica ad interazione idrofila.Equilibrare i pozzi con 200 microlitridi dell'85% di acetonitrile per 15-30 secondi prima di caricare 400 microlitri di ogni miscela di glicina etichettata su ogni pozzo, applicando il vuoto dopo l'aggiunta di ogni nuovo liquido. Una volta aggiunti tutti i campioni, lavare la resina due volte con 600 microlitri dell'1% di acido formico e del 90% di acetonitrile per lavaggio e sostituire il vassoio di scarto con tubi di raccolta a 600 microlitri. Quindi eluire gli N-glicani etichettati con tre volumi di 30 microlitri di tampone di eluizione della spettrometria e diluire le diluizioni della piscina con 310 microlitri di dimetilformamide in eluente campionato acetonitrile.Per analizzare i campioni di eluizione N-glicina etichettati su un sistema di cromatografia liquida ad ultraperformance accoppiato a un rilevatore di fluorescenza e a un tempo quadruplo di spettrometro di massa di volo, utilizzare un formato di ammonio millimolare e acetonitrile di grado 100%LCMS per le fasi mobili. Impostare la portata iniziale su 0,4 millilitri al minuto, con il gradiente LC che fornisce un formato di ammonio crescente durante la fase di eluizione. Impostare il rivelatore di fluorescenza per misurare un'eccitazione di 265 nanometri e un'emissione di 425 nanometri con una frequenza di campionamento di due hertz.Impostare il quadruplo tempo di volo sulla modalità di sensibilità agli ioni positiva ms1 con un intervallo di massa da 100 a 2.000 Dalton, un tempo di scansione di 0,25 secondi e un'acquisizione di dati continuum. Quindi caricare i campioni nel campionatore automatico impostato su 10 gradi Celsius ed eseguire il metodo caricato. Per dissaltare un campione in preparazione all'analisi della variante di carica, staccare il tappo inferiore di una colonna di desalting da 0,5 millilitri, allentare il tappo superiore e posizionare la colonna di dissalarizzazione in un tubo di centrifuga da 1,7 millilitri.Trasferire la nuova colonna in un nuovo tubo di microcentrifugo e aggiungere 80 microlitri di una soluzione anticorpale da 3,5 milligrammi per millilitro nella parte superiore della colonna. Allineare la colonna all'orientamento originale e centrifugare la colonna. Quindi scartare la colonna di dissalezione e mescolare accuratamente il campione concentrato.Diluire il campione a una concentrazione di due milligrammi per millilitro in 25 microlitri di acqua ultrapura in un unico pozzo di una piastra da 96 pozzetti e aggiungere cinque microlitri di tampone di etichettatura e cinque microlitri di reagente di etichettatura al pozzo. Dopo un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente protetta dalla luce, mescolare 60 microlitri di acqua di grado reagente con il campione e coprire la piastra con una guarnizione della piastra per la centrifugazione. Per preparare il chip variante di carica, rimuovere la soluzione di stoccaggio e lavare i pozzi uno, tre, quattro, sette, otto e 10 con acqua.Sostituire l'acqua con tampone di funzionamento pH 7.2 e aggiungere 750 microlitri di tampone di corsa al tubo tampone. Premere Scarica piastra sull'interfaccia utente dello strumento e rimuovere la guarnizione dalla piastra da 96 pozzi. Inserire la piastra e il tubo tampone nei punti indicati sul vassoio del campione GX2 e premere Piastra di carico.Posizionare il chip nella camera del truciolo, chiudere il coperchio alla camera del chip, selezionare il saggio della variante di carica proteica HT quando richiesto e fare clic su Esegui. La purificazione del campione di coltura cellulare raccolta dal bioreattore automatizzato su microscala mediante cromatografia liquida a proteine veloci consente la caratterizzazione degli attributi critici di qualità delle proteine purificate con vari metodi analitici a valle, come dimostrato. I dati n-glicani provenienti da anticorpi monoclonali prodotti dall'ovaio del criceto cinese elaborati dalla spettrometria di massa dovrebbero apparire simili a questi cromatogrammi rappresentativi.La cromatografia ad esclusione di dimensioni scattering di luce ad angolo multiplo può essere utilizzata per valutare il profilo di aggregazione e il peso molecolare dell'anticorpo. La piccola quantità di campione e l'importanza dell'aggregazione sono attributi di qualità critici per rendere questa tecnica uno strumento analitico complementare altamente prezioso al sistema di microbioreattori automatizzati. Il risultato dell'elettroforesi a zona micro capillare è un elettroferogramma e può essere utilizzato per mostrare il profilo della variante di carica per un anticorpo monoclonale, una firma unica per la proteina studiata che è altamente sensibile al pH operativo.Il consumo di amminoacidi può anche essere monitorato per determinare se l'esaurimento causa cambiamenti negli attributi critici di qualità dell'anticorpo. È importante garantire una corretta ed efficiente purificazione del prodotto fabbricato, poiché le fasi analitiche possono essere eseguite solo con una proteina adeguatamente purificata. Il prodotto può anche essere sottoposto a mappatura peptidica e test di stabilità.Ma una volta che la proteina è stata utilizzata per un metodo di caratterizzazione, in genere non può essere utilizzata per un altro. Queste tecniche consentono l'analisi di prodotti prodotti da piattaforme di screening del bioprocesso di piccolo volume e ad alta produttività per comprendere l'influenza dei parametri di biolavorazione sulla qualità del prodotto. Alcune di queste tecniche utilizzano acido perclorico concentrato, acido formico, N-dimetilformamide, che sono tutti pericolosi e devono essere maneggiati con cura mentre si indossano i dispositivi di protezione adeguati.

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Questo video mostra una tecnica per purificare gli anticorpi monoclonali dal surnatante di coltura ottenuto da una coltura cellulare produttrice di anticorpi. Il processo prevede l'utilizzo di una matrice di perle di agarosio reticolate con proteina A coniugata, che immobilizza gli anticorpi nel surnatante sulle perle, consentendo un'efficace separazione dai contaminanti. Applicando un tampone di eluizione a basso pH, l'interazione proteina A-anticorpo viene allentata, facilitando la raccolta...

Una tecnica di cromatografia di affinità per la purificazione di anticorpi monoclonali

Viene presentato un protocollo ottimizzato per la generazione di anticorpi monoclonali basati sulla tecnologia degli ibridomi. I topi sono stati immunizzati con un immunoconiugato. Le cellule della milza sono state fuse mediante PEG e un impulso elettrico con cellule di mieloma immortale. Le cellule di ibridoma produttrici di anticorpi sono state selezionate mediante HAT e screening ELISA antigene-specifico.

Generazione di Murine anticorpi monoclonali da ibridomi Tecnologia

Un protocollo dettagliato per il funzionamento simultaneo di 48 colture parallele sotto varie condizioni in un sistema di microbioreactor è presentato. Processo di coltura cellulare, raccolta e analisi di titolo dell'anticorpo successivi sono descritti.

Uso di High-Throughput Microbioreactor sistema automatizzato per la produzione del modello IgG1 in cellule CHO

Qui, presentiamo una procedura dettagliata per eseguire un progetto di esperimento in un micro-bioreattore automatizzato seguito dal raccolto cellulare e dalla quantificazione delle proteine utilizzando una colonna di proteine A.

Ottimizzazione dei processi mediante microreattori automatizzati ad alta velocità effettiva nella coltivazione delle cellule ovaio dell'ammasso cinese

Il modello di glicosilazione di un anticorpo determina le sue prestazioni cliniche, quindi gli sforzi industriali e accademici per controllare la glicosilazione persistono. Poiché le tipiche campagne di glicoingegneria richiedono molto tempo e lavoro, la generazione di un protocollo rapido per caratterizzare l'impatto dei geni di glicosilazione utilizzando il silenziamento transitorio si rivelerebbe utile.

Glicoingegneria anticorpale rapida nelle cellule ovariche di criceto cinese

Questo protocollo descrive come utilizzare il sistema omico di coltura a singola cellula microlitri-goccioline (cellula MISS) per eseguire l'isolamento, la coltivazione e il prelievo monoclonale microbico. La cella MISS raggiunge un flusso di lavoro integrato basato sulla tecnologia microfluidica delle gocce, che offre un'eccellente monodispersione delle gocce, un'elevata coltivazione parallela e un rilevamento della biomassa ad alto rendimento.

Coltivazione e prelievo monoclonale microbico automatizzato e ad alto rendimento con il sistema omico di coltura a microlitri di goccioline a cellula singola

Impara la purificazione e l'analisi di anticorpi monoclonali da fluidi di coltura cellulare utilizzando microbioreattori automatizzati. Questo metodo consente di determinare gli attributi critici di qualità con volumi di campione minimi.

Purificazione e analisi di un anticorpo monoclonale da cellule ovaio Cesster cinese utilizzando un sistema microbioreante automatizzato (Video) | JoVE Journal

Purificazione e analisi di un anticorpo monoclonale da cellule ovaio Cesster cinese utilizzando un sistema microbioreante automatizzato

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